Name: detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host
Uploaded: 2021-09-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (31772124 en 31972239) en Fujian Agriculture and Forestry University (Grant KSYLX014).

De niet-virulifere volwassen leafhoppers werden verspreid in het Vector-borne Virus Research Center in Fujian Agriculture and Forestry University, China.
1. Niet-virulifere insectenkweek
<ol><li>Voed de volwassenen op rijstzaailingen op in een kubuskooi van 40 cm x 35 cm x 20 cm (lengte x breedte x hoogte). Houd één kant van de kooi bedekt met een insectenbestendig net voor ventilatie.<ol><li>Bewaar de kooien met leafhoppers in een incubator met een ingebouwde vochtigheidsregelaar op 26 °...

<ol>
	<li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Cranston, P. S., Gullan, P. J., Resh, V. H., Carde, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+of+insects.">Phylogeny of insects.</a> Encyclopedia of Insects. , (2003).</li><li>Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts.">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laccase-type+phenoloxidase+in+salivary+glands+and+watery+saliva+of+the+green+rice+leafhopper,+Nephotettix+cincticeps.">Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps.</a> Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).</li><li>Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+pectinesterase+and+polygalacturonase+from+salivary+secretions+of+living+greenbugs,+schizaphis+graminum+(Homoptera:+aphididae).">Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae).</a> Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).</li><li>Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+aspects+of+the+chemical+relation+between+the+rose+aphid+and+rose+buds.">Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).</li><li>Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+oxidising+enzymes+in+the+grain+aphid's+saliva.">Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).</li><li>Miles, P. W., Peng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+salivary+physiology+of+plant+bugs:+detoxification+of+phytochemicals+by+the+salivary+peroxidase+of+aphids.">Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids.</a> Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).</li><li>Will, T., van Bel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+interactions+between+aphids+and+plants.">Physical and chemical interactions between aphids and plants.</a> Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).</li><li>Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+loss+in+a+greenbug-susceptible+sorghum+due+to+pectinases+and+pectin+fragments.">Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments.</a> Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).</li><li>Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+salivary+components+as+a+possible+reason+for+differences+in+the+responses+of+alfalfa+to+the+spotted+alfalfa+aphid+and+pea+aphid.">Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).</li><li>Funk, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase+activity+in+whitefly+salivary+glands+and+saliva.">Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva.</a> Archives of Insect Biochemistry &amp; Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant-insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant-insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-layered+mechanistic+modelling+approach+to+understand+how+effector+genes+extend+beyond+phytoplasma+to+modulate+plant+hosts,+insect+vectors+and+the+environment.">A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).</li><li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+transcriptomic/proteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species.">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. , (2018).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant--insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant--insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mosquito+salivary+protein+promotes+flavivirus+transmission+by+activation+of+autophagy.">A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy.</a> Nature Communications. 11 (1), 260 (2020).</li><li>Sri-In, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+salivary+protein+of+Aedes+aegypti+promotes+dengue-2+virus+replication+and+transmission.">A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181 (2019).</li><li>Conway, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+D7+saliva+protein+inhibits+dengue+virus+infection.">Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941 (2016).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whitefly+effector+Bsp9+targets+host+immunity+regulator+WRKY33+to+promote+performance.">A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313 (2019).</li><li>Omura, T., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+outer+capsid+proteins+in+transmission+of+phytoreovirus+by+insect+vectors.">Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors.</a> Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).</li><li>Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+release+threshold+in+the+salivary+gland+of+leafhopper+vector+mediates+the+intermittent+transmission+of+rice+dwarf+virus.">Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 639445 (2021).</li><li>Fukushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+studies+on+the+dwarf+disease+of+rice+plant.">Further studies on the dwarf disease of rice plant.</a> Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).</li><li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+the+internal+components+of+rice+dwarf+virus.">The functional organization of the internal components of rice dwarf virus.</a> Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).</li><li>Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pns12+protein+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+formation+of+viroplasms+and+nucleation+of+viral-assembly+complexes.">Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes.</a> Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns4+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+viral+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector.</a> Virology Journal. 12, 211 (2015).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns12+of+rice+dwarf+virus+is+a+principal+regulator+for+viral+replication+and+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector.</a> Virus Research. 210, 54-61 (2015).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubules+of+plant+reoviruses+exploit+tropomodulin+to+regulate+actin-based+tubule+motility+in+insect+vector.">Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector.</a> Scientific Reports. 7, 38563 (2017).</li><li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Rice+dwarf+virus+among+cells+of+its+insect+vector+exploits+virus-induced+tubular+structures.">The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures.</a> Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).</li><li>Mao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+bacterial+symbiont-mediated+vitellogenin+uptake+into+oocytes+to+support+egg+development.">Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development.</a> mBio. 11 (6), 01142 (2020).</li><li>Tufail, M., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins.">Molecular characteristics of insect vitellogenins.</a> Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).</li><li>Sappington, T. W., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins+and+vitellogenin+receptors.">Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).</li><li>Ji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitellogenin+from+planthopper+oral+secretion+acts+as+a+novel+effector+to+impair+plant+defenses.">Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses.</a> New Phytologist. , (2021).</li></ol>

