Name: detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host
Uploaded: 2021-09-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31772124 ו -31972239) ואוניברסיטת פוג'יאן לחקלאות וייעור (מענק KSYLX014).

העלעלים הבוגרים הלא-אלימים הופצו במרכז לחקר וירוסים הנישאים על ידי וקטורים באוניברסיטת פוג'יאן לחקלאות וייעור, סין.
1. גידול חרקים לא אלימים
<ol><li>מגדלים את הבוגרים על שתילי אורז בכלוב קוביות בגודל 40X35X20 ס"מ (אורך X רוחב X גובה). יש לכסות צד אחד של הכלוב ברשת חסינת חרקים לצורך או?...

<ol>
	<li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Cranston, P. S., Gullan, P. J., Resh, V. H., Carde, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+of+insects.">Phylogeny of insects.</a> Encyclopedia of Insects. , (2003).</li><li>Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts.">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laccase-type+phenoloxidase+in+salivary+glands+and+watery+saliva+of+the+green+rice+leafhopper,+Nephotettix+cincticeps.">Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps.</a> Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).</li><li>Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+pectinesterase+and+polygalacturonase+from+salivary+secretions+of+living+greenbugs,+schizaphis+graminum+(Homoptera:+aphididae).">Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae).</a> Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).</li><li>Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+aspects+of+the+chemical+relation+between+the+rose+aphid+and+rose+buds.">Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).</li><li>Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+oxidising+enzymes+in+the+grain+aphid's+saliva.">Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).</li><li>Miles, P. W., Peng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+salivary+physiology+of+plant+bugs:+detoxification+of+phytochemicals+by+the+salivary+peroxidase+of+aphids.">Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids.</a> Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).</li><li>Will, T., van Bel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+interactions+between+aphids+and+plants.">Physical and chemical interactions between aphids and plants.</a> Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).</li><li>Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+loss+in+a+greenbug-susceptible+sorghum+due+to+pectinases+and+pectin+fragments.">Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments.</a> Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).</li><li>Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+salivary+components+as+a+possible+reason+for+differences+in+the+responses+of+alfalfa+to+the+spotted+alfalfa+aphid+and+pea+aphid.">Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).</li><li>Funk, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase+activity+in+whitefly+salivary+glands+and+saliva.">Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva.</a> Archives of Insect Biochemistry &amp; Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant-insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant-insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-layered+mechanistic+modelling+approach+to+understand+how+effector+genes+extend+beyond+phytoplasma+to+modulate+plant+hosts,+insect+vectors+and+the+environment.">A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).</li><li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+transcriptomic/proteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species.">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. , (2018).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant--insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant--insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mosquito+salivary+protein+promotes+flavivirus+transmission+by+activation+of+autophagy.">A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy.</a> Nature Communications. 11 (1), 260 (2020).</li><li>Sri-In, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+salivary+protein+of+Aedes+aegypti+promotes+dengue-2+virus+replication+and+transmission.">A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181 (2019).</li><li>Conway, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+D7+saliva+protein+inhibits+dengue+virus+infection.">Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941 (2016).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whitefly+effector+Bsp9+targets+host+immunity+regulator+WRKY33+to+promote+performance.">A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313 (2019).</li><li>Omura, T., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+outer+capsid+proteins+in+transmission+of+phytoreovirus+by+insect+vectors.">Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors.</a> Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).</li><li>Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+release+threshold+in+the+salivary+gland+of+leafhopper+vector+mediates+the+intermittent+transmission+of+rice+dwarf+virus.">Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 639445 (2021).</li><li>Fukushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+studies+on+the+dwarf+disease+of+rice+plant.">Further studies on the dwarf disease of rice plant.</a> Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).</li><li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+the+internal+components+of+rice+dwarf+virus.">The functional organization of the internal components of rice dwarf virus.</a> Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).</li><li>Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pns12+protein+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+formation+of+viroplasms+and+nucleation+of+viral-assembly+complexes.">Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes.</a> Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns4+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+viral+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector.</a> Virology Journal. 12, 211 (2015).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns12+of+rice+dwarf+virus+is+a+principal+regulator+for+viral+replication+and+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector.</a> Virus Research. 210, 54-61 (2015).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubules+of+plant+reoviruses+exploit+tropomodulin+to+regulate+actin-based+tubule+motility+in+insect+vector.">Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector.</a> Scientific Reports. 7, 38563 (2017).</li><li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Rice+dwarf+virus+among+cells+of+its+insect+vector+exploits+virus-induced+tubular+structures.">The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures.</a> Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).</li><li>Mao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+bacterial+symbiont-mediated+vitellogenin+uptake+into+oocytes+to+support+egg+development.">Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development.</a> mBio. 11 (6), 01142 (2020).</li><li>Tufail, M., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins.">Molecular characteristics of insect vitellogenins.</a> Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).</li><li>Sappington, T. W., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins+and+vitellogenin+receptors.">Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).</li><li>Ji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitellogenin+from+planthopper+oral+secretion+acts+as+a+novel+effector+to+impair+plant+defenses.">Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses.</a> New Phytologist. , (2021).</li></ol>

