Name: detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host
Uploaded: 2021-09-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31772124 ve 31972239) ve Fujian Tarım ve Ormancılık Üniversitesi'nden (Grant KSYLX014) gelen hibelerle desteklenmiştir.

Virülifer olmayan yetişkin yaprakçıklar, Çin'deki Fujian Tarım ve Ormancılık Üniversitesi'ndeki Vektör Kaynaklı Virüs Araştırma Merkezi'nde çoğaltıldı.
1. Virülifer olmayan böcek yetiştiriciliği
<ol><li>Yetişkinleri pirinç fideleri üzerinde 40 cm x 35 cm x 20 cm (uzunluk x genişlik x yükseklik) olan bir küp kafeste arkadan yerleştirin. Havalandırma için kafesin bir tarafını böcek geçirmez bir ağ ile örtün.<ol><li>Yaprakçıklı kafesleri, 16 saat ışık...

<ol>
	<li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses.">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li><li>Cranston, P. S., Gullan, P. J., Resh, V. H., Carde, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+of+insects.">Phylogeny of insects.</a> Encyclopedia of Insects. , (2003).</li><li>Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts.">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li><li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rice+reoviruses+in+insect+vectors.">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li><li>Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laccase-type+phenoloxidase+in+salivary+glands+and+watery+saliva+of+the+green+rice+leafhopper,+Nephotettix+cincticeps.">Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps.</a> Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).</li><li>Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+pectinesterase+and+polygalacturonase+from+salivary+secretions+of+living+greenbugs,+schizaphis+graminum+(Homoptera:+aphididae).">Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae).</a> Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).</li><li>Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+aspects+of+the+chemical+relation+between+the+rose+aphid+and+rose+buds.">Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).</li><li>Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+oxidising+enzymes+in+the+grain+aphid's+saliva.">Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).</li><li>Miles, P. W., Peng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+salivary+physiology+of+plant+bugs:+detoxification+of+phytochemicals+by+the+salivary+peroxidase+of+aphids.">Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids.</a> Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).</li><li>Will, T., van Bel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+interactions+between+aphids+and+plants.">Physical and chemical interactions between aphids and plants.</a> Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).</li><li>Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+loss+in+a+greenbug-susceptible+sorghum+due+to+pectinases+and+pectin+fragments.">Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments.</a> Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).</li><li>Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+salivary+components+as+a+possible+reason+for+differences+in+the+responses+of+alfalfa+to+the+spotted+alfalfa+aphid+and+pea+aphid.">Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).</li><li>Funk, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase+activity+in+whitefly+salivary+glands+and+saliva.">Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva.</a> Archives of Insect Biochemistry &amp; Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant-insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant-insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-layered+mechanistic+modelling+approach+to+understand+how+effector+genes+extend+beyond+phytoplasma+to+modulate+plant+hosts,+insect+vectors+and+the+environment.">A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).</li><li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+transcriptomic/proteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species.">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. , (2018).</li><li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+proteins+that+modulate+plant--insect+interactions.">Effector proteins that modulate plant--insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li><li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mosquito+salivary+protein+promotes+flavivirus+transmission+by+activation+of+autophagy.">A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy.</a> Nature Communications. 11 (1), 260 (2020).</li><li>Sri-In, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+salivary+protein+of+Aedes+aegypti+promotes+dengue-2+virus+replication+and+transmission.">A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181 (2019).</li><li>Conway, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+D7+saliva+protein+inhibits+dengue+virus+infection.">Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941 (2016).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whitefly+effector+Bsp9+targets+host+immunity+regulator+WRKY33+to+promote+performance.">A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313 (2019).</li><li>Omura, T., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+outer+capsid+proteins+in+transmission+of+phytoreovirus+by+insect+vectors.">Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors.</a> Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).</li><li>Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+release+threshold+in+the+salivary+gland+of+leafhopper+vector+mediates+the+intermittent+transmission+of+rice+dwarf+virus.">Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 639445 (2021).</li><li>Fukushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+studies+on+the+dwarf+disease+of+rice+plant.">Further studies on the dwarf disease of rice plant.</a> Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).</li><li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+the+internal+components+of+rice+dwarf+virus.">The functional organization of the internal components of rice dwarf virus.</a> Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).</li><li>Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pns12+protein+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+formation+of+viroplasms+and+nucleation+of+viral-assembly+complexes.">Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes.</a> Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns4+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+viral+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector.</a> Virology Journal. 12, 211 (2015).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstructural+protein+Pns12+of+rice+dwarf+virus+is+a+principal+regulator+for+viral+replication+and+infection+in+its+insect+vector.">Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector.</a> Virus Research. 210, 54-61 (2015).</li><li>Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubules+of+plant+reoviruses+exploit+tropomodulin+to+regulate+actin-based+tubule+motility+in+insect+vector.">Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector.</a> Scientific Reports. 7, 38563 (2017).</li><li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Rice+dwarf+virus+among+cells+of+its+insect+vector+exploits+virus-induced+tubular+structures.">The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures.</a> Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).</li><li>Mao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+bacterial+symbiont-mediated+vitellogenin+uptake+into+oocytes+to+support+egg+development.">Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development.</a> mBio. 11 (6), 01142 (2020).</li><li>Tufail, M., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins.">Molecular characteristics of insect vitellogenins.</a> Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).</li><li>Sappington, T. W., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins+and+vitellogenin+receptors.">Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).</li><li>Ji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitellogenin+from+planthopper+oral+secretion+acts+as+a+novel+effector+to+impair+plant+defenses.">Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses.</a> New Phytologist. , (2021).</li></ol>

