Name: detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host
Uploaded: 2021-09-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31772124 y 31972239) y la Universidad de Agricultura y Silvicultura de Fujian (subvención KSYLX014).

Los saltahojas adultos no virulíferos se propagaron en el Centro de Investigación de Virus Transmitidos por Vectores en la Universidad de Agricultura y Silvicultura de Fujian, China.
1. Cría de insectos no virulíferos
<ol><li>Críe a los adultos en plántulas de arroz en una jaula cúbica de 40 cm x 35 cm x 20 cm (largo x ancho x alto). Mantenga un lado de la jaula cubierto con una red a prueba de insectos para ventilación.<ol><li>Mantener las jaulas con saltahojas en una incubadora que...

<ol>
	<li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Cranston, P. S., Gullan, P. J., Resh, V. H., Carde, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+of+insects.">Phylogeny of insects.</a> Encyclopedia of Insects. , (2003).</li><li>Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts.">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laccase-type+phenoloxidase+in+salivary+glands+and+watery+saliva+of+the+green+rice+leafhopper,+Nephotettix+cincticeps.">Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps.</a> Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).</li><li>Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+pectinesterase+and+polygalacturonase+from+salivary+secretions+of+living+greenbugs,+schizaphis+graminum+(Homoptera:+aphididae).">Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae).</a> Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).</li><li>Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+aspects+of+the+chemical+relation+between+the+rose+aphid+and+rose+buds.">Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).</li><li>Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+oxidising+enzymes+in+the+grain+aphid's+saliva.">Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).</li><li>Miles, P. W., Peng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+salivary+physiology+of+plant+bugs:+detoxification+of+phytochemicals+by+the+salivary+peroxidase+of+aphids.">Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids.</a> Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).</li><li>Will, T., van Bel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+interactions+between+aphids+and+plants.">Physical and chemical interactions between aphids and plants.</a> Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).</li><li>Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+loss+in+a+greenbug-susceptible+sorghum+due+to+pectinases+and+pectin+fragments.">Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments.</a> Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).</li><li>Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+salivary+components+as+a+possible+reason+for+differences+in+the+responses+of+alfalfa+to+the+spotted+alfalfa+aphid+and+pea+aphid.">Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).</li><li>Funk, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase+activity+in+whitefly+salivary+glands+and+saliva.">Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva.</a> Archives of Insect Biochemistry &amp; Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant-insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant-insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-layered+mechanistic+modelling+approach+to+understand+how+effector+genes+extend+beyond+phytoplasma+to+modulate+plant+hosts,+insect+vectors+and+the+environment.">A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).</li><li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+transcriptomic/proteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species.">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. , (2018).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant--insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant--insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mosquito+salivary+protein+promotes+flavivirus+transmission+by+activation+of+autophagy.">A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy.</a> Nature Communications. 11 (1), 260 (2020).</li><li>Sri-In, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+salivary+protein+of+Aedes+aegypti+promotes+dengue-2+virus+replication+and+transmission.">A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181 (2019).</li><li>Conway, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+D7+saliva+protein+inhibits+dengue+virus+infection.">Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941 (2016).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whitefly+effector+Bsp9+targets+host+immunity+regulator+WRKY33+to+promote+performance.">A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313 (2019).</li><li>Omura, T., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+outer+capsid+proteins+in+transmission+of+phytoreovirus+by+insect+vectors.">Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors.</a> Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).</li><li>Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+release+threshold+in+the+salivary+gland+of+leafhopper+vector+mediates+the+intermittent+transmission+of+rice+dwarf+virus.">Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 639445 (2021).</li><li>Fukushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+studies+on+the+dwarf+disease+of+rice+plant.">Further studies on the dwarf disease of rice plant.</a> Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).</li><li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+the+internal+components+of+rice+dwarf+virus.">The functional organization of the internal components of rice dwarf virus.</a> Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).</li><li>Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pns12+protein+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+formation+of+viroplasms+and+nucleation+of+viral-assembly+complexes.">Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes.</a> Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns4+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+viral+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector.</a> Virology Journal. 12, 211 (2015).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns12+of+rice+dwarf+virus+is+a+principal+regulator+for+viral+replication+and+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector.</a> Virus Research. 210, 54-61 (2015).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubules+of+plant+reoviruses+exploit+tropomodulin+to+regulate+actin-based+tubule+motility+in+insect+vector.">Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector.</a> Scientific Reports. 7, 38563 (2017).</li><li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Rice+dwarf+virus+among+cells+of+its+insect+vector+exploits+virus-induced+tubular+structures.">The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures.</a> Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).</li><li>Mao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+bacterial+symbiont-mediated+vitellogenin+uptake+into+oocytes+to+support+egg+development.">Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development.</a> mBio. 11 (6), 01142 (2020).</li><li>Tufail, M., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins.">Molecular characteristics of insect vitellogenins.</a> Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).</li><li>Sappington, T. W., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins+and+vitellogenin+receptors.">Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).</li><li>Ji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitellogenin+from+planthopper+oral+secretion+acts+as+a+novel+effector+to+impair+plant+defenses.">Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses.</a> New Phytologist. , (2021).</li></ol>

