Name: detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host
Uploaded: 2021-09-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31772124 et 31972239) et de l’Université d’agriculture et de foresterie du Fujian (subvention KSYLX014).

Les cicadelles adultes non virulifères ont été multipliées au Centre de recherche sur les virus à transmission vectorielle de l’Université d’agriculture et de foresterie du Fujian, en Chine.
1. Élevage d’insectes non virulifères
<ol><li>Élever les adultes sur des plants de riz dans une cage cubique de 40 cm x 35 cm x 20 cm (longueur x largeur x hauteur). Gardez un côté de la cage recouvert d’un filet à l’épreuve des insectes pour la ventilation.<ol><li>Gardez les cages...

<ol>
	<li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Cranston, P. S., Gullan, P. J., Resh, V. H., Carde, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+of+insects.">Phylogeny of insects.</a> Encyclopedia of Insects. , (2003).</li><li>Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts.">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laccase-type+phenoloxidase+in+salivary+glands+and+watery+saliva+of+the+green+rice+leafhopper,+Nephotettix+cincticeps.">Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps.</a> Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).</li><li>Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+pectinesterase+and+polygalacturonase+from+salivary+secretions+of+living+greenbugs,+schizaphis+graminum+(Homoptera:+aphididae).">Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae).</a> Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).</li><li>Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+aspects+of+the+chemical+relation+between+the+rose+aphid+and+rose+buds.">Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).</li><li>Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+oxidising+enzymes+in+the+grain+aphid's+saliva.">Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).</li><li>Miles, P. W., Peng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+salivary+physiology+of+plant+bugs:+detoxification+of+phytochemicals+by+the+salivary+peroxidase+of+aphids.">Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids.</a> Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).</li><li>Will, T., van Bel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+interactions+between+aphids+and+plants.">Physical and chemical interactions between aphids and plants.</a> Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).</li><li>Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+loss+in+a+greenbug-susceptible+sorghum+due+to+pectinases+and+pectin+fragments.">Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments.</a> Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).</li><li>Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+salivary+components+as+a+possible+reason+for+differences+in+the+responses+of+alfalfa+to+the+spotted+alfalfa+aphid+and+pea+aphid.">Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).</li><li>Funk, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase+activity+in+whitefly+salivary+glands+and+saliva.">Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva.</a> Archives of Insect Biochemistry &amp; Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant-insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant-insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-layered+mechanistic+modelling+approach+to+understand+how+effector+genes+extend+beyond+phytoplasma+to+modulate+plant+hosts,+insect+vectors+and+the+environment.">A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).</li><li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+transcriptomic/proteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species.">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. , (2018).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant--insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant--insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mosquito+salivary+protein+promotes+flavivirus+transmission+by+activation+of+autophagy.">A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy.</a> Nature Communications. 11 (1), 260 (2020).</li><li>Sri-In, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+salivary+protein+of+Aedes+aegypti+promotes+dengue-2+virus+replication+and+transmission.">A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181 (2019).</li><li>Conway, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+D7+saliva+protein+inhibits+dengue+virus+infection.">Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941 (2016).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whitefly+effector+Bsp9+targets+host+immunity+regulator+WRKY33+to+promote+performance.">A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313 (2019).</li><li>Omura, T., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+outer+capsid+proteins+in+transmission+of+phytoreovirus+by+insect+vectors.">Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors.</a> Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).</li><li>Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+release+threshold+in+the+salivary+gland+of+leafhopper+vector+mediates+the+intermittent+transmission+of+rice+dwarf+virus.">Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 639445 (2021).</li><li>Fukushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+studies+on+the+dwarf+disease+of+rice+plant.">Further studies on the dwarf disease of rice plant.</a> Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).</li><li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+the+internal+components+of+rice+dwarf+virus.">The functional organization of the internal components of rice dwarf virus.</a> Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).</li><li>Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pns12+protein+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+formation+of+viroplasms+and+nucleation+of+viral-assembly+complexes.">Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes.</a> Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns4+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+viral+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector.</a> Virology Journal. 12, 211 (2015).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns12+of+rice+dwarf+virus+is+a+principal+regulator+for+viral+replication+and+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector.</a> Virus Research. 210, 54-61 (2015).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubules+of+plant+reoviruses+exploit+tropomodulin+to+regulate+actin-based+tubule+motility+in+insect+vector.">Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector.</a> Scientific Reports. 7, 38563 (2017).</li><li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Rice+dwarf+virus+among+cells+of+its+insect+vector+exploits+virus-induced+tubular+structures.">The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures.</a> Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).</li><li>Mao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+bacterial+symbiont-mediated+vitellogenin+uptake+into+oocytes+to+support+egg+development.">Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development.</a> mBio. 11 (6), 01142 (2020).</li><li>Tufail, M., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins.">Molecular characteristics of insect vitellogenins.</a> Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).</li><li>Sappington, T. W., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins+and+vitellogenin+receptors.">Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).</li><li>Ji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitellogenin+from+planthopper+oral+secretion+acts+as+a+novel+effector+to+impair+plant+defenses.">Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses.</a> New Phytologist. , (2021).</li></ol>

