Name: detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host
Uploaded: 2021-09-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (31772124 og 31972239) og Fujian Agriculture and Forestry University (Grant KSYLX014).

De ikke-viruliferøse voksne bladhopperne ble forplantet i Vector-borne Virus Research Center i Fujian Agriculture and Forestry University, Kina.
1. Ikke-viruliferous insektoppdrett
<ol><li>Bak de voksne på risplanter i et kubebur som er 40 cm x 35 cm x 20 cm (lengde x bredde x høyde). Hold den ene siden av buret dekket med et insektsikkert nett for ventilasjon.<ol><li>Hold burene med bladhoppere i en inkubator som inneholder en innebygd fuktighetsregulator ved 26 °C med en relativ fuktig...

<ol>
	<li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Cranston, P. S., Gullan, P. J., Resh, V. H., Carde, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+of+insects.">Phylogeny of insects.</a> Encyclopedia of Insects. , (2003).</li><li>Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts.">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laccase-type+phenoloxidase+in+salivary+glands+and+watery+saliva+of+the+green+rice+leafhopper,+Nephotettix+cincticeps.">Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps.</a> Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).</li><li>Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+pectinesterase+and+polygalacturonase+from+salivary+secretions+of+living+greenbugs,+schizaphis+graminum+(Homoptera:+aphididae).">Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae).</a> Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).</li><li>Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+aspects+of+the+chemical+relation+between+the+rose+aphid+and+rose+buds.">Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).</li><li>Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+oxidising+enzymes+in+the+grain+aphid's+saliva.">Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).</li><li>Miles, P. W., Peng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+salivary+physiology+of+plant+bugs:+detoxification+of+phytochemicals+by+the+salivary+peroxidase+of+aphids.">Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids.</a> Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).</li><li>Will, T., van Bel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+interactions+between+aphids+and+plants.">Physical and chemical interactions between aphids and plants.</a> Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).</li><li>Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+loss+in+a+greenbug-susceptible+sorghum+due+to+pectinases+and+pectin+fragments.">Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments.</a> Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).</li><li>Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+salivary+components+as+a+possible+reason+for+differences+in+the+responses+of+alfalfa+to+the+spotted+alfalfa+aphid+and+pea+aphid.">Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).</li><li>Funk, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase+activity+in+whitefly+salivary+glands+and+saliva.">Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva.</a> Archives of Insect Biochemistry &amp; Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant-insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant-insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-layered+mechanistic+modelling+approach+to+understand+how+effector+genes+extend+beyond+phytoplasma+to+modulate+plant+hosts,+insect+vectors+and+the+environment.">A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).</li><li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+transcriptomic/proteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species.">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. , (2018).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant--insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant--insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mosquito+salivary+protein+promotes+flavivirus+transmission+by+activation+of+autophagy.">A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy.</a> Nature Communications. 11 (1), 260 (2020).</li><li>Sri-In, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+salivary+protein+of+Aedes+aegypti+promotes+dengue-2+virus+replication+and+transmission.">A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181 (2019).</li><li>Conway, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+D7+saliva+protein+inhibits+dengue+virus+infection.">Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941 (2016).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whitefly+effector+Bsp9+targets+host+immunity+regulator+WRKY33+to+promote+performance.">A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313 (2019).</li><li>Omura, T., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+outer+capsid+proteins+in+transmission+of+phytoreovirus+by+insect+vectors.">Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors.</a> Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).</li><li>Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+release+threshold+in+the+salivary+gland+of+leafhopper+vector+mediates+the+intermittent+transmission+of+rice+dwarf+virus.">Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 639445 (2021).</li><li>Fukushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+studies+on+the+dwarf+disease+of+rice+plant.">Further studies on the dwarf disease of rice plant.</a> Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).</li><li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+the+internal+components+of+rice+dwarf+virus.">The functional organization of the internal components of rice dwarf virus.</a> Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).</li><li>Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pns12+protein+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+formation+of+viroplasms+and+nucleation+of+viral-assembly+complexes.">Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes.</a> Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns4+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+viral+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector.</a> Virology Journal. 12, 211 (2015).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns12+of+rice+dwarf+virus+is+a+principal+regulator+for+viral+replication+and+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector.</a> Virus Research. 210, 54-61 (2015).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubules+of+plant+reoviruses+exploit+tropomodulin+to+regulate+actin-based+tubule+motility+in+insect+vector.">Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector.</a> Scientific Reports. 7, 38563 (2017).</li><li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Rice+dwarf+virus+among+cells+of+its+insect+vector+exploits+virus-induced+tubular+structures.">The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures.</a> Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).</li><li>Mao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+bacterial+symbiont-mediated+vitellogenin+uptake+into+oocytes+to+support+egg+development.">Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development.</a> mBio. 11 (6), 01142 (2020).</li><li>Tufail, M., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins.">Molecular characteristics of insect vitellogenins.</a> Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).</li><li>Sappington, T. W., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins+and+vitellogenin+receptors.">Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).</li><li>Ji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitellogenin+from+planthopper+oral+secretion+acts+as+a+novel+effector+to+impair+plant+defenses.">Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses.</a> New Phytologist. , (2021).</li></ol>