Delici emici böceklerin tükürük bezleri tarafından doğrudan salgılanan tükürük çok önemli bir rol oynar, çünkü konakçı dokuları ve vektörlerin krallıklar arası biyolojik faktörlerini konakçılara önceden sindirir ve detoksifiye eder 1,3,4. Elicitors, efektörler ve küçük RNA dahil olmak üzere krallıklar arası biyolojik faktörler, böcek-konakçı iletişimi için kritik öneme sahiptir<sup class="x...

Temel bir problem olan arbovirüslerin vektör-konakçı iletim modu, biyoloji biliminin sınırındadır. Tarımsal öneme sahip birçok bitki virüsü, böcek vektörleri1 tarafından yatay olarak bulaşır. Bitki virüslerinin yarısından fazlası, yaprak bitleri, beyaz sinekler, yaprakçıklar, planthoppers ve thrips dahil olmak üzere hemipteran böcekler tarafından vektörleştirilir. Bu böcekler, bitki virüslerini verimli bir şekilde iletmelerini sağlayan farklı özelliklere sahiptir1. Delici emici ağız kısımlarına sahiptirler ve floem ve ksilemden gelen özsu ile beslenirler ve tükürüklerini 1,2,3,4 salgılarlar. Tekniklerin geliştirilmesi ve iyileştirilmesiyle, tükürük bileşenlerinin tanımlanması ve fonksiyonel analizleri yoğun araştırmaların yeni bir odağı haline gelmektedir. Tükürükteki bilinen tükürük proteinleri, diğerlerinin yanı sıra pektinesteraz, selülaz, peroksidaz, alkali fosfataz, polifenol oksidaz ve sukraz gibi çok sayıda enzim içerir 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Tükürükteki proteinler ayrıca konakçı savunma tepkisini tetikleyen, böylece böceklerin performansını değiştiren elisitörleri ve konakçı savunmasını baskılayan efektörleri içerir, bu da böcek uygunluğunu arttırır ve konakçı patolojik yanıtlarını indükleyen bileşenler14,15,16,17. Bu nedenle, tükürük proteinleri böcekler ve konakçılar arasındaki iletişim için hayati öneme sahip malzemelerdir. Virüslerin bulaşması sırasında, delici emici virülifer böceklerin tükürük bezleri tarafından salgılanan tükürük de viral proteinler içerir. Viral bileşenler, onları böcekten bitki konağına serbest bırakmak için tükürük akışını kullanır. Bu nedenle, böcek tükürüğü virüs-vektör-konakçı tritrofik etkileşimini köprüler. Virülifer böcekler tarafından salgılanan tükürük proteinlerinin biyolojik fonksiyonunun araştırılması, virüs-vektör-konakçı ilişkisinin anlaşılmasına yardımcı olur.
Hayvan virüsleri için, sivrisineklerin tükürüğünün Batı Nil virüsü (WNV) ve Dang virüsünün (DENV) bulaşmasına ve patojenitesine aracılık ettiği bildirilmektedir. Tükürük proteini AaSG34, dang humması-2 virüsü replikasyonunu ve iletimini teşvik ederken, tükürük proteini AaVA-1, otofajiyi aktive ederek DENV ve Zika virüsü (ZIKV) bulaşmasını teşvik eder18,19. Sivrisineklerin tükürük proteini D7, DENV viryonları ve rekombinant DENV zarf proteini20 ile doğrudan etkileşim yoluyla in vitro ve in vivo DENV enfeksiyonunu inhibe edebilir. Bitki virüslerinde, begomovirüs domates sarı yaprak kıvrılma virüsü (TYLCV), beyaz sineklerin tercihini ve performansını arttırmak için bitki konağının WRKY33 aracılı bağışıklığını baskılayan beyaz sinek tükürük proteini Bsp9'u indükler ve sonunda virüslerin bulaşmasını arttırır21. Böcek tükürük proteinlerinin bitki konakçılarında oynadığı rol üzerine yapılan çalışmalar, hayvan konakçılarınınkinin gerisinde kaldığından, bitki konakçılarındaki tükürük proteinlerini tespit etmek için kararlı ve güvenilir bir sisteme acilen ihtiyaç duyulmaktadır.
Pirinç cüce virüsü (RDV) olarak bilinen bitki virüsü, yaprak haznesi Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) tarafından yüksek verimlilikle ve sürekli çoğalan bir şekilde bulaşır22,23. RDV'nin ilk olarak bir böcek vektörü tarafından bulaştığı ve Asya'da ciddi bir pirinç hastalığına neden olduğu bildirilmiştir24,25. Virion ikosahedral ve çift katmanlı küreseldir ve dış tabaka P8 dış kapsid proteini22'yi içerir. N. cinctiaceps'te RDV'nin dolaşım süresi 14 gün 26,27,28,29,30'dur. RDV tükürük bezlerine ulaştığında, virionlar ekzositoz benzeri bir mekanizma 23 aracılığıyla tükürük bezlerindeki tükürük depolanan boşluklara salınır. Vitellogenin (Vg), dişi böceklerde oosit gelişimi için gerekli olan yumurta sarısı proteini öncüsüdür31,32,33. Çoğu böcek türü, yaklaşık 220 kDa'lık bir öncü proteini kodlayan 6-7 kb'lik en az bir Vg transkriptine sahiptir. Vg'nin protein öncülleri genellikle yumurtalık 18,19'a girmeden önce büyük (140 ila 190 kDa) ve küçük (<50 kDa) parçalara ayrılabilir. Önceki proteomik analiz, Vg'den türetilen peptitlerin, işlevleri bilinmemekle birlikte, yaprakçık Recilia dorsalis'in salgılanan tükürüğünde varlığını ortaya koymuştur (yayınlanmamış veriler). Bitkilerden ağızdan salgılanan Vg'nin, bitkilerin savunmalarına zarar vermek için bir efektör olarak işlev gördüğü yeni bildirilmiştir34. N. cinctiaces'in Vg'sinin tükürük akışıyla bitki konakçısına da salınıp bırakılamayacağı ve daha sonra bitki savunmasına müdahale etmek için bitkide rol oynayıp oynayamayacağı bilinmemektedir. N. cinctiaceps'in bitki savunmasını inhibe etmek veya aktive etmek için Vg gibi tükürük proteinlerini kullanıp kullanmadığını ele almak için ilk adım, beslenme sırasında bitkiye salınan proteinleri tanımlamaktır. Bitkide bulunan tükürük proteinlerini tanımlama yöntemini anlamak, tükürük proteinlerinin işlevini ve Hemiptera ile bitkiler arasındaki etkileşimleri açıklamak için potansiyel olarak gereklidir.
