Name: detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host
Uploaded: 2021-09-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (31772124 og 31972239) og Fujian Agriculture and Forestry University (Grant KSYLX014).

De ikke-viruliferous voksne løvhopper blev formeret i Vector-borne Virus Research Center i Fujian Agriculture and Forestry University, Kina.
1. Nonviruliferous insektopdræt
<ol><li>Baglæns de voksne på risplanter i et terningbur, der er 40 cm x 35 cm x 20 cm (længde x bredde x højde). Hold den ene side af buret dækket af et insektsikkert net til ventilation.<ol><li>Opbevar burene med løvhopper i en inkubator, der indeholder en indbygget fugtighedsregulator ved 26 °C med en relativ l...

<ol>
	<li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Cranston, P. S., Gullan, P. J., Resh, V. H., Carde, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+of+insects.">Phylogeny of insects.</a> Encyclopedia of Insects. , (2003).</li><li>Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts.">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laccase-type+phenoloxidase+in+salivary+glands+and+watery+saliva+of+the+green+rice+leafhopper,+Nephotettix+cincticeps.">Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps.</a> Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).</li><li>Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+pectinesterase+and+polygalacturonase+from+salivary+secretions+of+living+greenbugs,+schizaphis+graminum+(Homoptera:+aphididae).">Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae).</a> Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).</li><li>Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+aspects+of+the+chemical+relation+between+the+rose+aphid+and+rose+buds.">Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).</li><li>Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+oxidising+enzymes+in+the+grain+aphid's+saliva.">Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).</li><li>Miles, P. W., Peng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+salivary+physiology+of+plant+bugs:+detoxification+of+phytochemicals+by+the+salivary+peroxidase+of+aphids.">Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids.</a> Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).</li><li>Will, T., van Bel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+interactions+between+aphids+and+plants.">Physical and chemical interactions between aphids and plants.</a> Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).</li><li>Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+loss+in+a+greenbug-susceptible+sorghum+due+to+pectinases+and+pectin+fragments.">Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments.</a> Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).</li><li>Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+salivary+components+as+a+possible+reason+for+differences+in+the+responses+of+alfalfa+to+the+spotted+alfalfa+aphid+and+pea+aphid.">Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).</li><li>Funk, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase+activity+in+whitefly+salivary+glands+and+saliva.">Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva.</a> Archives of Insect Biochemistry &amp; Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant-insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant-insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-layered+mechanistic+modelling+approach+to+understand+how+effector+genes+extend+beyond+phytoplasma+to+modulate+plant+hosts,+insect+vectors+and+the+environment.">A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).</li><li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+transcriptomic/proteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species.">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. , (2018).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant--insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant--insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mosquito+salivary+protein+promotes+flavivirus+transmission+by+activation+of+autophagy.">A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy.</a> Nature Communications. 11 (1), 260 (2020).</li><li>Sri-In, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+salivary+protein+of+Aedes+aegypti+promotes+dengue-2+virus+replication+and+transmission.">A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181 (2019).</li><li>Conway, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+D7+saliva+protein+inhibits+dengue+virus+infection.">Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941 (2016).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whitefly+effector+Bsp9+targets+host+immunity+regulator+WRKY33+to+promote+performance.">A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313 (2019).</li><li>Omura, T., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+outer+capsid+proteins+in+transmission+of+phytoreovirus+by+insect+vectors.">Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors.</a> Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).</li><li>Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+release+threshold+in+the+salivary+gland+of+leafhopper+vector+mediates+the+intermittent+transmission+of+rice+dwarf+virus.">Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 639445 (2021).</li><li>Fukushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+studies+on+the+dwarf+disease+of+rice+plant.">Further studies on the dwarf disease of rice plant.</a> Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).</li><li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+the+internal+components+of+rice+dwarf+virus.">The functional organization of the internal components of rice dwarf virus.</a> Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).</li><li>Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pns12+protein+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+formation+of+viroplasms+and+nucleation+of+viral-assembly+complexes.">Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes.</a> Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns4+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+viral+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector.</a> Virology Journal. 12, 211 (2015).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns12+of+rice+dwarf+virus+is+a+principal+regulator+for+viral+replication+and+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector.</a> Virus Research. 210, 54-61 (2015).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubules+of+plant+reoviruses+exploit+tropomodulin+to+regulate+actin-based+tubule+motility+in+insect+vector.">Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector.</a> Scientific Reports. 7, 38563 (2017).</li><li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Rice+dwarf+virus+among+cells+of+its+insect+vector+exploits+virus-induced+tubular+structures.">The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures.</a> Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).</li><li>Mao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+bacterial+symbiont-mediated+vitellogenin+uptake+into+oocytes+to+support+egg+development.">Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development.</a> mBio. 11 (6), 01142 (2020).</li><li>Tufail, M., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins.">Molecular characteristics of insect vitellogenins.</a> Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).</li><li>Sappington, T. W., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins+and+vitellogenin+receptors.">Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).</li><li>Ji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitellogenin+from+planthopper+oral+secretion+acts+as+a+novel+effector+to+impair+plant+defenses.">Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses.</a> New Phytologist. , (2021).</li></ol>

