Name: detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host
Uploaded: 2021-09-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (31772124 и 31972239) и Фуцзяньского университета сельского и лесного хозяйства (грант KSYLX014).

Невирусоносные взрослые цикадки были размножены в Исследовательском центре трансмиссивных вирусов в Фуцзяньском университете сельского и лесного хозяйства, Китай.
1. Выращивание невирулиферных насекомых
<ol><li>Выращивайте взрослых особей на рассаде риса в кубической к...

<ol>
	<li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Cranston, P. S., Gullan, P. J., Resh, V. H., Carde, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+of+insects.">Phylogeny of insects.</a> Encyclopedia of Insects. , (2003).</li><li>Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts.">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laccase-type+phenoloxidase+in+salivary+glands+and+watery+saliva+of+the+green+rice+leafhopper,+Nephotettix+cincticeps.">Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps.</a> Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).</li><li>Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+pectinesterase+and+polygalacturonase+from+salivary+secretions+of+living+greenbugs,+schizaphis+graminum+(Homoptera:+aphididae).">Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae).</a> Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).</li><li>Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+aspects+of+the+chemical+relation+between+the+rose+aphid+and+rose+buds.">Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).</li><li>Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+oxidising+enzymes+in+the+grain+aphid's+saliva.">Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).</li><li>Miles, P. W., Peng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+salivary+physiology+of+plant+bugs:+detoxification+of+phytochemicals+by+the+salivary+peroxidase+of+aphids.">Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids.</a> Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).</li><li>Will, T., van Bel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+interactions+between+aphids+and+plants.">Physical and chemical interactions between aphids and plants.</a> Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).</li><li>Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+loss+in+a+greenbug-susceptible+sorghum+due+to+pectinases+and+pectin+fragments.">Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments.</a> Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).</li><li>Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+salivary+components+as+a+possible+reason+for+differences+in+the+responses+of+alfalfa+to+the+spotted+alfalfa+aphid+and+pea+aphid.">Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).</li><li>Funk, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase+activity+in+whitefly+salivary+glands+and+saliva.">Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva.</a> Archives of Insect Biochemistry &amp; Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant-insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant-insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-layered+mechanistic+modelling+approach+to+understand+how+effector+genes+extend+beyond+phytoplasma+to+modulate+plant+hosts,+insect+vectors+and+the+environment.">A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).</li><li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+transcriptomic/proteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species.">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. , (2018).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant--insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant--insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mosquito+salivary+protein+promotes+flavivirus+transmission+by+activation+of+autophagy.">A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy.</a> Nature Communications. 11 (1), 260 (2020).</li><li>Sri-In, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+salivary+protein+of+Aedes+aegypti+promotes+dengue-2+virus+replication+and+transmission.">A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181 (2019).</li><li>Conway, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+D7+saliva+protein+inhibits+dengue+virus+infection.">Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941 (2016).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whitefly+effector+Bsp9+targets+host+immunity+regulator+WRKY33+to+promote+performance.">A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313 (2019).</li><li>Omura, T., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+outer+capsid+proteins+in+transmission+of+phytoreovirus+by+insect+vectors.">Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors.</a> Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).</li><li>Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+release+threshold+in+the+salivary+gland+of+leafhopper+vector+mediates+the+intermittent+transmission+of+rice+dwarf+virus.">Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 639445 (2021).</li><li>Fukushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+studies+on+the+dwarf+disease+of+rice+plant.">Further studies on the dwarf disease of rice plant.</a> Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).</li><li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+the+internal+components+of+rice+dwarf+virus.">The functional organization of the internal components of rice dwarf virus.</a> Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).</li><li>Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pns12+protein+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+formation+of+viroplasms+and+nucleation+of+viral-assembly+complexes.">Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes.</a> Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns4+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+viral+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector.</a> Virology Journal. 12, 211 (2015).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns12+of+rice+dwarf+virus+is+a+principal+regulator+for+viral+replication+and+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector.</a> Virus Research. 210, 54-61 (2015).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubules+of+plant+reoviruses+exploit+tropomodulin+to+regulate+actin-based+tubule+motility+in+insect+vector.">Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector.</a> Scientific Reports. 7, 38563 (2017).</li><li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Rice+dwarf+virus+among+cells+of+its+insect+vector+exploits+virus-induced+tubular+structures.">The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures.</a> Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).</li><li>Mao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+bacterial+symbiont-mediated+vitellogenin+uptake+into+oocytes+to+support+egg+development.">Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development.</a> mBio. 11 (6), 01142 (2020).</li><li>Tufail, M., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins.">Molecular characteristics of insect vitellogenins.</a> Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).</li><li>Sappington, T. W., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins+and+vitellogenin+receptors.">Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).</li><li>Ji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitellogenin+from+planthopper+oral+secretion+acts+as+a+novel+effector+to+impair+plant+defenses.">Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses.</a> New Phytologist. , (2021).</li></ol>

