Name: detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host
Uploaded: 2021-09-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (31772124 och 31972239) och Fujian Agriculture and Forestry University (Grant KSYLX014).

De icke-viruliferösa vuxna bladhopparna förökades i Vector-borne Virus Research Center i Fujian Agriculture and Forestry University, Kina.
1. Icke-viruliferös insektsuppfödning
<ol><li>Föd upp de vuxna på risplantor i en kubbur som är 40 cm x 35 cm x 20 cm (längd x bredd x höjd). Håll ena sidan av buret täckt med ett insektssäkert nät för ventilation.<ol><li>Förvara burarna med lövhoppare i en inkubator som innehåller en inbyggd fuktighetsregulator vid 26 °C med en relativ...

<ol>
	<li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Cranston, P. S., Gullan, P. J., Resh, V. H., Carde, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+of+insects.">Phylogeny of insects.</a> Encyclopedia of Insects. , (2003).</li><li>Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts.">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laccase-type+phenoloxidase+in+salivary+glands+and+watery+saliva+of+the+green+rice+leafhopper,+Nephotettix+cincticeps.">Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps.</a> Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).</li><li>Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+pectinesterase+and+polygalacturonase+from+salivary+secretions+of+living+greenbugs,+schizaphis+graminum+(Homoptera:+aphididae).">Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae).</a> Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).</li><li>Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+aspects+of+the+chemical+relation+between+the+rose+aphid+and+rose+buds.">Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).</li><li>Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+oxidising+enzymes+in+the+grain+aphid's+saliva.">Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).</li><li>Miles, P. W., Peng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+salivary+physiology+of+plant+bugs:+detoxification+of+phytochemicals+by+the+salivary+peroxidase+of+aphids.">Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids.</a> Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).</li><li>Will, T., van Bel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+interactions+between+aphids+and+plants.">Physical and chemical interactions between aphids and plants.</a> Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).</li><li>Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+loss+in+a+greenbug-susceptible+sorghum+due+to+pectinases+and+pectin+fragments.">Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments.</a> Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).</li><li>Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+salivary+components+as+a+possible+reason+for+differences+in+the+responses+of+alfalfa+to+the+spotted+alfalfa+aphid+and+pea+aphid.">Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).</li><li>Funk, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase+activity+in+whitefly+salivary+glands+and+saliva.">Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva.</a> Archives of Insect Biochemistry &amp; Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant-insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant-insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-layered+mechanistic+modelling+approach+to+understand+how+effector+genes+extend+beyond+phytoplasma+to+modulate+plant+hosts,+insect+vectors+and+the+environment.">A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).</li><li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+transcriptomic/proteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species.">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. , (2018).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant--insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant--insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mosquito+salivary+protein+promotes+flavivirus+transmission+by+activation+of+autophagy.">A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy.</a> Nature Communications. 11 (1), 260 (2020).</li><li>Sri-In, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+salivary+protein+of+Aedes+aegypti+promotes+dengue-2+virus+replication+and+transmission.">A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181 (2019).</li><li>Conway, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+D7+saliva+protein+inhibits+dengue+virus+infection.">Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941 (2016).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whitefly+effector+Bsp9+targets+host+immunity+regulator+WRKY33+to+promote+performance.">A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313 (2019).</li><li>Omura, T., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+outer+capsid+proteins+in+transmission+of+phytoreovirus+by+insect+vectors.">Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors.</a> Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).</li><li>Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+release+threshold+in+the+salivary+gland+of+leafhopper+vector+mediates+the+intermittent+transmission+of+rice+dwarf+virus.">Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 639445 (2021).</li><li>Fukushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+studies+on+the+dwarf+disease+of+rice+plant.">Further studies on the dwarf disease of rice plant.</a> Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).</li><li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+the+internal+components+of+rice+dwarf+virus.">The functional organization of the internal components of rice dwarf virus.</a> Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).</li><li>Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pns12+protein+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+formation+of+viroplasms+and+nucleation+of+viral-assembly+complexes.">Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes.</a> Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns4+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+viral+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector.</a> Virology Journal. 12, 211 (2015).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns12+of+rice+dwarf+virus+is+a+principal+regulator+for+viral+replication+and+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector.</a> Virus Research. 210, 54-61 (2015).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubules+of+plant+reoviruses+exploit+tropomodulin+to+regulate+actin-based+tubule+motility+in+insect+vector.">Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector.</a> Scientific Reports. 7, 38563 (2017).</li><li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Rice+dwarf+virus+among+cells+of+its+insect+vector+exploits+virus-induced+tubular+structures.">The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures.</a> Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).</li><li>Mao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+bacterial+symbiont-mediated+vitellogenin+uptake+into+oocytes+to+support+egg+development.">Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development.</a> mBio. 11 (6), 01142 (2020).</li><li>Tufail, M., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins.">Molecular characteristics of insect vitellogenins.</a> Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).</li><li>Sappington, T. W., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins+and+vitellogenin+receptors.">Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).</li><li>Ji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitellogenin+from+planthopper+oral+secretion+acts+as+a+novel+effector+to+impair+plant+defenses.">Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses.</a> New Phytologist. , (2021).</li></ol>