La salive directement sécrétée par les glandes salivaires des insectes perçants-suceurs joue un rôle central car elle prédigère et détoxifie les tissus hôtes et les facteurs biologiques inter-règnes des vecteurs dans les hôtes 1,3,4. Les facteurs biologiques inter-règnes, y compris les éliciteurs, les effecteurs et les petits ARN, sont essentiels à la communication insecte-hôte14,15,16...

Le mode de transmission vecteur-hôte des arbovirus, problème fondamental, est à la frontière de la science biologique. De nombreux virus végétaux d’importance agricole sont transmis horizontalement par des insectes vecteurs1. Plus de la moitié des virus végétaux sont vecteurs d’insectes hémiptères, y compris les pucerons, les aleurodes, les cicadelles, les cicadelles et les thrips. Ces insectes ont des caractéristiques distinctes qui leur permettent de transmettre efficacement les virus végétaux1. Ils possèdent des pièces buccales perçantes-suceuses et se nourrissent de la sève du phloème et du xylème, et sécrètent leur salive 1,2,3,4. Avec le développement et l’amélioration des techniques, l’identification et les analyses fonctionnelles des composants salivaires deviennent un nouvel axe de recherche intensive. Les protéines salivaires connues dans la salive comprennent de nombreuses enzymes, telles que la pectinestérase, la cellulase, la peroxydase, la phosphatase alcaline, la polyphénol oxydase et la sucrase, entre autres 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Les protéines dans la salive comprennent également des éliciteurs qui déclenchent la réponse de défense de l’hôte, modifiant ainsi la performance des insectes, et des effecteurs qui suppriment la défense de l’hôte, ce qui améliore la condition physique des insectes et les composants qui induisent des réponses pathologiques de l’hôte14,15,16,17. Par conséquent, les protéines salivaires sont des matériaux essentiels pour la communication entre les insectes et les hôtes. Lors de la transmission des virus, la salive sécrétée par les glandes salivaires des insectes virulifères perçants-suceurs contient également des protéines virales. Les composants viraux utilisent le flux de salive pour les libérer de l’insecte à la plante hôte. Par conséquent, la salive de l’insecte relie l’interaction tritrophique virus-vecteur-hôte. L’étude de la fonction biologique des protéines salivaires sécrétées par les insectes virulifères aide à comprendre la relation virus-vecteur-hôte.
Pour les virus animaux, on signale que la salive des moustiques intervient dans la transmission et la pathogénicité du virus du Nil occidental (VNO) et du virus de la dengue (DENV). La protéine salivaire AaSG34 favorise la réplication et la transmission du virus de la dengue-2, tandis que la protéine salivaire AaVA-1 favorise la transmission du DENV et du virus Zika (ZIKV) en activant l’autophagie18,19. La protéine salivaire D7 des moustiques peut inhiber l’infection par le DENV in vitro et in vivo par interaction directe avec les virions DENV et la protéine d’enveloppe DENVrecombinante 20. Dans les virus végétaux, le virus de l’enroulement jaune des feuilles de la tomate bégomovirus (TYLCV) induit la protéine salivaire Bsp9 de l’aleurode, qui supprime l’immunité médiée par WRKY33 de la plante hôte, pour augmenter la préférence et la performance des aleurodes, augmentant éventuellement la transmission des virus21. Étant donné que les études sur le rôle que jouent les protéines salivaires des insectes dans les plantes hôtes ont pris du retard par rapport à celles des hôtes animaux, un système stable et fiable pour détecter les protéines salivaires dans les plantes hôtes est nécessaire de toute urgence.