Слюна, непосредственно выделяемая слюнными железами колюще-сосущих, играет ключевую роль, поскольку она предварительно переваривает и детоксифицирует ткани хозяина и межцарственные биологические факторы переносчиков в хозяев 1,3,4. Б?...

Способ передачи арбовирусов от вектора-хозяина, фундаментальная проблема, находится на переднем крае биологической науки. Многие вирусы растений, имеющие сельскохозяйственное значение, передаются по горизонтали насекомыми-переносчиками1. Более половины вирусов растений являются переносчиками полужесткокрылых насекомых, включая тлю, белокрылку, цикадку, кузнечиков и трипсов. Эти насекомые обладают отличительными особенностями, которые позволяют им эффективно передавать вирусы растений1. Они обладают колюще-сосущим ротовым аппаратом и питаются соком из флоэмы и ксилемы, а также выделяют свою слюну 1,2,3,4. С развитием и совершенствованием методов идентификация и функциональный анализ компонентов слюны становятся новым направлением интенсивных исследований. Известные белки слюны в слюне включают многочисленные ферменты, такие как пектинэстераза, целлюлаза, пероксидаза, щелочная фосфатаза, полифенолоксидаза и сахараза, среди прочего 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Белки в слюне также включают элиситоры, которые запускают защитную реакцию хозяина, тем самым изменяя производительность насекомых, и эффекторы, которые подавляют защиту хозяина, что повышает приспособленность насекомых и компоненты, которые вызывают патологические реакции хозяина14,15,16,17. Таким образом, белки слюны являются жизненно важными материалами для общения между насекомыми и хозяевами. При передаче вирусов слюна, выделяемая слюнными железами колюще-сосущих, вируленосных насекомых, также содержит вирусные белки. Вирусные компоненты используют поток слюны, чтобы выпустить их от насекомого к растению-хозяину. Таким образом, слюна насекомого соединяет тритрофическое взаимодействие вирус-вектор-хозяин. Изучение биологической функции белков слюны, выделяемых вирующими насекомыми, помогает понять взаимосвязь вирус-вектор-хозяин.
Что касается вирусов животных, то, как сообщается, слюна комаров опосредует передачу и патогенность вируса Западного Нила (ВЗН) и вируса денге (DENV). Белок слюны AaSG34 способствует репликации и передаче вируса денге-2, в то время как белок слюны AaVA-1 способствует передаче DENV и вируса Зика (ZIKV), активируя аутофагию18,19. Белок слюны D7 комаров может ингибировать инфекцию DENV in vitro и in vivo посредством прямого взаимодействия с вирионами DENV и рекомбинантным белком оболочки DENV20. В вирусах растений вирус бегомовируса желтой курчавости листьев томатов (TYLCV) индуцирует белокрылку белокрылки слюнный белокрылка Bsp9, который подавляет WRKY33-опосредованный иммунитет растения-хозяина, чтобы увеличить предпочтение и производительность белокрылки, в конечном итоге увеличивая передачу вирусов21. Поскольку исследования роли, которую белки слюны насекомых играют в растениях-хозяевах, отстают от таковых у животных-хозяев, срочно требуется стабильная и надежная система для обнаружения белков слюны в растениях-хозяевах.
Вирус растений, известный как вирус рисовой карликовости (RDV), передается цикадкой Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) с высокой эффективностью и настойчивым размножением22,23. Впервые сообщалось, что RDV передается насекомым-переносчиком и вызывает тяжелое заболевание риса в Азии24,25. Вирион икосаэдрический и двухслойный сферический, а внешний слой содержит белок внешнего капсидаP8 22. Период циркуляционной передачи РДВ при N. cincticeps составляет 14 дней 26,27,28,29,30. Когда RDV достигает слюнных желез, вирионы высвобождаются в слюнные полости в слюнных железах с помощью экзоцитозоподобного механизма23. Вителлогенин (Vg) является предшественником белка желтка, необходимого для развития ооцитов у