Saliven som utsöndras direkt av spottkörtlarna hos de piercing-sugande insekterna spelar en avgörande roll eftersom den försmälter och avgiftar värdvävnaderna och vektorernas biologiska faktorer över riket till värdarna 1,3,4. De biologiska faktorerna mellan riket, inklusive elicitorer, effektorer och små RNA, är kritiska för insekt-värdkommunikation14,15,16...

Vektor-värdöverföringsläget för arbovirus, ett grundläggande problem, ligger vid gränsen för biologisk vetenskap. Många växtvirus av jordbruksbetydelse överförs horisontellt av insektsvektorer1. Mer än hälften av växtvirus vektoriseras av hemipteraninsekter, inklusive bladlöss, vitflugor, bladhoppare, växthoppare och thrips. Dessa insekter har distinkta egenskaper som gör det möjligt för dem att effektivt överföra växtvirus1. De har piercing-sugande munstycken och matar på saften från floem och xylem och utsöndrar sin saliv 1,2,3,4. Med utveckling och förbättring av tekniker blir identifiering och funktionella analyser av salivkomponenter ett nytt fokus för intensiv forskning. De kända salivproteinerna i saliv inkluderar många enzymer, såsom pektinesteras, cellulas, peroxidas, alkaliskt fosfatas, polyfenoloxidas och sukras, bland annat 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Proteinerna i saliv inkluderar också elicitorer som utlöser värdförsvarssvaret, vilket förändrar insekternas prestanda och effektorer som undertrycker värdförsvaret, vilket förbättrar insektskondition och komponenter som inducerar värdpatologiska svar14,15,16,17. Därför är salivproteiner viktiga material för kommunikation mellan insekter och värdar. Under överföringen av virus innehåller salivet som utsöndras av spytkörtlarna hos piercing-sugande viruliferösa insekter också virala proteiner. Virala komponenter utnyttjar salivflödet för att frigöra dem från insekten till växtvärden. Därför överbryggar insektsaliven virus-vektor-värdens tritrofiska interaktion. Att undersöka den biologiska funktionen hos salivproteiner som utsöndras av viruliferösa insekter hjälper till att förstå förhållandet mellan virus-vektor-värd.
För djurvirus rapporteras att saliv från myggor förmedlar överföring och patogenicitet av West Nile-virus (WNV) och Dengue-virus (DENV). Salivproteinet AaSG34 främjar replikation och överföring av dengue-2-virus, medan salivproteinet AaVA-1 främjar överföring av DENV- och Zika-virus (ZIKV) genom att aktivera autofagi18,19. Salivproteinet D7 från myggor kan hämma DENV-infektion in vitro och in vivo via direkt interaktion med DENV-virionerna och rekombinant DENV-höljeprotein20. I växtvirus inducerar begomovirus tomat yellow leaf curl virus (TYLCV) whitefly salivproteinet Bsp9, som undertrycker WRKY33-medierad immunitet hos växtvärden, för att öka preferensen och prestandan hos vitflugor, vilket så småningom ökar överföringen av virus21. Eftersom studier av den roll som insektssalivproteiner spelar i växtvärdar har släpat efter djurvärdarnas, krävs ett stabilt och pålitligt system för att detektera salivproteinerna i växtvärdar.
Det växtvirus som kallas risdvärgvirus (RDV) överförs av bladhopparen Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) med hög effektivitet och på ett ihållande förökningssätt22,23. RDV rapporterades först överföras av en insektsvektor och orsakar en allvarlig sjukdom av ris i Asien24,25. Virionen är ikosaedrisk och dubbelskiktad sfärisk, och det yttre skiktet innehåller P8 yttre kapsidprotein22. Den cirkulerande överföringsperioden för RDV i N. cincticeps är 14 dagar 26,27,28,29,30. När RDV anländer till spottkörtlarna släpps virioner ut i salivlagrade håligheter i spottkörtlarna via en exocytosliknande mekanism23. Vitellogenin (Vg) är den äggulaproteinprekursor som är väsentlig för äggcellsutveckling hos kvinnliga insekter31,32,33. De flesta