Le virus végétal connu sous le nom de virus nain du riz (RDV) est transmis par la cicadelle Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) avec une grande efficacité et une propagation persistante22,23. Le RDV a d’abord été signalé comme étant transmis par un insecte vecteur et provoque une maladie grave du riz en Asie24,25. Le virion est icosaédrique et sphérique à double couche, et la couche externe contient la protéine de capside externeP8 22. La période de transmission circulative du RDV chez N. cincticeps est de 14 jours 26,27,28,29,30. Lorsque le RDV arrive aux glandes salivaires, les virions sont libérés dans les cavités stockées dans la salive des glandes salivaires via un mécanisme semblable à l’exocytose23. La vitellogénine (Vg) est le précurseur de la protéine vitelline essentiel au développement des ovocytes chez les insectes femelles31,32,33. La plupart des espèces d’insectes ont au moins un transcrit Vg de 6-7 kb, qui code pour une protéine précurseur d’environ 220 kDa. Les précurseurs protéiques de Vg peuvent généralement être clivés en gros (140 à 190 kDa) et petits (<50 kDa) fragments avant d’entrer dans l’ovaire18,19. Une analyse protéomique antérieure a révélé la présence de peptides dérivés de Vg dans la salive sécrétée de la cicadelle Recilia dorsalis, bien que leur fonction soit inconnue (données non publiées). Il est récemment rapporté que Vg, qui est sécrété par voie orale par les cicadelles, fonctionne comme un effecteur pour endommager les défenses des plantes34. On ne sait pas si la Vg de N. cincticeps pourrait également être libérée à la plante hôte avec un flux salivaire, puis pourrait jouer un rôle dans la plante pour interférer avec les défenses de la plante. Pour déterminer si N. cincticeps exploite les protéines salivaires, telles que Vg, pour inhiber ou activer les défenses des plantes, la première étape consiste à identifier les protéines libérées par la plante pendant l’alimentation. Comprendre la méthode d’identification des protéines salivaires présentes dans la plante est potentiellement essentiel pour expliquer la fonction des protéines salivaires et les interactions entre les hémiptères et les plantes.
Dans le protocole présenté ici, N. cincticeps est utilisé comme exemple pour fournir une méthode permettant d’examiner la présence de protéines salivaires dans la plante hôte introduites par l’alimentation des insectes. Le protocole détaille principalement la collecte et la détection des protéines salivaires et est utile pour des recherches plus approfondies sur la plupart des hémiptères.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers and Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer</td>
			<td>Composition</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;5&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>15.1 g Tris base 
			94 g glycine 
			&#160;5 g SDS in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>200 mL of 5&#215;Tris-glycine buffer 
			800 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution, for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;Tris-buffered saline (TBS) buffer</td>
			<td>80 g NaCl 
			30 g Tris base 
			2 g KCl 
			in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS with Tween 20 (TBST) solution</td>
			<td>100 mL 10&#215;TBS solution 
			3 mL Tween 20 
			900 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#215; protein sample buffer</td>
			<td>8 g SDS 
			4 mL &#223;-mercaptoethanol 
			0.02 g bromophenol blue 
			40 mL glycerol 
			in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td></td>
			<td>For protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td>800 mL Tris-glycine buffer 
			200 mL methanol</td>
			<td></td>
			<td>For protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>PRX-1200B</td>
			<td>For rearing leafhoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis</td>
			<td>Tanon Science &#38; Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Tanon EP300</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic transfer core module</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703935</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-pass tissue grinding instrument</td>
			<td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.</td>
			<td>JXFSIPRP-24</td>
			<td>For grinding plant tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini wet heat transfer trough</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein color instrument</td>
			<td>GE Healthcare bio-sciences AB</td>
			<td>Amersham lmager 600</td>
			<td>For detecting proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical plate electrophoresis tank</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658001</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.</td>
			<td>XMTD-8222</td>
			<td>For boil the protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host