самок насекомых31,32,33. Большинство видов насекомых имеют, по крайней мере, один транскрипт Vg размером 6-7 кб, который кодирует белок-предшественник примерно 220 кДа. Белковые предшественники Vg обычно могут быть расщеплены на крупные (от 140 до 190 кДа) и мелкие (<50 кДа) фрагменты перед попаданием в яичник18,19. Предыдущий протеомный анализ выявил присутствие пептидов, полученных из Vg, в секретируемой слюне цикадки Recilia dorsalis, хотя их функция неизвестна (неопубликованные данные). Недавно сообщалось, что Vg, который перорально секретируется из кузнечиков, функционирует как эффектор, повреждая защитные силы растений34. Неизвестно, может ли Vg N. cincticeps также высвобождаться в растение-хозяина с потоком слюны, а затем может играть роль в растении, мешая защите растений. Чтобы выяснить, использует ли N. cincticeps белки слюны, такие как Vg, для ингибирования или активации защиты растений, первым шагом является идентификация белков, высвобождаемых растению во время кормления. Понимание метода идентификации белков слюны, присутствующих в растении, потенциально необходимо для объяснения функции белков слюны и взаимодействия между полужесткокрылыми и растениями.
В протоколе, представленном здесь, N. cincticeps используется в качестве примера для обеспечения метода изучения присутствия белков слюны в растении-хозяине, введенном через кормление насекомыми. Протокол в первую очередь детализирует сбор и обнаружение белков слюны и полезен для дальнейшего исследования большинства полужесткокрылых.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers and Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer</td>
			<td>Composition</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;5&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>15.1 g Tris base 
			94 g glycine 
			&#160;5 g SDS in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>200 mL of 5&#215;Tris-glycine buffer 
			800 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution, for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;Tris-buffered saline (TBS) buffer</td>
			<td>80 g NaCl 
			30 g Tris base 
			2 g KCl 
			in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS with Tween 20 (TBST) solution</td>
			<td>100 mL 10&#215;TBS solution 
			3 mL Tween 20 
			900 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#215; protein sample buffer</td>
			<td>8 g SDS 
			4 mL &#223;-mercaptoethanol 
			0.02 g bromophenol blue 
			40 mL glycerol 
			in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td></td>
			<td>For protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td>800 mL Tris-glycine buffer 
			200 mL methanol</td>
			<td></td>
			<td>For protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>PRX-1200B</td>
			<td>For rearing leafhoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis</td>
			<td>Tanon Science &#38; Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Tanon EP300</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic transfer core module</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703935</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-pass tissue grinding instrument</td>
			<td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.</td>
			<td>JXFSIPRP-24</td>
			<td>For grinding plant tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini wet heat transfer trough</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein color instrument</td>
			<td>GE Healthcare bio-sciences AB</td>
			<td>Amersham lmager 600</td>
			<td>For detecting proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical plate electrophoresis tank</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658001</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.</td>
			<td>XMTD-8222</td>
			<td>For boil the protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host