La saliva secretada directamente por las glándulas salivales de los insectos perforadores-chupadores juega un papel fundamental porque predigiere y desintoxica los tejidos del huésped y los factores biológicos de los vectores en los huéspedes 1,3,4. Los factores biológicos entre reinos, incluyendo elicitores, efectores y ARN pequeño, son críticos para la comunicación insecto-huésped14,15,16<...

El modo de transmisión vector-huésped de los arbovirus, un problema fundamental, está en la frontera de la ciencia biológica. Muchos virus vegetales de importancia agrícola son transmitidos horizontalmente por insectos vectores1. Más de la mitad de los virus de las plantas son vectorizados por insectos hemípteros, incluidos pulgones, moscas blancas, saltahojas, saltamontes y trips. Estos insectos tienen características distintivas que les permiten transmitir eficientemente los virus de las plantas1. Poseen piezas bucales perforadoras-chupadoras y se alimentan de la savia del floema y el xilema, y secretan su saliva 1,2,3,4. Con el desarrollo y la mejora de las técnicas, la identificación y el análisis funcional de los componentes salivales se están convirtiendo en un nuevo foco de investigación intensiva. Las proteínas salivales conocidas en la saliva incluyen numerosas enzimas, como pectinesterasa, celulasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, polifenol oxidasa y sacarasa, entre otras 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Las proteínas en la saliva también incluyen elicitores que desencadenan la respuesta de defensa del huésped, alterando así el rendimiento de los insectos, y efectores que suprimen la defensa del huésped, lo que mejora la aptitud del insecto y los componentes que inducen respuestas patológicas del huésped14,15,16,17. Por lo tanto, las proteínas de la saliva son materiales vitales para la comunicación entre insectos y huéspedes. Durante la transmisión de virus, la saliva secretada por las glándulas salivales de los insectos virulíferos penetrantes y chupadores también contiene proteínas virales. Los componentes virales utilizan el flujo de saliva para liberarlos del insecto al huésped de la planta. Por lo tanto, la saliva del insecto une la interacción tritrófica virus-vector-huésped. Investigar la función biológica de las proteínas de la saliva secretadas por insectos virulíferos ayuda a comprender la relación virus-vector-huésped.
Para los virus animales, se informa que la saliva de los mosquitos media la transmisión y patogenicidad del virus del Nilo Occidental (VNO) y el virus del dengue (DENV). La proteína salival AaSG34 promueve la replicación y transmisión del virus del dengue-2, mientras que la proteína salival AaVA-1 promueve la transmisión del virus DENV y Zika (ZIKV) mediante la activación de la autofagia18,19. La proteína salival D7 de los mosquitos puede inhibir la infección por DENV in vitro e in vivo a través de la interacción directa con los viriones DENV y la proteína20 de la envoltura DENV recombinante. En virus vegetales, el begomovirus tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) induce la proteína salival de mosca blanca Bsp9, que suprime la inmunidad mediada por WRKY33 de la planta huésped, para aumentar la preferencia y el rendimiento de las moscas blancas, aumentando eventualmente la transmisión de virus21. Debido a que los estudios sobre el papel que desempeñan las proteínas salivales de los insectos en los huéspedes de las plantas se han quedado atrás de los de los huéspedes animales, se requiere urgentemente un sistema estable y confiable para detectar las proteínas salivales en los huéspedes de las plantas.