Les insectes vecteurs transmettent horizontalement de nombreux virus végétaux d’importance agricole. Plus de la moitié des virus végétaux sont transmis par des insectes hémiptères qui ont des pièces buccales perçantes-suceuses. Au cours de la transmission virale, la salive de l’insecte relie le virus-vecteur-hôte parce que les virus vecteurs de salive et les protéines d’insectes déclenchent ou suppriment la réponse immunitaire des plantes des insectes aux plantes hôtes. L’identification et les analyses fonctionnelles des protéines salivaires deviennent un nouveau domaine d’intérêt dans le domaine de recherche des interactions arbovirus-hôte. Ce protocole fournit un système pour détecter les protéines dans la salive des cicadelles à l’aide de la plante hôte. Le vecteur cicadelle Nephotettix cincticeps infecté par le virus nain du riz (RDV) en est un exemple. La vitellogénine et la principale protéine de capside externe P8 du RDV vecteur par la salive de N. cincticeps peuvent être détectées simultanément dans la plante de riz dont se nourrit N. cincticeps. Cette méthode est applicable pour tester les protéines salivaires qui sont retenues transitoirement dans la plante hôte après l’alimentation des insectes. On pense que ce système de détection sera bénéfique pour l’étude des interactions hémiptère-virus-plante ou hémiptère-plante.

La figure 1 illustre toutes les étapes de ce protocole : l’élevage des insectes, l’acquisition du virus, la collecte des protéines salivaires par l’alimentation du riz et le transfert Western. Les résultats des transferts Western ont montré que des bandes spécifiques et attendues d’environ 220 kDa ont été observées dans les échantillons de riz nourricier et de glandes salivaires d’insectes sur la membrane incubée avec des anticorps contre Vg. En revanche, aucune...

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Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Ce protocole montre comment utiliser la plante hôte pour détecter les protéines salivaires de la cicadelle et les protéines virales végétales libérées par les vecteurs de cicadelle.

Détection de virus et de protéines salivaires d’un vecteur cicadelle dans la plante hôte