Насекомые-переносчики горизонтально переносят многие вирусы растений, имеющие сельскохозяйственное значение. Более половины вирусов растений передаются полужесткокрылыми насекомыми, имеющими колюще-сосущий ротовой аппарат. Во время передачи вируса слюна насекомого соединяет вирус-вектор-хозяина, потому что вирусы-переносчики слюны и белки насекомых запускают или подавляют иммунный ответ растений от насекомых к растениям-хозяевам. Идентификация и функциональный анализ белков слюны становятся новым направлением в области исследований взаимодействий арбовируса и хозяина. Этот протокол предоставляет систему для обнаружения белков в слюне цикадок с использованием растения-хозяина. В качестве примера можно привести переносчик цикадок Nephotettix cincticeps, зараженный вирусом рисовой карликовости (RDV). Вителлогенин и основной наружный капсидный белок P8 RDV, векторизуемые слюной N. cincticeps, могут быть обнаружены одновременно в рисовом растении, которым питается N. cincticeps. Этот метод применим для тестирования белков слюны, которые временно сохраняются в растении-хозяине после кормления насекомыми. Считается, что эта система обнаружения будет полезна для изучения взаимодействий между полужесткокрылыми и растениями или полужесткокрылыми и растениями.

На рисунке 1 показаны все этапы этого протокола: выращивание насекомых, приобретение вируса, сбор белков слюны посредством кормления рисом и вестерн-блоттинг. Результаты вестерн-блоттинга показали, что специфические и ожидаемые полосы примерно 220 кДа наблюдались в...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host at JoVE.com

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Этот протокол демонстрирует, как использовать растение-хозяина для обнаружения белков слюны цикадки и вирусных белков растений, высвобождаемых векторами цикадки.