הרוק המופרש ישירות על ידי בלוטות הרוק של החרקים המוצצים ממלא תפקיד מרכזי מכיוון שהוא מעכל מראש ומנקה רעלים מהרקמות המארחות ומהגורמים הביולוגיים חוצי הממלכות של הווקטורים לפונדקאים 1,3,4. הגורמים הביולוגיים חוצי הממלכות, כולל אליציטורים, ?...

מצב השידור הווקטורי-מארח של ארבו-וירוסים, בעיה בסיסית, נמצא בחזית המדע הביולוגי. וירוסים צמחיים רבים בעלי חשיבות חקלאית מועברים אופקית על ידי וקטורים של חרקים1. יותר ממחצית הנגיפים הצמחיים הם וקטורים על ידי חרקים המיפטרניים, כולל כנימות, זבובים לבנים, עלים, פלנטהופרים ותריפס. לחרקים אלה תכונות ייחודיות המאפשרות להם להעביר ביעילות וירוסים צמחיים1. יש להם חלקי פה מוצצי פירסינג והם ניזונים מהלשד מפלואם ומקסילם, ומפרישים את הרוק שלהם 1,2,3,4. עם הפיתוח והשיפור של טכניקות, הזיהוי והניתוחים הפונקציונליים של מרכיבי הרוק הופכים למוקד חדש של מחקר אינטנסיבי. חלבוני הרוק הידועים ברוק כוללים אנזימים רבים, כגון פקטינאסטראז, צלולאז, פרוקסידאז, פוספטאז אלקליין, פוליפנול אוקסידאז וסוכראז, בין היתר 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . החלבונים ברוק כוללים גם אליקטורים המפעילים את תגובת ההגנה של הפונדקאי, ובכך משנים את ביצועי החרקים, ומשפיעים המדכאים את הגנת הפונדקאי, המשפרים את כושר החרקים ורכיבים הגורמים לתגובות פתולוגיות של המארח14,15,16,17. לכן, חלבוני רוק הם חומרים חיוניים לתקשורת בין חרקים לפונדקאים. במהלך העברת הנגיפים, הרוק המופרש על ידי בלוטות הרוק של חרקים אלימים מוצצי פירסינג מכיל גם חלבונים נגיפיים. רכיבים נגיפיים מנצלים את זרימת הרוק כדי לשחרר אותם מהחרק לפונדקאי הצמח. לכן, רוק החרק מגשר על האינטראקציה הטריטרופית וירוס-וקטור-מארח. חקירת התפקוד הביולוגי של חלבוני רוק המופרשים על ידי חרקים אלימים מסייעת להבין את הקשר בין וירוס-וקטור-מארח.
עבור וירוסים של בעלי חיים, מדווח כי רוק של יתושים מתווך את ההעברה והפתוגניות של נגיף הנילוס המערבי (WNV) ונגיף דנגי (DENV). חלבון הרוק AaSG34 מקדם שכפול והעברה של נגיף דנגי-2, ואילו חלבון הרוק AaVA-1 מקדם העברת נגיף DENV וזיקה (ZIKV) על ידי הפעלת אוטופגיה18,19. חלבון הרוק D7 של יתושים יכול לעכב זיהום DENV במבחנה ו-in vivo באמצעות אינטראקציה ישירה עם נגיפים של DENV וחלבון מעטפת DENVרקומביננטי 20. בנגיפים צמחיים, וירוס תלתלי העלים הצהובים של עגבנייה (TYLCV) גורם לחלבון הרוק של הזבוב הלבן Bsp9, המדכא את החסינות בתיווך WRKY33 של מארח הצמח, להגביר את ההעדפה והביצועים של הזבובים הלבנים, ובסופו של דבר מגביר את העברת הנגיפים21. מאחר שמחקרים על התפקיד שממלאים חלבוני רוק של חרקים בפונדקאים של צמחים פיגרו אחרי אלה של פונדקאים של בעלי חיים, נדרשת בדחיפות מערכת יציבה ואמינה לזיהוי חלבוני הרוק בפונדקאים של צמחים.
נגיף הצמח המכונה וירוס ננס אורז (RDV) מועבר על ידי הופר Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) ביעילות גבוהה ובאופן מתפשט מתמשך22,23. RDV דווח לראשונה כמועבר על ידי וקטור חרקים וגורם למחלה קשה של אורז באסיה24,25. הנגיף הוא איקוסהדרלי ודו-שכבתי כדורי, והשכבה החיצונית מכילה את חלבון הקפסיד החיצוני P822. תקופת השידור במחזור הדם של RDV ב N. cincticeps היא 14 ימים 26,27,28,29,30. כאשר RDV מגיע לבלוטות הרוק, נגיפים משתחררים לחללים המאוחסנים ברוק בבלוטות הרוק באמצעות מנגנון דמוי אקסוציטוזה23. ויטלוגנין (Vg) הוא קודמן חלבון החלמון החיוני להתפתחות ביציות בנקבות חרקים31,32,33. לרוב מיני החרקים יש לפחות תעתיק Vg אחד של 6-7 קילובייט, המקודד חלבון מקדים של כ-220 kDa. מבשרי החלבון של Vg יכולים בדרך כלל להיבקע למקטעים גדולים (140 עד 190 kDa) וקטנים (<50 kDa) לפני הכניסה