Het speeksel dat direct wordt uitgescheiden door de speekselklieren van de piercing-zuigende insecten speelt een cruciale rol omdat het de weefsels van de gastheer en de cross-kingdom biologische factoren van de gastheer voorverteert en ontgift in de gastheren 1,3,4. De cross-kingdom biologische factoren, waaronder elicitors, effectoren en klein RNA, zijn van cruciaal belang voor de communicatie tussen insecten en gastheer<sup c...

De vector-host transmissiemodus van arbovirussen, een fundamenteel probleem, bevindt zich op de grens van de biologische wetenschap. Veel plantenvirussen van agrarisch belang worden horizontaal overgedragen door insectenvectoren1. Meer dan de helft van de plantenvirussen wordt overgebracht door hemipteran-insecten, waaronder bladluizen, witte vliegen, leafhoppers, planthoppers en trips. Deze insecten hebben verschillende kenmerken die hen in staat stellen om plantenvirussen efficiënt over te brengen1. Ze bezitten piercing-zuigende monddelen en voeden zich met het sap van floëem en xyleem, en scheiden hun speekselaf 1,2,3,4. Met de ontwikkeling en verbetering van technieken worden de identificatie en functionele analyses van speekselcomponenten een nieuwe focus van intensief onderzoek. De bekende speekseleiwitten in speeksel omvatten tal van enzymen, zoals pectinesterase, cellulase, peroxidase, alkalische fosfatase, polyfenoloxidase en sucrase, onder andere 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . De eiwitten in speeksel omvatten ook elicitoren die de afweerreactie van de gastheer activeren, waardoor de prestaties van insecten veranderen, en effectoren die de afweer van de gastheer onderdrukken, wat de fitheid van insecten verbetert en componenten die pathologische reacties van de gastheer induceren14,15,16,17. Daarom zijn speekseleiwitten vitale materialen voor communicatie tussen insecten en gastheren. Tijdens de overdracht van virussen bevat het speeksel dat wordt afgescheiden door de speekselklieren van piercing-zuigende virulifere insecten ook virale eiwitten. Virale componenten gebruiken de stroom van speeksel om ze vrij te geven van het insect naar de gastheer van de plant. Daarom overbrugt het insectenspeeksel de virus-vector-gastheer tritrofe interactie. Het onderzoeken van de biologische functie van speekseleiwitten die worden uitgescheiden door virulifere insecten helpt om de relatie van virus-vector-gastheer te begrijpen.
Voor dierlijke virussen wordt gemeld dat het speeksel van muggen de overdracht en pathogeniciteit van westnijlvirus (WNV) en denguevirus (DENV) bemiddelt. Het speekseleiwit AaSG34 bevordert de replicatie en overdracht van het dengue-2-virus, terwijl het speekseleiwit AaVA-1 de overdracht van DENV- en Zika-virus (ZIKV) bevordert door autofagie18,19 te activeren. Het speekseleiwit D7 van muggen kan DENV-infectie in vitro en in vivo remmen via directe interactie met de DENV-virionen en recombinant DENV-enveloppe-eiwit20. In plantenvirussen induceert het begomovirus tomaat geelbladkrulvirus (TYLCV) het wittevliegspeekseleiwit Bsp9, dat de WRKY33-gemedieerde immuniteit van de plantengastheer onderdrukt, om de voorkeur en prestaties van witte vliegen te verhogen, waardoor uiteindelijk de overdracht van virussen21 toeneemt. Omdat studies naar de rol die speekseleiwitten van insecten spelen in plantengastheren zijn achtergebleven bij die van dierlijke gastheren, is een stabiel en betrouwbaar systeem om de speekseleiwitten in plantengastheren te detecteren dringend nodig.
Het plantenvirus dat bekend staat als rijstdwergvirus (RDV) wordt overgedragen door de leafhopper Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) met een hoge efficiëntie en op een aanhoudend vermeerderende manier22,23. RDV werd voor het eerst gemeld als overgedragen door een insectenvector en veroorzaakt een ernstige ziekte van rijst in Azië24,25. Het virion is icosaëdrisch en dubbellaags bolvormig en de buitenste laag bevat het P8 buitenste capsid-eiwit22. De circulatieve transmissieperiode van RDV in N. cincticeps is 14 dagen 26,27,28,29,30. Wanneer de RDV bij speekselklieren aankomt, worden virionen vrijgegeven in speeksel-opgeslagen holtes in de