Spyttet, der udskilles direkte af spytkirtlerne hos de gennemtrængende sugende insekter, spiller en afgørende rolle, fordi det præfordøjer og afgifter værtsvævene og vektorernes biologiske faktorer på tværs af kongerigeti værterne 1,3,4. De biologiske faktorer på tværs af kongeriget, herunder elikatorer, effektorer og lille RNA, er kritiske for insekt-værtskommunikation14,15,16<sup ...

Vektor-værtstransmissionstilstanden for arbovirus, et grundlæggende problem, ligger ved grænsen for biologisk videnskab. Mange plantevirus af landbrugsmæssig betydning overføres vandret af insektvektorer1. Mere end halvdelen af plantevira vektoriseres af hemipteranske insekter, herunder bladlus, hvidfluer, løvhopper, plantehoppere og thrips. Disse insekter har forskellige egenskaber, der gør det muligt for dem effektivt at overføre plantevirus1. De besidder piercing-sugende munddele og lever af saften fra floem og xylem og udskiller deres spyt 1,2,3,4. Med udvikling og forbedring af teknikker bliver identifikation og funktionelle analyser af spytkomponenter et nyt fokus for intensiv forskning. De kendte spytproteiner i spyt omfatter adskillige enzymer, såsom pectinesterase, cellulase, peroxidase, alkalisk fosfatase, polyphenoloxidase og sucrase, blandt andre 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Proteinerne i spyt inkluderer også elicatorer, der udløser værtsforsvarsresponsen og derved ændrer insekternes ydeevne, og effektorer, der undertrykker værtsforsvaret, hvilket forbedrer insektfitness og komponenter, der inducerer værtspatologiske reaktioner14,15,16,17. Derfor er spytproteiner vigtige materialer til kommunikation mellem insekter og værter. Under overførslen af vira indeholder spyt, der udskilles af spytkirtlerne af piercing-sugende viruliferous insekter, også virale proteiner. Virale komponenter udnytter spytstrømmen til at frigive dem fra insektet til planteværten. Derfor bygger insektspyt bro over virus-vektor-vært tritrofisk interaktion. Undersøgelse af den biologiske funktion af spytproteiner udskilt af viruliferous insekter hjælper med at forstå forholdet mellem virus-vektor-vært.
For dyrevirus er det rapporteret, at myggenes spyt medierer transmissionen og patogeniciteten af West Nile-virus (WNV) og Dengue-virus (DENV). Spytproteinet AaSG34 fremmer denguefeber-2-virusreplikation og transmission, mens spytproteinet AaVA-1 fremmer transmission af DENV og Zika-virus (ZIKV) ved at aktivere autofagi18,19. Myggenes spytprotein D7 kan hæmme DENV-infektion in vitro og in vivo via direkte interaktion med DENV-virionerne og det rekombinante DENV-kuvertprotein20. I plantevira inducerer begomovirus tomatgul bladkrøllevirus (TYLCV) whitefly spytproteinet Bsp9, som undertrykker den WRKY33-medierede immunitet af plantevært, for at øge præferencen og ydeevnen af hvide fluer, hvilket i sidste ende øger overførslen af vira21. Fordi undersøgelser af den rolle, som insektspytproteiner spiller i planteværter, har haltet bagefter dyreværternes, er der et presserende behov for et stabilt og pålideligt system til at detektere spytproteinerne i planteværter.
Plantevirus kendt som risdværgvirus (RDV) overføres af løvhoppen Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) med høj effektivitet og på en vedvarende formerende måde22,23. RDV blev først rapporteret at blive overført af en insektvektor og forårsager en alvorlig sygdom af ris i Asien24,25. Virionen er icosahedral og dobbeltlags sfærisk, og det ydre lag indeholder P8 ydre capsidprotein22. Den cirkulerende transmissionsperiode for RDV i N. cincticeps er 14 dage 26,27,28,29,30. Når RDV ankommer til spytkirtler, frigives virioner i spytlagrede hulrum i spytkirtlerne via en exocytoselignende mekanisme23. Vitellogenin (Vg) er æggeblommeproteinforløberen, der er afgørende for oocytudvikling hos kvindelige