insektsarter har minst ett Vg-transkript på 6-7 kb, vilket kodar för ett prekursorprotein på cirka 220 kDa. Proteinprekursorerna till Vg kan vanligtvis klyvas i stora (140 till 190 kDa) och små (<50 kDa) fragment innan de kommer in i äggstocken18,19. Tidigare proteomisk analys avslöjade närvaron av peptiderna härledda från Vg i den utsöndrade saliven från bladhopparen Recilia dorsalis, även om deras funktion är okänd (opublicerade data). Det rapporteras nyligen att Vg, som utsöndras oralt från växthoppare, fungerar som en effektor för att skada växternas försvar34. Det är okänt om Vg av N. cincticeps också kan släppas till växtvärden med salivflöde och sedan kan spela en roll i växten för att störa växtförsvaret. För att ta itu med huruvida N. cincticeps utnyttjar salivproteiner, såsom Vg, för att hämma eller aktivera växtförsvar, är det första steget att identifiera proteiner som frigörs till växten under utfodring. Att förstå metoden för att identifiera salivproteinerna som finns i växten är potentiellt avgörande för att förklara funktionen av salivproteiner och interaktionerna mellan Hemiptera och växter.
I protokollet som presenteras här används N. cincticeps som ett exempel för att tillhandahålla en metod för att undersöka närvaron av salivproteiner i växtvärden som introduceras genom insektsfoder. Protokollet beskriver främst insamling och detektion av salivproteiner och är till hjälp för vidare undersökning på de flesta hemipteraner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers and Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer</td>
			<td>Composition</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;5&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>15.1 g Tris base 
			94 g glycine 
			&#160;5 g SDS in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>200 mL of 5&#215;Tris-glycine buffer 
			800 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution, for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;Tris-buffered saline (TBS) buffer</td>
			<td>80 g NaCl 
			30 g Tris base 
			2 g KCl 
			in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS with Tween 20 (TBST) solution</td>
			<td>100 mL 10&#215;TBS solution 
			3 mL Tween 20 
			900 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#215; protein sample buffer</td>
			<td>8 g SDS 
			4 mL &#223;-mercaptoethanol 
			0.02 g bromophenol blue 
			40 mL glycerol 
			in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td></td>
			<td>For protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td>800 mL Tris-glycine buffer 
			200 mL methanol</td>
			<td></td>
			<td>For protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>PRX-1200B</td>
			<td>For rearing leafhoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis</td>
			<td>Tanon Science &#38; Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Tanon EP300</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic transfer core module</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703935</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-pass tissue grinding instrument</td>
			<td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.</td>
			<td>JXFSIPRP-24</td>
			<td>For grinding plant tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini wet heat transfer trough</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein color instrument</td>
			<td>GE Healthcare bio-sciences AB</td>
			<td>Amersham lmager 600</td>
			<td>For detecting proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical plate electrophoresis tank</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658001</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.</td>
			<td>XMTD-8222</td>
			<td>For boil the protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host