El virus vegetal conocido como virus enano del arroz (RDV) es transmitido por el saltahojas Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) con alta eficiencia y de manera persistentemente propagativa22,23. Se informó por primera vez que el RDV era transmitido por un insecto vector y causa una enfermedad grave del arroz en Asia24,25. El virión es icosaédrico y esférico de doble capa, y la capa externa contiene la proteína22 de la cápside externa P8. El período de transmisión circulativa de RDV en N. cincticeps es de 14 días 26,27,28,29,30. Cuando el RDV llega a las glándulas salivales, los viriones se liberan en las cavidades almacenadas en saliva en las glándulas salivales a través de un mecanismo similar a la exocitosis23. La vitelogenina (Vg) es el precursor proteico vitelino esencial para el desarrollo de ovocitos en insectos hembra31,32,33. La mayoría de las especies de insectos tienen al menos una transcripción Vg de 6-7 kb, que codifica una proteína precursora de aproximadamente 220 kDa. Los precursores proteicos de Vg generalmente se pueden escindir en fragmentos grandes (140 a 190 kDa) y pequeños (<50 kDa) antes de ingresar al ovario18,19. Análisis proteómicos previos revelaron la presencia de los péptidos derivados de Vg en la saliva secretada del saltahojas Recilia dorsalis, aunque se desconoce su función (datos inéditos). Se ha informado recientemente que Vg, que es secretada por vía oral de los saltamontes, funciona como un efector para dañar las defensas de las plantas34. Se desconoce si el Vg de N. cincticeps también podría liberarse al huésped de la planta con flujo salival, y luego podría desempeñar un papel en la planta para interferir con las defensas de la planta. Para abordar si N. cincticeps explota proteínas salivales, como Vg, para inhibir o activar las defensas de la planta, el primer paso es identificar las proteínas liberadas a la planta durante la alimentación. Comprender el método para identificar las proteínas salivales presentes en la planta es potencialmente esencial para explicar la función de las proteínas de la saliva y las interacciones entre los hemípteros y las plantas.
En el protocolo presentado aquí, N. cincticeps se utiliza como ejemplo para proporcionar un método para examinar la presencia de proteínas salivales en la planta huésped introducidas a través de la alimentación de insectos. El protocolo detalla principalmente la recolección y detección de proteínas salivales y es útil para una mayor investigación en la mayoría de los hemípteros.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers and Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer</td>
			<td>Composition</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;5&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>15.1 g Tris base 
			94 g glycine 
			&#160;5 g SDS in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>200 mL of 5&#215;Tris-glycine buffer 
			800 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution, for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;Tris-buffered saline (TBS) buffer</td>
			<td>80 g NaCl 
			30 g Tris base 
			2 g KCl 
			in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS with Tween 20 (TBST) solution</td>
			<td>100 mL 10&#215;TBS solution 
			3 mL Tween 20 
			900 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#215; protein sample buffer</td>
			<td>8 g SDS 
			4 mL &#223;-mercaptoethanol 
			0.02 g bromophenol blue 
			40 mL glycerol 
			in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td></td>
			<td>For protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td>800 mL Tris-glycine buffer 
			200 mL methanol</td>
			<td></td>
			<td>For protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>PRX-1200B</td>
			<td>For rearing leafhoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis</td>
			<td>Tanon Science &#38; Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Tanon EP300</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic transfer core module</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703935</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-pass tissue grinding instrument</td>
			<td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.</td>
			<td>JXFSIPRP-24</td>
			<td>For grinding plant tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini wet heat transfer trough</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein color instrument</td>
			<td>GE Healthcare bio-sciences AB</td>
			<td>Amersham lmager 600</td>
			<td>For detecting proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical plate electrophoresis tank</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658001</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.</td>
			<td>XMTD-8222</td>
			<td>For boil the protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host