Spyttet som utskilles direkte av spyttkjertlene til de piercingsugende insektene, spiller en sentral rolle fordi det fordøyer og avgifter vertsvevet og vektorenes biologiske faktorer på tvers av kongeriketi vertene 1,3,4. De biologiske faktorene på tvers av riket, inkludert elicitorer, effektorer og lite RNA, er kritiske for insekt-vertkommunikasjon14,15,16...

Vektor-vert overføringsmodus for arbovirus, et grunnleggende problem, er på grensen til biologisk vitenskap. Mange plantevirus av landbruksmessig betydning overføres horisontalt av insektvektorer1. Mer enn halvparten av plantevirus er vektorert av hemipteran insekter, inkludert bladlus, hvitefugler, bladhopper, plantehoppere og thrips. Disse insektene har forskjellige egenskaper som gjør at de effektivt kan overføre plantevirus1. De har piercing-sugende munndeler og spiser på saften fra floem og xylem, og skiller ut spyttet 1,2,3,4. Med utvikling og forbedring av teknikker blir identifisering og funksjonelle analyser av spyttkomponenter et nytt fokus for intensiv forskning. De kjente spyttproteinene i spytt inkluderer mange enzymer, som pektinesterase, cellulase, peroksidase, alkalisk fosfatase, polyfenoloksidase og sukrase, blant annet 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Proteinene i spytt inkluderer også elicitors som utløser vertsforsvarsresponsen, og dermed endrer ytelsen til insekter, og effektorer som undertrykker vertsforsvaret, noe som forbedrer insektkondisjon og komponenter som induserer vertspatologiske responser14,15,16,17. Derfor er spyttproteiner viktige materialer for kommunikasjon mellom insekter og verter. Under overføring av virus inneholder spytt utskilt av spyttkjertlene av piercing-sugende viruliferous insekter også viruliferous proteiner. Virale komponenter utnytter spyttstrømmen for å frigjøre dem fra insektet til planteverten. Derfor bygger insektspyttet bro over virus-vektor-vert tritrofisk interaksjon. Undersøkelse av den biologiske funksjonen til spyttproteiner utskilt av viruliferous insekter bidrar til å forstå forholdet mellom virus-vektor-vert.
For dyrevirus er det rapportert at spytt av mygg medierer overføring og patogenicitet av West Nile virus (WNV) og Dengue virus (DENV). Spyttproteinet AaSG34 fremmer dengue-2-virusreplikasjon og overføring, mens spyttproteinet AaVA-1 fremmer overføring av DENV og Zika-virus (ZIKV) ved å aktivere autofagi18,19. Myggens spyttprotein D7 kan hemme DENV-infeksjon in vitro og in vivo via direkte interaksjon med DENV-virionene og det rekombinante DENV-konvoluttproteinet20. I plantevirus induserer begomovirustomatgult bladkrøllvirus (TYLCV) hvitefuglspyttproteinet Bsp9, som undertrykker den WRKY33-medierte immuniteten til planteverten, for å øke preferansen og ytelsen til hvite fluer, og til slutt øke overføringen av virus21. Fordi studier av rollen som insektspyttproteiner spiller i planteverter, har ligget bak dyrevertene, er det nødvendig med et stabilt og pålitelig system for å oppdage spyttproteiner i planteverter.
Planteviruset kjent som risdvergvirus (RDV) overføres av bladhopperen Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) med høy effektivitet og på en vedvarende forplantende måte22,23. RDV ble først rapportert å bli overført av en insektvektor og forårsaker en alvorlig sykdom av ris i Asia24,25. Virionen er icosahedral og dobbeltlags sfærisk, og det ytre laget inneholder P8 ytre kapsidprotein22. Den sirkulative overføringsperioden for RDV i N. cincticeps er 14 dager 26,27,28,29,30. Når RDV kommer til spyttkjertler, frigjøres virioner i spyttlagrede hulrom i spyttkjertlene via en eksocytoselignende mekanisme23. Vitellogenin (Vg) er eggeplommeproteinforløperen som er essensiell for oocyttutvikling hos kvinnelige insekter31,32,33. De fleste