insekter31,32,33. De fleste insektarter har mindst et Vg-transkript på 6-7 kb, som koder for et forløberprotein på ca. 220 kDa. Proteinforløberne for Vg kan normalt spaltes i store (140 til 190 kDa) og små (<50 kDa) fragmenter, før de kommer ind i æggestokken18,19. Tidligere proteomisk analyse afslørede tilstedeværelsen af peptiderne afledt af Vg i den udskillede spyt fra løvhoppen Recilia dorsalis, selvom deres funktion er ukendt (upublicerede data). Det er for nylig rapporteret, at Vg, som udskilles oralt fra planthoppers, fungerer som en effektor til at skade planternes forsvar34. Det vides ikke, om Vg af N. cincticeps også kunne frigives til planteværten med spytstrøm og derefter kunne spille en rolle i planten for at forstyrre planteforsvaret. For at adressere, om N. cincticeps udnytter spytproteiner, såsom Vg, til at hæmme eller aktivere planteforsvar, er det første skridt at identificere proteiner, der frigives til planten under fodring. Forståelse af metoden til at identificere spytproteinerne til stede i planten er potentielt afgørende for at forklare spytproteiners funktion og interaktionerne mellem Hemiptera og planter.
I protokollen, der præsenteres her, anvendes N. cincticeps som et eksempel til at tilvejebringe en metode til at undersøge tilstedeværelsen af spytproteiner i planteværten indført gennem insektfodring. Protokollen beskriver primært indsamling og påvisning af spytproteiner og er nyttig til yderligere undersøgelse af de fleste hemipteraner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers and Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer</td>
			<td>Composition</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;5&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>15.1 g Tris base 
			94 g glycine 
			&#160;5 g SDS in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>200 mL of 5&#215;Tris-glycine buffer 
			800 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution, for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;Tris-buffered saline (TBS) buffer</td>
			<td>80 g NaCl 
			30 g Tris base 
			2 g KCl 
			in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS with Tween 20 (TBST) solution</td>
			<td>100 mL 10&#215;TBS solution 
			3 mL Tween 20 
			900 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#215; protein sample buffer</td>
			<td>8 g SDS 
			4 mL &#223;-mercaptoethanol 
			0.02 g bromophenol blue 
			40 mL glycerol 
			in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td></td>
			<td>For protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td>800 mL Tris-glycine buffer 
			200 mL methanol</td>
			<td></td>
			<td>For protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>PRX-1200B</td>
			<td>For rearing leafhoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis</td>
			<td>Tanon Science &#38; Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Tanon EP300</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic transfer core module</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703935</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-pass tissue grinding instrument</td>
			<td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.</td>
			<td>JXFSIPRP-24</td>
			<td>For grinding plant tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini wet heat transfer trough</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein color instrument</td>
			<td>GE Healthcare bio-sciences AB</td>
			<td>Amersham lmager 600</td>
			<td>For detecting proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical plate electrophoresis tank</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658001</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.</td>
			<td>XMTD-8222</td>
			<td>For boil the protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host