Los insectos vectores transmiten horizontalmente muchos virus vegetales de importancia agrícola. Más de la mitad de los virus de las plantas son transmitidos por insectos hemípteros que tienen piezas bucales perforadoras y chupadoras. Durante la transmisión viral, la saliva del insecto une el virus-vector-huésped porque los vectores de saliva los virus, y las proteínas del insecto, desencadenan o suprimen la respuesta inmune de las plantas de los insectos a los huéspedes de las plantas. La identificación y el análisis funcional de las proteínas salivales se están convirtiendo en una nueva área de enfoque en el campo de investigación de las interacciones arbovirus-huésped. Este protocolo proporciona un sistema para detectar proteínas en la saliva de los saltahojas utilizando la planta huésped. El vector saltahojas Nephotettix cincticeps infectado con el virus enano del arroz (RDV) sirve como ejemplo. La vitelogenina y la principal proteína P8 de la cápside externa del RDV vectorizada por la saliva de N. cincticeps se pueden detectar simultáneamente en la planta de arroz de la que se alimenta N. cincticeps. Este método es aplicable para probar las proteínas salivales que se retienen transitoriamente en el huésped de la planta después de la alimentación de insectos. Se cree que este sistema de detección beneficiará el estudio de las interacciones hemíptero-virus-planta o hemíptero-planta.

La Figura 1 ilustra todos los pasos de este protocolo: la cría de insectos, la adquisición de virus, la recolección de proteínas salivales a través de la alimentación con arroz y el western blot. Los resultados de Western blots mostraron que se observaron bandas específicas y esperadas de aproximadamente 220 kDa en las muestras de arroz y glándulas salivales de alimentación de insectos en la membrana incubada con anticuerpos contra Vg. En contraste, no se observó ninguna b...

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Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Este protocolo demuestra cómo usar la planta huésped para detectar proteínas salivales de saltahojas y proteínas virales vegetales liberadas por vectores saltahojas.

Detección de virus y proteínas salivales de un vector saltahojas en el huésped vegetal