insektarter har minst ett Vg-transkript på 6-7 kb, som koder for et forløperprotein på ca. 220 kDa. Proteinforløperne til Vg kan vanligvis spaltes i store (140 til 190 kDa) og små (<50 kDa) fragmenter før de går inn i eggstokken18,19. Tidligere proteomiske analyser avslørte tilstedeværelsen av peptidene avledet fra Vg i det utskilte spyttet til bladhopperen Recilia dorsalis, selv om deres funksjon er ukjent (upubliserte data). Det er nylig rapportert at Vg, som er muntlig utskilt fra plantehoppere, fungerer som en effektor for å skade plantenes forsvar34. Det er ukjent om Vg av N. cincticeps også kunne frigjøres til planteverten med spyttstrøm, og deretter kunne spille en rolle i planten for å forstyrre planteforsvaret. For å adressere om N. cincticeps utnytter spyttproteiner, som Vg, for å hemme eller aktivere planteforsvar, er det første trinnet å identifisere proteiner som frigjøres til planten under fôring. Å forstå metoden for å identifisere spyttproteinene som er tilstede i planten er potensielt viktig for å forklare spyttproteinets funksjon og samspillet mellom Hemiptera og planter.
I protokollen som presenteres her, brukes N. cincticeps som et eksempel for å gi en metode for å undersøke tilstedeværelsen av spyttproteiner i planteverten introdusert gjennom insektfôring. Protokollen beskriver primært innsamling og påvisning av spyttproteiner og er nyttig for videre undersøkelse på de fleste hemipteraner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers and Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer</td>
			<td>Composition</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;5&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>15.1 g Tris base 
			94 g glycine 
			&#160;5 g SDS in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>200 mL of 5&#215;Tris-glycine buffer 
			800 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution, for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;Tris-buffered saline (TBS) buffer</td>
			<td>80 g NaCl 
			30 g Tris base 
			2 g KCl 
			in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS with Tween 20 (TBST) solution</td>
			<td>100 mL 10&#215;TBS solution 
			3 mL Tween 20 
			900 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#215; protein sample buffer</td>
			<td>8 g SDS 
			4 mL &#223;-mercaptoethanol 
			0.02 g bromophenol blue 
			40 mL glycerol 
			in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td></td>
			<td>For protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td>800 mL Tris-glycine buffer 
			200 mL methanol</td>
			<td></td>
			<td>For protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>PRX-1200B</td>
			<td>For rearing leafhoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis</td>
			<td>Tanon Science &#38; Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Tanon EP300</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic transfer core module</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703935</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-pass tissue grinding instrument</td>
			<td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.</td>
			<td>JXFSIPRP-24</td>
			<td>For grinding plant tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini wet heat transfer trough</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein color instrument</td>
			<td>GE Healthcare bio-sciences AB</td>
			<td>Amersham lmager 600</td>
			<td>For detecting proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical plate electrophoresis tank</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658001</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.</td>
			<td>XMTD-8222</td>
			<td>For boil the protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host