Insektvektorer overfører vandret mange plantevirus af landbrugsmæssig betydning. Mere end halvdelen af plantevira overføres af hemipteran insekter, der har piercing-sugende munddele. Under viral transmission bygger insektspyt bro over virusvektorværten, fordi spytvektorerne vira og insektproteinerne udløser eller undertrykker planternes immunrespons fra insekter til planteværter. Identifikation og funktionelle analyser af spytproteiner bliver et nyt fokusområde inden for forskningsfeltet arbovirus-værtsinteraktioner. Denne protokol giver et system til at detektere proteiner i spyt af løvhopper ved hjælp af planteværten. Løvhoppevektoren Nephotettix cincticeps inficeret med risdværgvirus (RDV) tjener som et eksempel. Vitellogenin og det store ydre capsidprotein P8 af RDV vektoriseret af spyt fra N. cincticeps kan detekteres samtidigt i risplanten, som N. cincticeps lever af . Denne metode kan anvendes til test af spytproteiner, der forbigående tilbageholdes i planteværten efter insektfodring. Det antages, at dette detektionssystem vil gavne undersøgelsen af hemipteran-virus-plante eller hemipteran-planteinteraktioner.

Figur 1 illustrerer alle trinene i denne protokol: insektopdræt, virusopkøb, indsamling af spytproteiner via risfodring og den vestlige blot. Western blots-resultaterne viste, at specifikke og forventede bånd på ca. 220 kDa blev observeret i prøverne af fodring af ris og spytkirtler af insekter på membranen inkuberet med antistoffer mod Vg. I modsætning hertil blev der ikke observeret noget bånd i den ikke-fodrende risprøve. Resultatet i <strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host at JoVE.com

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Denne protokol demonstrerer, hvordan man bruger planteværten til at detektere spytproteiner fra løvhopper og plante virale proteiner frigivet af løvhoppevektorer.