Insektsvektorer överför horisontellt många växtvirus av jordbruksbetydelse. Mer än hälften av växtvirus överförs av hemipteraninsekter som har piercing-sugande mundelar. Under virusöverföring överbryggar insektsaliven virusvektorvärden eftersom salivvektorerna virus och insektsproteinerna utlöser eller undertrycker immunsvaret hos växter från insekter till växtvärdar. Identifiering och funktionella analyser av salivproteiner blir ett nytt fokusområde inom forskningsområdet arbovirus-värdinteraktioner. Detta protokoll tillhandahåller ett system för att detektera proteiner i saliv av bladhoppare med hjälp av växtvärden. Bladhoppvektorn Nephotettix cincticeps infekterad med risdvärgvirus (RDV) fungerar som ett exempel. Vitellogenin och det stora yttre kapsidproteinet P8 av RDV som vektoriseras av saliven av N. cincticeps kan detekteras samtidigt i risplantan som N. cincticeps matar på . Denna metod är tillämplig för att testa salivproteinerna som tillfälligt hålls kvar i växtvärden efter insektsmatning. Man tror att detta detekteringssystem kommer att gynna studien av hemipteran-virus-växt eller hemipteran-växtinteraktioner.

Figur 1 illustrerar alla steg i detta protokoll: insektsuppfödning, virusförvärv, insamling av salivproteiner via rismatning och western blot. Resultaten från western blots visade att specifika och förväntade band på cirka 220 kDa observerades i proverna för utfodring av ris och spottkörtlar av insekter på membranet inkuberade med antikroppar mot Vg. Däremot observerades inget band i det icke-matande risprovet. Resultatet i figur 2</s...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host at JoVE.com

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Detta protokoll visar hur man använder växtvärden för att detektera salivproteiner från bladhoppare och växtvirusproteiner som frigörs av bladhopparvektorer.