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Este protocolo proporciona una técnica para detectar las proteínas salivales de los saltahojas y los huéspedes de plantas para investigar más a fondo la función de estas proteínas en los huéspedes de la planta. Esta técnica es fácil de realizar y el sistema es estable y replicable. Este método también podría ser útil en la detección de proteínas salivales de otros hemípteros y huéspedes vegetales.Para comenzar, críe los saltahojas adultos en las plántulas de arroz en una jaula cúbica de 40 por 35 por 20 centímetros. Mantenga un lado de la jaula cubierto con una red a prueba de insectos para ventilación. Coloque las jaulas con los saltahojas en una incubadora que contenga un controlador de humedad incorporado a 26 grados centígrados con una humedad relativa del 60 al 75% bajo un período fotográfico de 16 horas de luz y ocho horas de oscuridad.Una vez a la semana, use un aspirador para transferir suavemente a todos los adultos de su jaula a una nueva jaula que contenga plántulas de arroz fresco. Permita que más de 200 adultos se apareen y pongan huevos en el arroz. Retenga las viejas plántulas de arroz para que emerjan las ninfas y críe a estas nuevas ninfas no virulíferas a la segunda etapa de estadio.Usando el aspirador, transfiera cuidadosamente las ninfas no virulíferas del segundo estadio a un tubo de cultivo de vidrio durante una o dos horas para la inanición. Luego libere a las ninfas en una jaula que contenga una planta de arroz infectada con el virus enano del arroz cultivada en una maceta y permita que las ninfas se alimenten de la planta de arroz infectada durante dos días. Después de dos días, transfiera cuidadosamente estas ninfas a una nueva jaula que contenga plántulas de arroz frescas libres de virus, y permita que las ninfas se alimenten de las plántulas de arroz libres de virus durante 12 días para completar el período de transmisión circulativa del virus enano del arroz.Para recolectar las proteínas salivales, prepare cinco pequeñas jaulas de alimentación en forma de tubería cubiertas con redes a prueba de insectos en un extremo. Después de confinar de 15 a 20 saltahojas en cada jaula de alimentación, cubra el otro extremo de la jaula con una estera de espuma delgada. Fije una plántula de arroz entre el extremo de la jaula y una estera de espuma con cintas, asegurándose de que los saltahojas en la jaula de alimentación puedan alimentarse de las plántulas de arroz expuestas al interior de la jaula.Sumerja las raíces de las plántulas en agua para que la planta de arroz permanezca viva y permita que los saltahojas se alimenten de ellas durante dos días. Después de dos días, retire los saltahojas de sus jaulas de alimentación y recoja las plántulas de arroz de las que se alimentaban los saltahojas. Cortar las plántulas fuera de la jaula y recuperar las regiones de alimentación de las plántulas.Prepare 1x tampón de Tris-Glicina diluyendo 200 mililitros del tampón 5x preparado con 800 mililitros de agua estéril. Luego prepare el tampón 10x TBS y autoclave la solución a 121 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, prepare el tampón de muestra de proteína 4x.Luego prepare el tampón de transferencia mezclando 800 mililitros del tampón Tris-Glycine con 200 mililitros de metanol. Finalmente, prepare la solución TBST agregando 100 mililitros de 10x TBS y tres mililitros de Tween 20 a 900 mililitros de agua estéril. Para detectar las proteínas salivales y virales, muele 0,1 gramos de las muestras de arroz con nitrógeno líquido hasta que el tejido se convierta en polvo.Luego agregue 200 microlitros del tampón de muestra de proteína 4x a la muestra y hierva durante 10 minutos. Centrifugar las muestras y transferir el sobrenadante a un nuevo vial. Cargue 10 microlitros de la muestra en un gel SDS-PAGE y ejecútela en tampón Tris-Glycine a 150 voltios durante 45 a 60 minutos.Mientras el gel está funcionando, coloque una membrana de nitrocelulosa de 0,45 micras y otros suministros de sándwich en el tampón de transferencia durante 30 minutos. Después de la ejecución, emparede el gel y transfiéralo durante 90 a 120 minutos a 100 voltios en el búfer de transferencia. Después de completar la secación, coloque la membrana en una solución de bloqueo de leche en polvo sin grasa al 7% en TBST e incube durante 20 minutos.Después de eso, agregue un anticuerpo contra el virus enano del arroz P8 o vitelogenina e incube la membrana durante dos horas o durante la noche. Después de la incubación, lave la membrana con TBST tres veces con una incubación de cinco minutos entre cada lavado. Luego agregue IgG anti-conejo de cabra como anticuerpo secundario e incube la membrana durante 60 a 90 minutos.Utilice el kit ECL Western para la detección quimioluminiscente en reactivos de detección mixtos uno y dos en el kit en una proporción de uno a uno. Coloque la membrana sobre el reactivo mezclado e incube la seca durante cinco minutos. Drene el exceso de reactivo y tome una imagen quimioluminiscente y colorimétrica de la membrana.Combine las imágenes para ver este último con bandas de proteínas. El análisis de Western blot para la detección de vitelogenina mostró bandas específicas y esperadas de aproximadamente 220 kilodaltons en la alimentación de plantas de arroz y glándulas salivales de los insectos. En contraste, no se observó banda en las plantas que no se alimentaban, lo que indica que la vitelogenina se liberó en el huésped de la planta como una proteína salival.El análisis de Western blot para la detección de la proteína P8 del virus enano del arroz mostró una banda específica y esperada de aproximadamente 46 kilodaltons en plantas de alimentación y cuerpos de insectos viruliferos. En contraste, no se observó ninguna banda en plantas no alimentadas y cuerpos de saltahojas no viruliferos, lo que demuestra que las proteínas virales también podrían detectarse en las plantas de alimentación. La carga viral en los saltahojas, el momento de detección y las réplicas deben tenerse en cuenta al realizar este protocolo.Este método también se puede aplicar para estudiar mosquitos que transmiten arbovirus.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

La disección de las glándulas salivales y del intestino medio de Ae. aegypti

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Investigación

Biología

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) en Nicotiana benthamiana Y tomate

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Mediada por Agrobacterium inducida por el virus Gene ensayo silenciamiento en algodón

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Bioensayo electroantenográfico como herramienta de detección de compuestos volátiles de las plantas hospederas

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Perfiles de Polímeros Glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

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Medición de la osmótica de agua Coeficiente de Permeabilidad (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos de plantas aisladas como ejemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

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De alto rendimiento CRISPR vector de la construcción y caracterización de las modificaciones del ADN mediante la generación de raíces peludas tomate

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

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Sistema de cultivo de órganos de grasa corporal en Aedes Aegypti, Vector del Virus Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Agroinoculación directa de plántulas de maíz por inyección con clones infecciosos recombinantes del virus del mosaico de la cola de zorro y virus del mosaico de la caña de azúcar