Insektvektorer overfører horisontalt mange plantevirus av landbruksmessig betydning. Mer enn halvparten av plantevirus overføres av hemipteran insekter som har piercing-sugende munndeler. Under viral overføring bygger insektspyttet bro over virusvektorverten fordi spyttvektorvirusene og insektproteinene utløser eller undertrykker immunresponsen til planter fra insekter til planteverter. Identifisering og funksjonelle analyser av spyttproteiner blir et nytt fokusområde i forskningsfeltet arbovirus-vert interaksjoner. Denne protokollen gir et system for å oppdage proteiner i spytt av bladhoppere ved hjelp av planteverten. Bladhoppervektoren Nephotettix cincticeps infisert med risdvergvirus (RDV) tjener som et eksempel. Vitellogenin og hoved ytre kapsidprotein P8 av RDV vektorert av spytt av N. cincticeps kan detekteres samtidig i risplanten som N. cincticeps spiser på . Denne metoden er anvendelig for testing av spyttproteiner som holdes forbigående i planteverten etter insektfôring. Det antas at dette deteksjonssystemet vil være til nytte for studiet av hemipteran-virus-plante- eller hemipteran-planteinteraksjoner.

Figur 1 illustrerer alle trinnene i denne protokollen: insektoppdrett, virusoppkjøp, innsamling av spyttproteiner via risfôring og western blot. De vestlige blottresultatene viste at spesifikke og forventede bånd på ca. 220 kDa ble observert i prøvene av fôring av ris og spyttkjertler av insekter på membranen inkubert med antistoffer mot Vg. Derimot ble det ikke observert noe bånd i risprøven uten fôring. Resultatet i figur 2 ...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host at JoVE.com

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Denne protokollen demonstrerer hvordan man bruker planteverten til å oppdage spyttproteiner av bladhopper og plantevirale proteiner frigjort av bladhoppervektorer.