לשחלה18,19. ניתוח פרוטאומי קודם גילה את נוכחותם של הפפטידים שמקורם ב-Vg ברוק המופרש של העלה Recilia dorsalis, אם כי תפקידם אינו ידוע (נתונים שלא פורסמו). לאחרונה דווח כי Vg, המופרש דרך הפה מצמחים, מתפקד כגורם משפיע לפגיעה בהגנות של צמחים34. לא ידוע אם Vg של N. cincticeps יכול גם להשתחרר לצמח המארח עם זרימת רוק, ואז יכול לשחק תפקיד בצמח להפריע להגנה על הצמח. כדי לענות על השאלה האם N. cincticeps מנצל חלבוני רוק, כגון Vg, כדי לעכב או להפעיל את הגנות הצמח, הצעד הראשון הוא זיהוי חלבונים המשתחררים לצמח במהלך ההאכלה. הבנת השיטה לזיהוי חלבוני הרוק הנמצאים בצמח עשויה להיות חיונית כדי להסביר את תפקודם של חלבוני הרוק ואת יחסי הגומלין בין המיפטרה לצמחים.
בפרוטוקול המוצג כאן, N. cincticeps משמש כדוגמה כדי לספק שיטה לבחון את נוכחותם של חלבוני רוק בצמח המארח שהוכנסו באמצעות הזנת חרקים. הפרוטוקול מפרט בעיקר את האיסוף והזיהוי של חלבוני רוק והוא מועיל לחקירה נוספת על רוב ההמיפטרנים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers and Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer</td>
			<td>Composition</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;5&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>15.1 g Tris base 
			94 g glycine 
			&#160;5 g SDS in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>200 mL of 5&#215;Tris-glycine buffer 
			800 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution, for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;Tris-buffered saline (TBS) buffer</td>
			<td>80 g NaCl 
			30 g Tris base 
			2 g KCl 
			in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS with Tween 20 (TBST) solution</td>
			<td>100 mL 10&#215;TBS solution 
			3 mL Tween 20 
			900 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#215; protein sample buffer</td>
			<td>8 g SDS 
			4 mL &#223;-mercaptoethanol 
			0.02 g bromophenol blue 
			40 mL glycerol 
			in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td></td>
			<td>For protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td>800 mL Tris-glycine buffer 
			200 mL methanol</td>
			<td></td>
			<td>For protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>PRX-1200B</td>
			<td>For rearing leafhoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis</td>
			<td>Tanon Science &#38; Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Tanon EP300</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic transfer core module</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703935</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-pass tissue grinding instrument</td>
			<td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.</td>
			<td>JXFSIPRP-24</td>
			<td>For grinding plant tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini wet heat transfer trough</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein color instrument</td>
			<td>GE Healthcare bio-sciences AB</td>
			<td>Amersham lmager 600</td>
			<td>For detecting proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical plate electrophoresis tank</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658001</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.</td>
			<td>XMTD-8222</td>
			<td>For boil the protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host