Burada sunulan protokolde, N. cinctiacps , böcek besleme yoluyla tanıtılan bitki konakçısında tükürük proteinlerinin varlığını incelemek için bir yöntem sağlamak için bir örnek olarak kullanılmıştır. Protokol öncelikle tükürük proteinlerinin toplanmasını ve tespitini detaylandırır ve çoğu hemipteran üzerinde daha fazla araştırma için yararlıdır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5&#215;Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4&#215; protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffers and Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer</td>
			<td>Composition</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;5&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>15.1 g Tris base 
			94 g glycine 
			&#160;5 g SDS in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Tris-glycine buffer</td>
			<td>200 mL of 5&#215;Tris-glycine buffer 
			800 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution, for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;Tris-buffered saline (TBS) buffer</td>
			<td>80 g NaCl 
			30 g Tris base 
			2 g KCl 
			in 1 L sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS with Tween 20 (TBST) solution</td>
			<td>100 mL 10&#215;TBS solution 
			3 mL Tween 20 
			900 mL sterile water</td>
			<td></td>
			<td>Work solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#215; protein sample buffer</td>
			<td>8 g SDS 
			4 mL &#223;-mercaptoethanol 
			0.02 g bromophenol blue 
			40 mL glycerol 
			in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)</td>
			<td></td>
			<td>For protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td>800 mL Tris-glycine buffer 
			200 mL methanol</td>
			<td></td>
			<td>For protein transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHBL3668</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature incubator</td>
			<td>Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>PRX-1200B</td>
			<td>For rearing leafhoppers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis</td>
			<td>Tanon Science &#38; Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Tanon EP300</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoretic transfer core module</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703935</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10010618</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBD0677V</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>D110058-0001</td>
			<td>Recognization of the primary andtibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-pass tissue grinding instrument</td>
			<td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.</td>
			<td>JXFSIPRP-24</td>
			<td>For grinding plant tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10016318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10014118</td>
			<td>For transfer buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini wet heat transfer trough</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703930</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10019318</td>
			<td>For 10x TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>25312915</td>
			<td>For proteins transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Becton.Dickinso and company</td>
			<td>252038</td>
			<td>For membrane blocking, antibodies dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32209</td>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein color instrument</td>
			<td>GE Healthcare bio-sciences AB</td>
			<td>Amersham lmager 600</td>
			<td>For detecting proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLCB4394</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>D609K69032</td>
			<td>For 5x Tris-glycine buffer and 10&#215;TBS buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Coolaber SCIENCE&#38;TeCHNoLoGY</td>
			<td>CT30111220</td>
			<td>For TBST preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical plate electrophoresis tank</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658001</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.</td>
			<td>XMTD-8222</td>
			<td>For boil the protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Xiya Reagent</td>
			<td>B14492</td>
			<td>For 4x protein sample buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting virus and salivary proteins of a leafhopper vector in the plant host