Påvisning av virus- og spyttproteiner av en bladhoppervektor i planteverten

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Denne protokollen gir en teknikk for å oppdage spyttproteiner av bladhoppere og planteverter for å undersøke funksjonen til disse proteinene i plantevertene ytterligere. Denne teknikken er enkel å utføre og systemet er stabilt og repliserbart. Denne metoden kan også være nyttig i påvisning av spyttproteiner av andre hemiptera og planteverter.For å begynne, oppdra de voksne bladhopperne på risplanter i et 40 x 35 x 20 centimeter kubebur. Hold den ene siden av buret dekket med et insektsikkert nett for ventilasjon. Plasser burene med bladhopperne i en inkubator som inneholder en innebygd fuktighetsregulator ved 26 grader Celsius med en relativ fuktighet på 60 til 75% under en fotoperiode på 16 timer lys og åtte timer mørk.En gang i uken, bruk en aspirator for å forsiktig overføre alle voksne fra buret til et nytt bur som inneholder ferske risplanter. La mer enn 200 voksne pare seg og legge egg i risen. Behold de gamle risplantene for nymfene å dukke opp og oppdra disse nye ikke-viruliferous nymfene til det andre stjernestadiet.Bruk aspiratoren, overfør forsiktig de andre instar ikke-viruliferous nymfer til et glasskulturrør i en til to timer for sult. Slipp deretter nymfene i et bur som inneholder et risdvergvirus infisert risplante dyrket i en gryte og la nymfene mate på den infiserte risplanten i to dager. Etter to dager, overfør forsiktig disse nymfene til et nytt bur som inneholder ferske virusfrie risplanter, og la nymfene mate på virusfrie risplanter i 12 dager for å fullføre sirkulasjonsoverføringsperioden for risdvergviruset.For å samle spyttproteinene, tilbered fem små rørlignende fôringsbur dekket med insektsikker netting i den ene enden. Etter å ha begrenset 15 til 20 bladhoppere i hver fôringsbur, dekk den andre enden av buret med en tynn skummatte. Fest en risplante mellom enden av buret og en skummatte med bånd, slik at bladhopperne i fôringsburet kan mate på risplantene som er utsatt for det indre av buret.Fordyp frøplanterøttene i vann slik at risplanten forblir i live, og la bladhopperne mate på dem i to dager. Etter to dager, fjern bladhopperne fra fôringsburene og samle risplantene som bladhopperne matet på. Klipp plantene utenfor buret og gjenopprett fôringsområdene til plantene.Forbered 1x Tris-glycinbuffer ved å fortynne 200 ml av den tilberedte 5x bufferen med 800 ml sterilt vann. Forbered deretter 10x TBS-buffer og autoklav løsningen ved 121 grader Celsius i 15 minutter. Forbered deretter 4x proteinprøvebufferen.Forbered deretter overføringsbufferen ved å blande 800 ml av Tris-Glycine-bufferen med 200 ml metanol. Til slutt forbereder du TBST-løsningen ved å tilsette 100 ml 10x TBS og tre milliliter Tween 20 til 900 ml sterilt vann. For å oppdage spytt- og virusproteiner, slip 0,1 gram av risprøvene med flytende nitrogen til vevet blir et pulver.Deretter tilsettes 200 mikroliter av 4x proteinprøvebufferen til prøven og koker i 10 minutter. Sentrifuger prøvene og overfør supernatanten til et nytt hetteglass. Legg 10 mikroliter av prøven på en SDS-PAGE gel og kjør den i Tris-Glycine buffer ved 150 volt i 45 til 60 minutter.Mens gelen kjører, plasser en 0,45 mikron nitrocellulosemembran og andre sandwichforsyninger i overføringsbufferen i 30 minutter. Etter løpet, smør gelen og overfør den i 90 til 120 minutter ved 100 volt i overføringsbufferen. Etter at blottingen er fullført, plasser membranen i en 7% ikke-fett tørrmelkblokkerende løsning i TBST og inkuber i 20 minutter.Deretter legger du til et antistoff mot risdvergviruset P8 eller vitellogenin og inkuberer membranen i to timer eller over natten. Etter inkubasjonen, vask membranen med TBST tre ganger med en fem minutters inkubasjon mellom hver vask. Deretter tilsettes Geit anti-Rabbit IgG som et sekundært antistoff og inkuberer membranen i 60 til 90 minutter.Bruk ECL Western-settet til kjemiluminescerende deteksjon i reagenser med blandet deteksjon én og to i settet i forholdet én til én. Sett membranen på det blandede reagenset og inkuber flekken i fem minutter. Tøm overflødig reagens og ta et kjemiluminescerende og kolorimetrisk bilde av membranen.Kombiner bildene for å se sistnevnte med proteinbånd. Western blot-analyse for påvisning av vitellogenin viste spesifikke og forventede bånd på ca. 220 kilodalton ved fôring av risplanter og spyttkjertler hos insektene. I motsetning til dette ble det ikke observert noe bånd i de ikke-fôrende anleggene, noe som indikerer at vitellogenin ble frigjort i planteverten som et spyttprotein.Western blot-analyse for påvisning av risdvergviruset P8-proteinet viste et spesifikt og forventet bånd på ca. 46 kilodalton i fôringsplanter og viruliferøse insektlegemer. I motsetning til dette ble det ikke observert noe bånd i ikke-fôringsanlegg og ikke-viruliferøse bladhopperlegemer, noe som viste at virusproteinene også kunne påvises i fôringsanleggene. Den virale belastningen i bladhopperne, deteksjonstidspunktet og replikatene bør tas i betraktning når du utfører denne protokollen.Denne metoden kan også brukes til å studere mygg som overfører arbovirus.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic bioassay som et screeningverktøy for vertsplanten flyktige

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Glycan Profilering av Plant Cell Wall Polymers med Mikromatriser

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex produksjonsplattform på EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Måling av osmosevann permeabilitetskoeffisient (P<sub&gt; F</sub&gt;) Av sfæriske Cells: Isolerte Plant Protoplaster som et eksempel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Høy throughput CRISPR Vector Konstruksjon og karakterisering av DNA-Modifikasjoner av Generation of Tomato Hårete Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fett kroppen Organ kultur-systemet i Aedes Aegypti, en vektor av Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...