וקטורי חרקים מעבירים אופקית וירוסים צמחיים רבים בעלי חשיבות חקלאית. יותר ממחצית הנגיפים הצמחיים מועברים על ידי חרקים המיפטרניים שיש להם חלקי פה מוצצים חודרים. במהלך העברה ויראלית, רוק החרק מגשר בין הנגיף-וקטור-מארח מכיוון שווקטורי הרוק נגיפים, וחלבוני החרקים, מעוררים או מדכאים את התגובה החיסונית של צמחים מחרקים לפונדקאים צמחיים. הזיהוי והניתוחים הפונקציונליים של חלבוני רוק הופכים לתחום חדש של התמקדות בתחום המחקר של אינטראקציות ארבו-וירוס-מארח. פרוטוקול זה מספק מערכת לזיהוי חלבונים ברוק של עלעלים באמצעות הצמח המארח. וקטור ההופר Nephotettix cincticeps הנגוע בנגיף ננס האורז (RDV) משמש כדוגמה. ויטלוגנין וחלבון הקפסיד החיצוני העיקרי P8 של RDV וקטור על ידי הרוק של N. cincticeps ניתן לזהות בו זמנית בצמח האורז כי N. cincticeps ניזון ממנו . שיטה זו ישימה לבדיקת חלבוני הרוק הנשמרים באופן זמני בצמח המארח לאחר הזנת חרקים. הוא האמין כי מערכת זו של זיהוי יועיל המחקר של hemipteran-virus-צמח או hemipteran-צמח אינטראקציות.

איור 1 מדגים את כל השלבים בפרוטוקול הזה: גידול חרקים, רכישת וירוסים, איסוף חלבוני רוק באמצעות הזנת אורז והכתם המערבי. תוצאות הכתמים המערביים הראו כי רצועות ספציפיות וצפויות של כ -220 kDa נצפו בדגימות של בלוטות אורז ורוק של חרקים על הממברנה מודגרות עם נוגדנים נגד Vg. לעומת זא...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host at JoVE.com

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

פרוטוקול זה מדגים כיצד להשתמש בצמח המארח כדי לזהות חלבוני רוק של חלבונים נגיפיים צמחיים וחלבונים נגיפיים צמחיים המשתחררים על ידי וקטורי עלים.