Detektering av virus- och salivproteiner från en bladhoppvektor i växtvärden

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Detta protokoll tillhandahåller en teknik för att detektera salivproteinerna hos bladhoppare och växtvärdar för att ytterligare undersöka funktionen av dessa proteiner i växtvärdarna. Denna teknik är enkel att utföra och systemet är stabilt och replikerbart. Denna metod kan också vara till hjälp vid detektion av salivproteiner från andra hemiptera och växtvärdar.För att börja, baka de vuxna bladhopparna på risplantor i en kubbur på 40 x 35 x 20 centimeter. Håll ena sidan av buret täckt med ett insektssäkert nät för ventilation. Placera burarna med lövhopparna i en inkubator som innehåller en inbyggd fuktighetsregulator vid 26 grader Celsius med en relativ fuktighet på 60 till 75% under en fotoperiod på 16 timmar ljus och åtta timmar mörk.En gång i veckan, använd en sugare för att försiktigt överföra alla vuxna från buren till en ny bur som innehåller färska risplantor. Låt mer än 200 vuxna para sig och lägga ägg i riset. Behåll de gamla risplantorna för nymferna att dyka upp och baka dessa nya icke-viruliferösa nymfer till det andra instarstadiet.Använd sugatorn och överför försiktigt de andra instar icke-viruliferösa nymferna till ett glaskulturrör i en till två timmar för svält. Släpp sedan nymferna i en bur som innehåller en risdvärgvirusinfekterad risväxt odlad i en kruka och låt nymferna mata på den infekterade risplantan i två dagar. Efter två dagar, överför försiktigt dessa nymfer till en ny bur som innehåller färska virusfria risplantor och låt nymferna mata på de virusfria risplantorna i 12 dagar för att slutföra den cirkulerande överföringsperioden för risdvärgviruset.För att samla salivproteinerna, förbered fem små rörliknande matningsburar täckta med insektssäkert nät i ena änden. Efter att ha begränsat 15 till 20 bladhoppare i varje matningsbur, täck den andra änden av buret med en tunn skummatta. Fixa en risplanta mellan slutet av buret och en skummatta med band, så att bladhopparna i matningsburet kan mata på risplantorna utsatta för burets inre.Sänk ner plantans rötter i vatten så att risplantan förblir levande och låt bladhopparna mata på dem i två dagar. Efter två dagar, ta bort bladhopparna från sina matningsburar och samla risplantorna som bladhopparna matade på. Skär plantorna utanför buret och återställ plantornas utfodringsområden.Förbered 1x Tris-glycinbuffert genom att späda 200 ml av den beredda 5x bufferten med 800 ml sterilt vatten. Förbered sedan 10x TBS-buffert och autoklavera lösningen vid 121 grader Celsius i 15 minuter. Förbered sedan 4x proteinprovbufferten.Förbered sedan överföringsbufferten genom att blanda 800 ml Tris-glycinbuffert med 200 ml metanol. Slutligen förbered TBST-lösningen genom att tillsätta 100 ml 10x TBS och tre milliliter Tween 20 till 900 ml sterilt vatten. För att detektera saliv- och virusproteinerna, slipa 0,1 gram risprover med flytande kväve tills vävnaden blir ett pulver.Tillsätt sedan 200 mikroliter av 4x proteinprovbufferten till provet och koka i 10 minuter. Centrifugera proverna och överför supernatanten till en ny injektionsflaska. Ladda 10 mikroliter av provet på en SDS-PAGE-gel och kör den i Tris-glycinbuffert vid 150 volt i 45 till 60 minuter.Medan gelén är igång, placera ett 0,45 mikron nitrocellulosamembran och andra smörgåstillbehör i överföringsbufferten i 30 minuter. Efter körningen, smörj gelén och överför den i 90 till 120 minuter vid 100 volt i överföringsbufferten. När blottningen är klar, placera membranet i en 7% fettfri torrmjölksblockerande lösning i TBST och inkubera i 20 minuter.Därefter tillsätt en antikropp mot risdvärgviruset P8 eller vitellogenin och inkubera membranet i två timmar eller över natten. Efter inkubationen, tvätta membranet med TBST tre gånger med en fem minuters inkubation mellan varje tvätt. Tillsätt sedan getantikanin IgG som en sekundär antikropp och inkubera membranet i 60 till 90 minuter.Använd ECL Western-satsen för kemiluminescerande detektion i blandade detektionsreagens ett och två i satsen i förhållandet en-till-en. Sätt membranet på det blandade reagenset och inkubera blottan i fem minuter. Töm överskottsreagenset och ta en kemiluminescerande och kolorimetrisk bild av membranet.Kombinera bilderna för att se den senare med proteinband. Western blot-analys för detektion av vitellogenin visade specifika och förväntade band på cirka 220 kilodalton vid utfodring av risväxter och spottkörtlar hos insekterna. Däremot observerades inget band i de icke-matande växterna, vilket indikerar att vitellogenin släpptes i växtvärden som ett salivprotein.Western blot-analys för detektion av risdvärgvirus P8-proteinet visade ett specifikt och förväntat band på cirka 46 kilodalton i utfodringsväxter och viruliferösa insektskroppar. Däremot observerades inget band i icke-matande växter och icke-viruliferösa bladhopparkroppar, vilket bevisar att virusproteinerna också kunde detekteras i utfodringsanläggningarna. Virusbelastningen i bladhopparna, detekteringstiden och replikaten bör beaktas när detta protokoll utförs.Denna metod kan också tillämpas för att studera myggor som överför arbovirus.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Dissekering av midgut och spottkörtlar från AE. aegypti Myggor

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-inducerad geners uttryck (VIGS) i Nicotiana benthamiana Och Tomat

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium-medierad virusinducerade geners uttryck test på Bomull

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic Biotest som screeningmetod för flyktiga ämnen värdväxt

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Glykan Profilering av växtcellväggnedbrytande Polymerer med Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex Production Platform vid EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Mätning av det osmotiska Vatten permeabilitetskoefficienten (P<sub&gt; F</sub&gt;) Av Sfäriska Celler: isolerade växtprotoplaster som exempel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Hög genomströmning crispr Vektorkonstruktion och karakterisering av DNA Ändringar av Generation tomat håriga Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fett kroppen kultur organsystem i Aedes Aegypti, en vektor av zikaviruset

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...