Böcek vektörleri yatay olarak tarımsal öneme sahip birçok bitki virüsünü iletir. Bitki virüslerinin yarısından fazlası, delici emici ağız kısımlarına sahip hemipteran böcekler tarafından bulaşır. Viral bulaşma sırasında, böcek tükürüğü virüs-vektör-konakçıyı köprüler, çünkü tükürük vektörleri virüsleri ve böcek proteinleri, bitkilerin böceklerden bitki konakçılarına bağışıklık tepkisini tetikler veya bastırır. Tükürük proteinlerinin tanımlanması ve fonksiyonel analizleri, arbovirüs-konakçı etkileşimlerinin araştırma alanında yeni bir odak alanı haline gelmektedir. Bu protokol, bitki konağını kullanarak yaprakçıkların tükürüğündeki proteinleri tespit etmek için bir sistem sağlar. Pirinç cüce virüsü (RDV) ile enfekte olmuş yaprak vektörü Nephotettix cincticeps buna bir örnek teşkil eder. N. cinctiacps'ın tükürüğü tarafından vektörleştirilen RDV'nin vitellogenin ve majör dış kapsid proteini P8, N. cinctiacps'ın beslendiği pirinç bitkisinde aynı anda tespit edilebilir. Bu yöntem, böcek beslemesinden sonra bitki konakçısında geçici olarak tutulan tükürük proteinlerini test etmek için geçerlidir. Bu tespit sisteminin hemipteran-virüs-bitki veya hemipteran-bitki etkileşimlerinin incelenmesine fayda sağlayacağına inanılmaktadır.