איתור חלבוני וירוס ורוק של וקטור עלה בצמח המארח

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

פרוטוקול זה מספק טכניקה לזיהוי חלבוני הרוק של עלעלים ופונדקאים צמחיים כדי להמשיך לחקור את תפקודם של חלבונים אלה בפונדקאים של הצמח. טכניקה זו קלה לביצוע והמערכת יציבה וניתנת לשכפול. שיטה זו יכולה גם להיות מועילה בזיהוי חלבוני רוק של המיפטרות אחרות ופונדקאים צמחיים.כדי להתחיל, מגדלים את העלעלים הבוגרים על שתילי אורז בכלוב קוביות בגודל 40 על 35 על 20 סנטימטרים. יש לכסות צד אחד של הכלוב ברשת חסינת חרקים לצורך אוורור. הניחו את הכלובים עם העלעלים באינקובטור המכיל בקר לחות מובנה בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס עם לחות יחסית של 60 עד 75% בתקופת צילום של 16 שעות אור ושמונה שעות חושך.פעם בשבוע, השתמשו בשאיפה כדי להעביר בעדינות את כל המבוגרים מהכלוב שלהם לכלוב חדש המכיל שתילי אורז טריים. אפשרו ליותר מ-200 מבוגרים להזדווג ולהטיל ביצים באורז. שמרו את שתילי האורז הישנים כדי שהנימפות ייצאו ויגדילו את הנימפות הלא-ארסיות החדשות האלה לשלב האינסטאר השני.בעזרת השואב, מעבירים בזהירות את הנימפות הלא אלימות האינסטאריות השניות לצינור תרבית זכוכית למשך שעה עד שעתיים לרעב. לאחר מכן שחררו את הנימפות לכלוב המכיל צמח אורז נגוע בנגיף ננסי אורז שגדל בעציץ ואפשרו לנימפות להיזון מצמח האורז הנגוע במשך יומיים. לאחר יומיים, העבירו בזהירות את הנימפות הללו לכלוב חדש המכיל שתילי אורז טריים ללא וירוסים, ואפשרו לנימפות להיזון משתילי האורז נטולי הנגיף במשך 12 יום כדי להשלים את תקופת העברת הדם של נגיף ננסי האורז.כדי לאסוף את חלבוני הרוק, הכינו חמישה כלובי האכלה קטנים דמויי צינור המכוסים ברשתות חסינות חרקים בקצה אחד. לאחר כליאת 15 עד 20 עלעלים בכל כלוב האכלה, כסו את הקצה השני של הכלוב בשטיחון קצף דק. קבעו שתיל אורז אחד בין קצה הכלוב למחצלת קצף בעזרת סרטי הדבקה, וודאו שהעלעלים בכלוב ההאכלה יוכלו להיזון משתילי האורז החשופים לחלק הפנימי של הכלוב.טובלים את שורשי השתיל במים כדי שצמח האורז יישאר בחיים, ומאפשרים לעלעלים להיזון מהם במשך יומיים. לאחר יומיים, הוציאו את העלעלים מכלובי ההאכלה שלהם ואספו את שתילי האורז שעליהם ניזונו העלים. חותכים את השתילים מחוץ לכלוב ומשחזרים את אזורי ההאכלה של השתילים.הכינו חיץ טריס-גליצין 1x על ידי דילול 200 מיליליטר של חיץ 5x מוכן עם 800 מיליליטר מים סטריליים. לאחר מכן הכינו מאגר של 10x TBS ובצעו אוטוקלאבינג של התמיסה בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, הכינו את מאגר דגימת החלבון 4x.לאחר מכן להכין את מאגר ההעברה על ידי ערבוב 800 מיליליטר של חיץ Tris-גליצין עם 200 מיליליטר של מתנול. לבסוף, הכינו את פתרון TBST על ידי הוספת 100 מיליליטר של 10x TBS ושלושה מיליליטר של Tween 20 עד 900 מיליליטר של מים סטריליים. כדי לזהות את חלבוני הרוק והנגיפים, לטחון 0.1 גרם של דגימות האורז עם חנקן נוזלי עד הרקמה הופכת אבקה.לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטר של מאגר דגימת חלבון 4x לדגימה ומרתיחים במשך 10 דקות. צנטריפוגו את הדגימות והעבירו את הסופרנאטנט לבקבוקון חדש. טען 10 מיקרוליטר של הדגימה על ג'ל SDS-PAGE והפעל אותה במאגר Tris-Glycine במתח של 150 וולט למשך 45 עד 60 דקות.בזמן שהג'ל פועל, הניחו קרום ניטרוצלולוז 0.45 מיקרון וציוד סנדוויץ' אחר במאגר ההעברה למשך 30 דקות. לאחר הריצה, סנדוויץ' את הג'ל ולהעביר אותו במשך 90 עד 120 דקות ב 100 וולט במאגר ההעברה. לאחר השלמת הניקוי, הניחו את הממברנה בתמיסת חסימת חלב יבש ללא שומן 7% ב-TBST ודגרו במשך 20 דקות.לאחר מכן, להוסיף נוגדן נגד וירוס ננס האורז P8 או vitellogenin לדגור על הממברנה במשך שעתיים או לילה. לאחר הדגירה, שטפו את הממברנה עם TBST שלוש פעמים עם דגירה של חמש דקות בין כל שטיפה. לאחר מכן להוסיף עז נגד ארנב IgG כנוגדן משני לדגור את הממברנה במשך 60 עד 90 דקות.השתמש בערכת ECL Western לזיהוי כימילומינסנטי בריאגנטים מעורבים אחד ושניים בערכה ביחס של אחד לאחד. שים את הממברנה על מגיב מעורב לדגור את הכתם במשך חמש דקות. מסננים את מגיב עודף ולקחת תמונה chemiluminescent ו colorimetric של הממברנה.שלב את התמונות כדי לראות את האחרון עם להקות חלבון. ניתוח כתמים מערביים לגילוי ויטלוגנין הראה רצועות ספציפיות וצפויות של כ-220 קילודלטון בהזנת צמחי אורז ובלוטות רוק של החרקים. לעומת זאת, לא נצפתה להקה בצמחים שאינם ניזונים, מה שמעיד על כך שויטלוגנין שוחרר בצמח המארח כחלבון רוק.ניתוח כתם מערבי לגילוי חלבון ננס האורז P8 הראה רצועה ספציפית וצפויה של כ-46 קילודלטון בצמחי האכלה ובגופי חרקים אלימים. לעומת זאת, לא נצפתה להקה בצמחים שאינם ניזונים ובגופי עלים שאינם אלימים, מה שמוכיח כי ניתן לזהות את החלבונים הנגיפיים גם בצמחים הניזונים. יש לקחת בחשבון את העומס הנגיפי בעלונים, את תזמון הזיהוי ואת הרפליקטים בעת ביצוע פרוטוקול זה.שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם לחקר יתושים המעבירים arboviruses.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Dissection של בלוטות הרוק midgut ו מ AE. aegypti יתושים

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium בתיווך Virus-induced ג&#39;ין השתקת Assay כותנה

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

המבדק Electroantennographic ככלי מיון עבור נדיפים צמחים מארח

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

מדידת אוסמוטי המים החדירות מקדם (P<sub&gt; F</sub&gt;) של תאים כדוריים: Protoplasts צמח מבודד כדוגמה

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

תרבות הגוף השמן איברים במערכת Aedes Aegypti, וקטור של וירוס Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...