speekselklieren via een exocytose-achtig mechanisme23. De vitellogenine (Vg) is de voorloper van het dooiereiwit die essentieel is voor de ontwikkeling van eicellen bij vrouwelijke insecten31,32,33. De meeste insectensoorten hebben ten minste één Vg-transcript van 6-7 kb, dat codeert voor een voorlopereiwit van ongeveer 220 kDa. De eiwitvoorlopers van Vg kunnen meestal worden gesplitst in grote (140 tot 190 kDa) en kleine (<50 kDa) fragmenten voordat ze de eierstok18,19 binnendringen. Eerdere proteomische analyse onthulde de aanwezigheid van de peptiden afgeleid van Vg in het uitgescheiden speeksel van de leafhopper Recilia dorsalis, hoewel hun functie onbekend is (ongepubliceerde gegevens). Onlangs is gemeld dat Vg, dat oraal wordt uitgescheiden door planthoppers, functioneert als een effector om de afweer van planten te beschadigen34. Het is onbekend of de Vg van N. cincticeps ook met speekselstroom aan de plantengastheer kan worden vrijgegeven en vervolgens een rol in de plant kan spelen om de afweer van de plant te verstoren. Om aan te pakken of N. cincticeps speekseleiwitten, zoals Vg, gebruikt om de afweer van planten te remmen of te activeren, is de eerste stap het identificeren van eiwitten die tijdens het voeden aan de plant worden vrijgegeven. Het begrijpen van de methode om de speekseleiwitten in de plant te identificeren is mogelijk essentieel om de functie van speekseleiwitten en de interacties tussen Hemiptera en planten te verklaren.
In het hier gepresenteerde protocol wordt N. cincticeps als voorbeeld gebruikt om een methode te bieden om de aanwezigheid van speekseleiwitten in de plantengastheer te onderzoeken die door insectenvoeding worden geïntroduceerd. Het protocol beschrijft voornamelijk de verzameling en detectie van speekseleiwitten en is nuttig voor verder onderzoek op de meeste hemipterans.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers and Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer</td>
			<td>Composition</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;5&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>15.1 g Tris base 
			94 g glycine 
			&#160;5 g SDS in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>200 mL of 5&#215;Tris-glycine buffer 
			800 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution, for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;Tris-buffered saline (TBS) buffer</td>
			<td>80 g NaCl 
			30 g Tris base 
			2 g KCl 
			in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS with Tween 20 (TBST) solution</td>
			<td>100 mL 10&#215;TBS solution 
			3 mL Tween 20 
			900 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#215; protein sample buffer</td>
			<td>8 g SDS 
			4 mL &#223;-mercaptoethanol 
			0.02 g bromophenol blue 
			40 mL glycerol 
			in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td></td>
			<td>For protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td>800 mL Tris-glycine buffer 
			200 mL methanol</td>
			<td></td>
			<td>For protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>PRX-1200B</td>
			<td>For rearing leafhoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis</td>
			<td>Tanon Science &#38; Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Tanon EP300</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic transfer core module</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703935</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-pass tissue grinding instrument</td>
			<td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.</td>
			<td>JXFSIPRP-24</td>
			<td>For grinding plant tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini wet heat transfer trough</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein color instrument</td>
			<td>GE Healthcare bio-sciences AB</td>
			<td>Amersham lmager 600</td>
			<td>For detecting proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical plate electrophoresis tank</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658001</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.</td>
			<td>XMTD-8222</td>
			<td>For boil the protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host