Обнаружение вирусов и белков слюны переносчика цикадки в растении-хозяине

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Этот протокол обеспечивает метод обнаружения белков слюны цикадок и растений-хозяев для дальнейшего исследования функции этих белков в растениях-хозяевах. Этот метод прост в исполнении, а система стабильна и воспроизводима. Этот метод также может быть полезен при обнаружении белков слюны других полужесткокрылых и растений-хозяев.Для начала выращивайте взрослых цикадок на рассаде риса в кубической клетке размером 40 на 35 на 20 сантиметров. Держите одну сторону клетки закрытой сеткой от насекомых для вентиляции. Поместите клетки с цикадками в инкубатор со встроенным регулятором влажности при температуре 26 градусов Цельсия с относительной влажностью от 60 до 75% при периоде фотосъемки 16 часов света и восьми часов темноты.Раз в неделю используйте аспиратор, чтобы аккуратно перенести всех взрослых особей из клетки в новую клетку со свежими рассадами риса. Позвольте более чем 200 взрослым особям спариваться и откладывать яйца в рис. Сохраните старые проростки риса, чтобы нимфы появились, и вырастите этих новых невирулиферных нимф до стадии второго возраста.С помощью аспиратора осторожно перенесите второстепенных невирулиферных нимф в стеклянную культуральную трубку на один-два часа для голодания. Затем отпустите нимф в клетку, содержащую зараженное вирусом риса рисовое растение, выращенное в горшке, и позвольте нимфам питаться зараженным рисовым растением в течение двух дней. Через два дня осторожно перенесите этих нимф в новую клетку, содержащую свежие проростки риса без вирусов, и позвольте нимфам питаться проростками риса без вирусов в течение 12 дней, чтобы завершить период циркуляции вируса рисовой карликовости.Чтобы собрать белки слюны, подготовьте пять небольших трубчатых кормовых клеток, покрытых сеткой от насекомых на одном конце. Поместив от 15 до 20 цикадок в каждую кормовую клетку, накройте другой конец клетки тонким поролоновым ковриком. Закрепите один саженец риса между концом клетки и пенопластовым ковриком с помощью лент, убедившись, что цикадки в кормовой клетке могут питаться рассадой риса, находящейся внутри клетки.Погрузите корни саженца в воду, чтобы рисовое растение осталось живым, и дайте цикадкам питаться ими в течение двух дней. Через два дня извлеките цикадок из кормовых клеток и соберите рассаду риса, которой кормились цикадки. Вырежьте саженцы за пределами клетки и восстановите места питания рассады.Приготовьте 1x трис-глициновый буфер, разбавив 200 миллилитров подготовленного 5-кратного буфера 800 миллилитрами стерильной воды. Затем приготовьте 10-кратный буфер TBS и автоклавируйте раствор при температуре 121 градус Цельсия в течение 15 минут. Затем подготовьте 4-кратный буфер для образцов белка.Затем приготовьте буфер переноса, смешав 800 миллилитров трис-глицинового буфера с 200 миллилитрами метанола. Наконец, приготовьте раствор TBST, добавив 100 миллилитров 10x TBS и три миллилитра Tween от 20 до 900 миллилитров стерильной воды. Чтобы обнаружить слюнные и вирусные белки, измельчите 0,1 грамма образцов риса с жидким азотом до тех пор, пока ткань не превратится в порошок.Затем добавьте 200 микролитров 4-кратного буфера для образцов белка в образец и кипятите в течение 10 минут. Центрифугируют образцы и переносят надосадочную жидкость в новый флакон. Загрузите 10 микролитров образца в гель SDS-PAGE и запустите его в буфере Tris-Glycine при напряжении 150 вольт в течение 45–60 минут.Пока гель работает, поместите нитроцеллюлозную мембрану 0,45 микрона и другие сэндвич-материалы в буфер для переноса на 30 минут. После пробежки сэндвичьте гель и перенесите его на 90-120 минут при напряжении 100 вольт в буфер переноса. После завершения блоттинга поместите мембрану в 7%-ный обезжиренный раствор для блокировки сухого молока в TBST и инкубируйте в течение 20 минут.После этого добавляют антитело против вируса рисового карлика Р8 или вителлогенин и инкубируют мембрану в течение двух часов или в течение ночи. После инкубации промойте мембрану TBST три раза с пятиминутной инкубацией между каждой промывкой. Затем добавьте козий антикроличий IgG в качестве вторичного антитела и инкубируйте мембрану в течение 60-90 минут.Используйте набор ECL Western для хемилюминесцентного детектирования в смешанных реагентах обнаружения один и два в наборе в соотношении один к одному. Наденьте мембрану на смешанный реагент и инкубируйте кляксу в течение пяти минут. Слейте излишки реагента и сделайте хемилюминесцентный и колориметрический снимок мембраны.Объедините картинки, чтобы увидеть последние с белковыми полосами. Вестерн-блоттинг для обнаружения вителлогенина показал специфические и ожидаемые полосы примерно в 220 килодальтон в питающихся рисовых растениях и слюнных железах насекомых. Напротив, у растений, не питающихся, полосы не наблюдалось, что указывает на то, что вителлогенин высвобождался в растении-хозяине в виде белка слюны.Вестерн-блоттинг для обнаружения белка P8 вируса карликового риса показал специфическую и ожидаемую полосу примерно в 46 килодальтон в питающихся растениях и вирулентных телах насекомых. Напротив, полоса не наблюдалась у непитающихся растений и невирулиферных тел цикадки, что доказывает, что вирусные белки также могут быть обнаружены в питающихся растениях. При выполнении этого протокола следует учитывать вирусную нагрузку в цикадках, время обнаружения и репликации.Этот метод также может быть применен для изучения комаров, передающих арбовирусы.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Препарирование Средняя кишка и слюнных желез от Ae. aegypti комаров

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Вирус-индуцированные генов (VIGS) в Nicotiana benthamiana И томатный

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Агробактериальной вирус-индуцированного Пробирной Отключение гена В Хлопок

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic биопроб в качестве скринингового инструмента для летучих растения-хозяина

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Glycan Профилирование Plant Cell стены полимеров с использованием Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

MultiBac белкового комплекса добывающей платформы на EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Измерение осмотического водопроницаемость Коэффициент (P<sub&gt; F</sub&gt;) Из сферических ячеек: изолированные протопласты растений в качестве примера

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Высокая пропускная способность CRISPR Конструирование вектора и характеристика ДНК Модификации генерацией Томатный волосистых корней

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Жир тела орган культуры системы в Aedes Aegypti, вектор вируса Зика

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Прямая агроинокуляция саженцев кукурузы путем инъекции рекомбинантного вируса мозаики лисохвоста и инфекционного клона вируса мозаики сахарного тростника