Påvisning af virus- og spytproteiner fra en løvhoppevektor i planteværten

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Denne protokol giver en teknik til påvisning af spytproteiner fra løvhoppere og planteværter for yderligere at undersøge funktionen af disse proteiner i planteværterne. Denne teknik er nem at udføre, og systemet er stabilt og replikerbart. Denne metode kan også være nyttig til påvisning af spytproteiner fra andre hemiptera og planteværter.Til at begynde med opdræt de voksne bladhopper på risplanter i et 40 x 35 x 20 centimeter terningbur. Hold den ene side af buret dækket af et insektsikkert net til ventilation. Placer burene med løvhopperne i en inkubator, der indeholder en indbygget fugtighedsregulator ved 26 grader Celsius med en relativ luftfugtighed på 60 til 75% under en fotoperiode på 16 timer lys og otte timer mørk.Brug en gang om ugen en aspirator til forsigtigt at overføre alle voksne fra deres bur til et nyt bur, der indeholder friske risplanter. Lad mere end 200 voksne parre sig og lægge æg i risene. Behold de gamle risplanter, så nymferne kan dukke op, og opdræt disse nye ikke-viruliferous nymfer til det andet stjernestadium.Brug aspiratoren til forsigtigt at overføre de anden instar ikke-viruliferous nymfer til et glaskulturrør i en til to timer for sult. Slip derefter nymferne i et bur, der indeholder en risdværgvirusinficeret risplante dyrket i en gryde, og lad nymferne fodre på den inficerede risplante i to dage. Efter to dage skal du forsigtigt overføre disse nymfer til et nyt bur, der indeholder friske virusfrie risplanter, og lad nymferne fodre på de virusfrie risplanter i 12 dage for at fuldføre den cirkulerende transmissionsperiode for risdværgviruset.For at opsamle spytproteinerne skal du forberede fem små rørlignende fodringsbure dækket med insektsikkert net i den ene ende. Efter at have begrænset 15 til 20 løvhopper i hvert foderbur, skal du dække den anden ende af buret med en tynd skummåtte. Fastgør en risplante mellem enden af buret og en skummåtte med tape, og sørg for, at bladhopperne i foderburet kan fodre på risplanterne, der udsættes for burets indre.Dyp frøplanterødderne i vand, så risplanten forbliver i live, og lad løvhopperne fodre på dem i to dage. Efter to dage skal du fjerne bladhopperne fra deres foderbure og samle risplanterne, som løvhopperne fodrede på. Skær frøplanterne uden for buret og genvind plantens fodringsområder.Forbered 1x Tris-glycinbuffer ved at fortynde 200 ml af den tilberedte 5x buffer med 800 ml sterilt vand. Forbered derefter 10x TBS buffer og autoklave opløsningen ved 121 grader Celsius i 15 minutter. Forbered derefter 4x proteinprøvebufferen.Forbered derefter overførselsbufferen ved at blande 800 ml Tris-glycinbufferen med 200 ml methanol. Til sidst fremstilles TBST-opløsningen ved at tilsætte 100 ml 10x TBS og tre ml Tween 20 til 900 ml sterilt vand. For at detektere spyt og virale proteiner skal du male 0,1 gram risprøver med flydende nitrogen, indtil vævet bliver et pulver.Derefter tilsættes 200 mikroliter af 4x proteinprøvebufferen til prøven og koges i 10 minutter. Prøverne centrifugeres og overføres til et nyt hætteglas. Læg 10 mikroliter af prøven på en SDS-PAGE gel og kør den i Tris-glycinbuffer ved 150 volt i 45 til 60 minutter.Mens gelen kører, anbringes en 0,45 mikron nitrocellulosemembran og andre sandwichforsyninger i overførselsbufferen i 30 minutter. Efter kørslen sandwiches gelen og overføres i 90 til 120 minutter ved 100 volt i overførselsbufferen. Når blottningen er afsluttet, anbringes membranen i en 7% fedtfri tørmælksblokerende opløsning i TBST og inkuberes i 20 minutter.Derefter tilsættes et antistof mod risdværgvirus P8 eller vitellogenin og inkuberer membranen i to timer eller natten over. Efter inkubationen vaskes membranen med TBST tre gange med en fem minutters inkubation mellem hver vask. Derefter tilsættes gedantikanin IgG som et sekundært antistof og inkuberer membranen i 60 til 90 minutter.Brug ECL Western-sættet til kemiluminescensdetektion i blandede detektionsreagenser et og to i sættet i et forhold på en-til-en. Membranen anbringes på det blandede reagens og inkuberes blottet i fem minutter. Tøm det overskydende reagens og tag et kemiluminescerende og kolorimetrisk billede af membranen.Kombiner billederne for at se sidstnævnte med proteinbånd. Western blot-analyse til påvisning af vitellogenin viste specifikke og forventede bånd på ca. 220 kilodalton ved fodring af risplanter og spytkirtler af insekterne. I modsætning hertil blev der ikke observeret noget bånd i de ikke-fodrende planter, hvilket indikerer, at vitellogenin blev frigivet i planteværten som et spytprotein.Western blot-analyse til påvisning af risdværgvirus P8-proteinet viste et specifikt og forventet bånd på ca. 46 kilodalton i foderplanter og viruliferous insektlegemer. I modsætning hertil blev der ikke observeret noget bånd i ikke-fodringsplanter og ikke-viruliferous løvhoppelegemer, hvilket beviste, at de virale proteiner også kunne påvises i fodringsplanterne. Den virale belastning i løvhopperne, detektionstimingen og replikaterne skal tages i betragtning, mens du udfører denne protokol.Denne metode kan også anvendes til at studere myg, der overfører arbovirus.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic Biotest som et screeningsværktøj for værtsplante Flygtige

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Glycan profilering af plantecellevægge Polymerer med Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex Production Platform på EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Måling af Osmotisk Vand permeabilitetskoefficienten (P<sub&gt; F</sub&gt;) Af sfæriske celler: Isolerede planteprotoplaster som et eksempel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

High-throughput CRISPR Vector Konstruktion og karakterisering af DNA Ændringer af Generation of Tomato Behårede Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fedt kroppen organsystem kultur i Aedes Aegypti, en vektor af Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...