Insectenvectoren brengen horizontaal veel plantenvirussen van agrarisch belang over. Meer dan de helft van de plantenvirussen wordt overgedragen door hemipteraninsecten die piercing-zuigende monddelen hebben. Tijdens virale overdracht overbrugt het insectenspeeksel de virus-vector-gastheer omdat de speekselvectoren, virussen en de insecteneiwitten de immuunrespons van planten van insecten in plantengastheren activeren of onderdrukken. De identificatie en functionele analyses van speekseleiwitten worden een nieuw aandachtsgebied in het onderzoeksveld van arbovirus-gastheerinteracties. Dit protocol biedt een systeem om eiwitten in het speeksel van leafhoppers te detecteren met behulp van de plantengastheer. De leafhoppervector Nephotettix cincticeps besmet met het rijstdwergvirus (RDV) dient als voorbeeld. Het vitellogenine en het belangrijkste buitenste capside-eiwit P8 van RDV, gevectoreerd door het speeksel van N. cincticeps, kunnen tegelijkertijd worden gedetecteerd in de rijstplant waar N. cincticeps zich mee voedt . Deze methode is toepasbaar voor het testen van de speekseleiwitten die tijdelijk in de plantengastheer worden vastgehouden na insectenvoeding. Er wordt aangenomen dat dit detectiesysteem de studie van hemipteran-virus-plant of hemipteran-plant interacties ten goede zal komen.

Figuur 1 illustreert alle stappen in dit protocol: insectenkweek, virusverwerving, het verzamelen van speekseleiwitten via rijstvoeding en de western blot. De resultaten van de western blots toonden aan dat specifieke en verwachte banden van ongeveer 220 kDa werden waargenomen in de monsters van het voeden van rijst en speekselklieren van insecten op het membraan geïncubeerd met antilichamen tegen Vg. Daarentegen werd geen band waargenomen in het niet-voedende rijstmonster. Het res...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host at JoVE.com

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Dit protocol laat zien hoe de plantengastheer kan worden gebruikt om speekseleiwitten van leafhopper en plantaardige virale eiwitten te detecteren die worden vrijgegeven door leafhopper-vectoren.

Het detecteren van virus- en speekseleiwitten van een leafhoppervector in de plantengastheer