Şekil 1, bu protokoldeki tüm adımları göstermektedir: böcek yetiştiriciliği, virüs edinimi, pirinç besleme yoluyla tükürük proteinlerinin toplanması ve batı lekesi. Batı lekeleri sonuçları, Vg'ye karşı antikorlarla inkübe edilen zardaki böceklerin pirinç ve tükürük bezlerinin beslenme örneklerinde yaklaşık 220 kDa'lık spesifik ve beklenen bantların gözlendiğini göstermiştir. Buna karşılık, beslenmeyen pirinç örneğinde bant gözlenmemiştir. <...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host at JoVE.com

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Bu protokol, yaprak haznesinin tükürük proteinlerini ve yaprak haznesi vektörleri tarafından salınan bitki viral proteinlerini tespit etmek için bitki konağının nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Bitki Konağındaki Bir Yaprakçık Vektörünün Virüs ve Tükürük Proteinlerinin Tespiti

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Bu protokol, bu proteinlerin bitki konakçılarındaki işlevini daha fazla araştırmak için yaprakçıkların ve bitki konakçılarının tükürük proteinlerini tespit etmek için bir teknik sağlar. Bu tekniğin uygulanması kolaydır ve sistem kararlı ve tekrarlanabilirdir. Bu yöntem aynı zamanda diğer hemiptera ve bitki konakçılarının tükürük proteinlerinin tespitinde de yardımcı olabilir.Başlamak için, yetişkin yaprakçıkları pirinç fideleri üzerinde 40 x 35 x 20 santimetrelik bir küp kafesinde arkanıza koyun. Havalandırma için kafesin bir tarafını böcek geçirmez bir ağ ile örtün. Kafesleri, yaprakçıklarla birlikte, 16 saat aydınlık ve sekiz saatlik karanlık bir fotoğraf periyodu altında% 60 ila% 75 bağıl nem ile 26 santigrat derecede dahili bir nem kontrolörü içeren bir inkübatöre yerleştirin.Haftada bir kez, tüm yetişkinleri kafeslerinden taze pirinç fideleri içeren yeni bir kafese nazikçe aktarmak için bir aspiratör kullanın. 200'den fazla yetişkinin çiftleşmesine ve pirinçte yumurta bırakmasına izin verin. Perileri ortaya çıkarması için eski pirinç fidelerini saklayın ve bu yeni virülifer olmayan nimfleri ikinci instar aşamasına getirin.Aspiratörü kullanarak, ikinci instar virülifer olmayan nimfleri açlık için bir ila iki saat boyunca bir cam kültür tüpüne dikkatlice aktarın. Daha sonra nimfleri bir tencerede yetişen pirinç cücesi virüsü enfekte pirinç bitkisi içeren bir kafese bırakın ve nimflerin enfekte olmuş pirinç bitkisi üzerinde iki gün boyunca beslenmelerine izin verin. İki gün sonra, bu nimfleri taze virüssüz pirinç fideleri içeren yeni bir kafese dikkatlice aktarın ve pirinç cüce virüsünün dolaşım bulaşma süresini tamamlamak için nimflerin 12 gün boyunca virüssüz pirinç fideleri üzerinde beslenmelerine izin verin.Tükürük proteinlerini toplamak için, bir ucunda böcek geçirmez ağ ile kaplı beş küçük boru benzeri besleme kafesi hazırlayın. Her besleme kafesine 15 ila 20 yaprak tutucu koyduktan sonra, kafesin diğer ucunu ince bir köpük paspas ile örtün. Bir pirinç fidesini kafesin ucu ile bantlı bir köpük paspas arasına sabitleyin ve besleme kafesindeki yaprakçıkların kafesin içine maruz kalan pirinç fideleriyle beslenebilmesini sağlayın.Fide köklerini suya batırın, böylece pirinç bitkisi canlı kalır ve yaprakçıkların iki gün boyunca beslenmelerine izin verin. İki gün sonra, yaprakçıkları besleme kafeslerinden çıkarın ve yaprakçıkların beslendiği pirinç fidelerini toplayın. Fideleri kafesin dışında kesin ve fidelerin beslenme bölgelerini geri kazanın.Hazırlanan 5x tamponun 200 mililitresini 800 mililitre steril su ile seyrelterek 1x Tris-Glisin tamponu hazırlayın. Daha sonra 10x TBS tamponu hazırlayın ve çözeltiyi 15 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklavlayın. Ardından, 