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Ce protocole fournit une technique de détection des protéines salivaires des cicadelles et des plantes hôtes afin d’étudier davantage la fonction de ces protéines chez les plantes hôtes. Cette technique est facile à réaliser et le système est stable et reproductible. Cette méthode pourrait également être utile dans la détection des protéines salivaires d’autres hémiptères et plantes hôtes.Pour commencer, élevez les cicadelles adultes sur des plants de riz dans une cage cubique de 40 centimètres sur 35 centimètres sur 20. Gardez un côté de la cage recouvert d’un filet à l’épreuve des insectes pour la ventilation. Placez les cages avec les cicadelles dans un incubateur contenant un régulateur d’humidité intégré à 26 degrés Celsius avec une humidité relative de 60 à 75% sous une période photo de 16 heures de lumière et huit heures d’obscurité.Une fois par semaine, utilisez un aspirateur pour transférer doucement tous les adultes de leur cage dans une nouvelle cage contenant des plants de riz frais. Laissez plus de 200 adultes s’accoupler et pondre des œufs dans le riz. Conservez les vieux plants de riz pour que les nymphes émergent et élevez ces nouvelles nymphes non virulifères au stade du deuxième stade.À l’aide de l’aspirateur, transférez soigneusement les nymphes non virulifères du deuxième stade dans un tube de culture en verre pendant une à deux heures pour mourir de faim. Ensuite, relâchez les nymphes dans une cage contenant un plant de riz infecté par le virus nain du riz cultivé dans un pot et laissez les nymphes se nourrir du plant de riz infecté pendant deux jours. Après deux jours, transférez soigneusement ces nymphes dans une nouvelle cage contenant des plants de riz frais exempts de virus et laissez les nymphes se nourrir des plants de riz exempts de virus pendant 12 jours pour compléter la période de transmission circulative du virus nain du riz.Pour recueillir les protéines salivaires, préparez cinq petites cages d’alimentation en forme de tuyaux recouvertes d’un filet à l’épreuve des insectes à une extrémité. Après avoir confiné 15 à 20 cicadelles dans chaque cage d’alimentation, couvrir l’autre extrémité de la cage avec un mince tapis en mousse. Fixez un plant de riz entre l’extrémité de la cage et un tapis en mousse avec des rubans, en veillant à ce que les cicadelles dans la cage d’alimentation puissent se nourrir des plants de riz exposés à l’intérieur de la cage.Immergez les racines des plantules dans l’eau pour que le plant de riz reste en vie et laissez les cicadelles s’en nourrir pendant deux jours. Après deux jours, retirez les cicadelles de leurs cages d’alimentation et ramassez les plants de riz dont les cicadelles se nourrissaient. Coupez les plants à l’extérieur de la cage et récupérez les régions d’alimentation des plants.Préparer 1x tampon Tris-Glycine en diluant 200 millilitres du tampon 5x préparé avec 800 millilitres d’eau stérile. Ensuite, préparez 10x tampon TBS et autoclavez la solution à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, préparez le tampon d’échantillon de protéines 4x.Préparez ensuite le tampon de transfert en mélangeant 800 millilitres du tampon Tris-Glycine avec 200 millilitres de méthanol. Enfin, préparez la solution TBST en ajoutant 100 millilitres de TBS 10x et trois millilitres de Tween 20 à 900 millilitres d’eau stérile. Pour détecter les protéines salivaires et virales, broyez 0,1 gramme d’échantillons de riz avec de l’azote liquide jusqu’à ce que le tissu devienne une poudre.Ensuite, ajoutez 200 microlitres du tampon d’échantillon de protéines 4x à l’échantillon et faites bouillir pendant 10 minutes. Centrifuger les échantillons et transférer le surnageant dans un nouveau flacon. Chargez 10 microlitres de l’échantillon sur un gel SDS-PAGE et faites-le passer dans un tampon Tris-Glycine à 150 volts pendant 45 à 60 minutes.Pendant que le gel fonctionne, placez une membrane de nitrocellulose de 0,45 micron et d’autres fournitures sandwich dans le tampon de transfert pendant 30 minutes. Après la course, prenez le gel en sandwich et transférez-le pendant 90 à 120 minutes à 100 volts dans le tampon de transfert. Une fois le buvard terminé, placez la membrane dans une solution de blocage de lait en poudre écrémé à 7% dans TBST et incuber pendant 20 minutes.Après cela, ajoutez un anticorps contre le virus nain du riz P8 ou la vitellogénine et incuber la membrane pendant deux heures ou toute la nuit. Après l’incubation, laver la membrane avec du TBST trois fois avec une incubation de cinq minutes entre chaque lavage. Ajoutez ensuite des IgG anti-lapin de chèvre comme anticorps secondaire et incuber la membrane pendant 60 à 90 minutes.Utilisez le kit ECL Western pour la détection chimiluminescente dans les réactifs de détection mixtes un et deux dans le kit dans un rapport de un pour un. Placez la membrane sur le réactif mixte et incuber le transfert pendant cinq minutes. Égoutter l’excès de réactif et prendre une image chimioluminescente et colorimétrique de la membrane.Combinez les images pour voir ces dernières avec des bandes protéiques. L’analyse par transfert Western pour la détection de la vitellogénine a montré des bandes spécifiques et attendues d’environ 220 kilodaltons dans l’alimentation des plants de riz et des glandes salivaires des insectes. En revanche, aucune bande n’a été observée chez les plantes non nourricières, ce qui indique que la vitellogénine a été libérée dans la plante hôte sous forme de protéine salivaire.L’analyse par transfert Western pour la détection de la protéine P8 du virus nain du riz a montré une bande spécifique et attendue d’environ 46 kilodaltons dans les plantes d’alimentation et les corps d’insectes virulifères. En revanche, aucune bande n’a été observée chez les plantes non nourricères et les corps de cicadelles non virulifères, ce qui prouve que les protéines virales pouvaient également être détectées dans les plantes d’alimentation. La charge virale dans les cicadelles, le moment de la détection et les réplications doivent être pris en compte lors de l’exécution de ce protocole.Cette méthode peut également être appliquée pour étudier les moustiques qui transmettent des arbovirus.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

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The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Recherche

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