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Dit protocol biedt een techniek voor het detecteren van de speekseleiwitten van leafhoppers en plantengastheren om de functie van deze eiwitten in de plantengastheren verder te onderzoeken. Deze techniek is eenvoudig uit te voeren en het systeem is stabiel en repliceerbaar. Deze methode kan ook nuttig zijn bij de detectie van speekseleiwitten van andere hemiptera- en plantengastheren.Om te beginnen, fok de volwassen leafhoppers op rijstzaailingen in een kubuskooi van 40 bij 35 bij 20 centimeter. Houd één kant van de kooi bedekt met een insectenbestendig net voor ventilatie. Plaats de kooien met de leafhoppers in een incubator met daarin een ingebouwde vochtigheidsregelaar op 26 graden Celsius met een relatieve luchtvochtigheid van 60 tot 75% onder een fotoperiode van 16 uur licht en acht uur donker.Gebruik eenmaal per week een aspirator om alle volwassenen voorzichtig uit hun kooi over te brengen naar een nieuwe kooi met verse rijstzaailingen. Laat meer dan 200 volwassenen paren en eieren leggen in de rijst. Bewaar de oude rijstzaailingen voor de nimfen om tevoorschijn te komen en deze nieuwe niet-virulifere nimfen naar het tweede instar-stadium te brengen.Gebruik de aspirator om de tweede instar niet-virulifere nimfen voorzichtig gedurende één tot twee uur over te brengen naar een glazen kweekbuis voor uithongering. Laat de nimfen vervolgens los in een kooi met een rijstdwergvirus geïnfecteerde rijstplant die in een pot is gekweekt en laat de nimfen zich twee dagen voeden met de geïnfecteerde rijstplant. Breng deze nimfen na twee dagen voorzichtig over naar een nieuwe kooi met verse virusvrije rijstzaailingen en laat de nimfen zich gedurende 12 dagen voeden met de virusvrije rijstzaailingen om de circulatoire overdrachtsperiode van het rijstdwergvirus te voltooien.Om de speekseleiwitten te verzamelen, bereidt u vijf kleine pijpachtige voedingskooien voor die aan één uiteinde zijn bedekt met insectenbestendig net. Nadat je 15 tot 20 leafhoppers in elke voerkooi hebt opgesloten, bedek je het andere uiteinde van de kooi met een dunne schuimmat. Bevestig een rijstzaailing tussen het einde van de kooi en een schuimmat met tapes, zodat de leafhoppers in de voederkooi zich kunnen voeden met de rijstzaailingen die aan de binnenkant van de kooi zijn blootgesteld.Dompel de zaailingwortels onder in water zodat de rijstplant in leven blijft en laat de leafhoppers zich er twee dagen mee voeden. Verwijder na twee dagen de leafhoppers uit hun voederkooien en verzamel de rijstzaailingen waarmee de leafhoppers zich voedden. Knip de zaailingen buiten de kooi en herstel de voedingsgebieden van de zaailingen.Bereid 1x Tris-Glycine buffer door 200 milliliter van de bereide 5x buffer te verdunnen met 800 milliliter steriel water. Bereid vervolgens 10x TBS-buffer voor en autoclaaf de oplossing bij 121 graden Celsius gedurende 15 minuten. Bereid vervolgens de 4x eiwitmonsterbuffer voor.Bereid vervolgens de transferbuffer voor door 800 milliliter van de Tris-Glycine-buffer te mengen met 200 milliliter methanol. Bereid ten slotte de TBST-oplossing door 100 milliliter 10x TBS en drie milliliter Tween 20 tot 900 milliliter steriel water toe te voegen. Om de speeksel- en virale eiwitten te detecteren, maalt u 0,1 gram van de rijstmonsters met vloeibare stikstof totdat het weefsel een poeder wordt.Voeg vervolgens 200 microliter van de 4x eiwitmonsterbuffer toe aan het monster en kook gedurende 10 minuten. Centrifugeer de monsters en breng het supernatant over in een nieuwe injectieflacon. Laad 10 microliter van het monster op een SDS-PAGE-gel en laat het gedurende 45 tot 60 minuten in Tris-Glycine-buffer op 150 volt lopen.Terwijl de gel loopt, plaatst u een nitrocellulosemembraan van 0,45 micron en andere sandwichbenodigdheden gedurende 30 minuten in de overdrachtsbuffer. Sandwich de gel na de run en breng deze gedurende 90 tot 120 minuten over op 100 volt in de transferbuffer. Nadat het vlekken is voltooid, plaatst u het membraan in een 7% vetvrije droge melkblokkeringsoplossing in TBST en incubeer u gedurende 20 minuten.Voeg daarna een antilichaam toe tegen het rijstdwergvirus P8 of vitellogenine en incubeer het membraan gedurende twee uur of 's nachts. Na de incubatie, was het membraan met TBST drie keer met een incubatie van vijf minuten tussen elke wasbeurt. Voeg vervolgens Goat anti-Rabbit IgG toe als secundair antilichaam en incubeer het membraan gedurende 60 tot 90 minuten.Gebruik de ECL Western-kit voor chemiluminescente detectie in gemengde detectiereagentia één en twee in de kit in een verhouding van één op één. Breng het membraan op het gemengde reagens en incubeer de vlek gedurende vijf minuten. Giet het overtollige reagens af en maak een chemiluminescente en colorimetrische foto van het membraan.Combineer de foto's om de laatste te zien met eiwitbanden. Western blot-analyse voor detectie van vitellogenine toonde specifieke en verwachte banden van ongeveer 220 kilodalton in het voeden van rijstplanten en speekselklieren van de insecten. Daarentegen werd geen band waargenomen in de niet-voedende planten, wat aangeeft dat vitellogenine in de plantengastheer werd vrijgegeven als een speekseleiwit.Western blot-analyse voor detectie van het rijstdwergvirus P8-eiwit toonde een specifieke en verwachte band van ongeveer 46 kilodalton in voedingsplanten en virulifere insectenlichamen. Daarentegen werd geen band waargenomen in niet-voedende planten en niet-virulifere leafhopperlichamen, wat bewijst dat de virale eiwitten ook in de voedende planten konden worden gedetecteerd. De virale lading in de leafhoppers, de detectietiming en replicaties moeten in aanmerking worden genomen bij het uitvoeren van dit protocol.Deze methode kan ook worden toegepast voor het bestuderen van muggen die arbovirussen overbrengen.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Ontleding van Midgut en speekselklieren van de Ae. aegypti Muggen

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana En Tomaat

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium-gemedieerde virus-geïnduceerde gen silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic Bioassay als een screeningsinstrument voor Host Plant Vluchtige stoffen

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Glycaan Profilering van Plant celwandpolymeren met behulp van Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Het meten van de osmotische Waterdoorlaatbaarheid (P<sub&gt; F</sub&gt;) Van Sferische Cellen: Isolated plantenprotoplasten als voorbeeld

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

High-throughput CRISPR Vector Constructie en karakterisering van DNA Wijzigingen van Generation van Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Vet orgel cultuur lichaamssysteem in Aedes Aegypti, een Vector van Zika-Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...