4x protein numune arabelleğini hazırlayın.Daha sonra 800 mililitre Tris-Glisin tamponunu 200 mililitre metanol ile karıştırarak transfer tamponunu hazırlayın. Son olarak, 100 mililitre 10x TBS ve üç mililitre Tween 20 ila 900 mililitre steril su ekleyerek TBST çözeltisini hazırlayın. Tükürük ve viral proteinleri tespit etmek için, doku toz haline gelene kadar pirinç örneklerinin 0.1 gramını sıvı azotla öğütün.Daha sonra numuneye 4x protein numune tamponunun 200 mikrolitresini ekleyin ve 10 dakika kaynatın. Numuneleri santrifüj edin ve süpernatantı yeni bir şişeye aktarın. Numunenin 10 mikrolitresini bir SDS-PAGE jeline yükleyin ve 45 ila 60 dakika boyunca 150 voltta Tris-Glisin tamponunda çalıştırın.Jel çalışırken, 0.45 mikron nitroselüloz membranı ve diğer sandviç malzemelerini 30 dakika boyunca transfer tamponuna yerleştirin. Çalıştırmadan sonra, jeli sandviçleyin ve transfer tamponunda 100 voltta 90 ila 120 dakika boyunca aktarın. Lekeleme tamamlandıktan sonra, zarı TBST'de% 7'lik yağsız kuru süt bloke edici bir çözeltiye yerleştirin ve 20 dakika boyunca inkübe edin.Bundan sonra, pirinç cüce virüsü P8 veya vitellogenine karşı bir antikor ekleyin ve zarı iki saat veya gece boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, membranı TBST ile üç kez yıkayın ve her yıkama arasında beş dakikalık bir inkübasyon yapın. Daha sonra ikincil bir antikor olarak Goat anti-Rabbit IgG ekleyin ve zarı 60 ila 90 dakika boyunca inkübe edin.Kitteki bir ve iki karışık algılama reaktiflerinde bire bir oranında kemilüminesan algılama için ECL Western kitini kullanın. Membranı karışık reaktife koyun ve lekeyi beş dakika boyunca inkübe edin. Fazla reaktifi boşaltın ve membranın kemilüminesan ve kolorimetrik bir resmini çekin.İkincisini protein bantlarıyla görmek için resimleri birleştirin. Vitellogeninin tespiti için Batı leke analizi, pirinç bitkilerinin beslenmesinde ve böceklerin tükürük bezlerinde yaklaşık 220 kilodaltonluk spesifik ve beklenen bantlar göstermiştir. Buna karşılık, beslenmeyen bitkilerde hiçbir bant gözlenmemiştir, bu da vitellogeninin bitki konakçısında tükürük proteini olarak salındığını göstermektedir.Pirinç cüce virüsü P8 proteininin tespiti için yapılan Western leke analizi, besleme bitkilerinde ve virülifer böcek gövdelerinde yaklaşık 46 kilodaltonluk spesifik ve beklenen bir bant göstermiştir. Buna karşılık, beslenmeyen bitkilerde ve virülifer olmayan yaprak haznesi gövdelerinde hiçbir bant gözlenmemiştir, bu da viral proteinlerin besleme bitkilerinde de tespit edilebileceğini kanıtlamıştır. Bu protokol uygulanırken yaprakçıklardaki viral yükleme, tespit zamanlaması ve replikalar dikkate alınmalıdır.Bu yöntem, arbovirüsleri ileten sivrisinekleri incelemek için de uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Ae midgut ve Tükürük Bezlerinin Diseksiyon. aegypti Sivrisinekler

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virüs indüklenen gen susturma (VIGS) Nicotiana benthamiana Ve Domates

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Pamuk olarak Agrobacterium Virüs Bağlı Gen susturma Testi

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Konak Bitki uçucu için bir tarama aracı olarak Electroantennographic Biyoassay

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Mikroarray&#39;ler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Ozmotik Su Geçirgenliği Katsayısı (P Ölçme<sub&gt; F</sub&gt;) Küresel Hücreleri: Bir Örnek olarak İzole Bitki protoplastlan

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Yağ vücut Organ kültür sistemi içinde Aedes Aegypti, bir vektör Zika virüs

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...