Name: cell-free scaled production and adjuvant addition to a recombinant major outer membrane protein from chlamydia muridarum for vaccine development
Uploaded: 2022-03-16T12:30:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منحة خدمة الصحة العامة R21 AI20925 و U19 AI144184 من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية. تم تنفيذ هذا العمل تحت رعاية وزارة الطاقة الأمريكية من قبل مختبر لورانس ليفرمور الوطني بموجب العقد DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525 ، LLNL-VIDEO-832788].

<ol>
	<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li><li>Coleman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+association+of+the+Yersinia+pestis+translocon+proteins,+YopB+and+YopD,+are+facilitated+by+nanolipoprotein+particles.">Expression and association of the Yersinia pestis translocon proteins, YopB and YopD, are facilitated by nanolipoprotein particles.</a> PLoS One. 11 (3), 0150166 (2016).</li><li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein,+forming+soluble+nanolipoprotein+particles.">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+diameter,+monodispersity,+and+solubility+of+ApoA1+nanolipoprotein+particles+using+telodendrimer+chemistry.">Controlling the diameter, monodispersity, and solubility of ApoA1 nanolipoprotein particles using telodendrimer chemistry.</a> Protein Science. 22 (8), 1078-1086 (2013).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+production+of+a+functional+oligomeric+form+of+a+Chlamydia+major+outer-membrane+protein+(MOMP)+for+vaccine+development.">Cell-free production of a functional oligomeric form of a Chlamydia major outer-membrane protein (MOMP) for vaccine development.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 15121-15132 (2017).</li><li>Tifrea, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protection+in+mice+against+a+Chlamydia+muridarum+respiratory+challenge+by+a+vaccine+formulated+with+the+major+outer+membrane+protein+in+nanolipoprotein+particles.">Induction of protection in mice against a Chlamydia muridarum respiratory challenge by a vaccine formulated with the major outer membrane protein in nanolipoprotein particles.</a> Vaccines. 9 (7), 755 (2021).</li><li>Cleveland, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+X-ray+and+neutron+scattering+demonstrates+that+cell-free+expression+produces+properly+formed+disc-shaped+nanolipoprotein+particles.">Small-angle X-ray and neutron scattering demonstrates that cell-free expression produces properly formed disc-shaped nanolipoprotein particles.</a> Protein Science. 27 (3), 780-789 (2018).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+to+nickel-chelating+nanolipoprotein+particles+increases+the+potency+and+efficacy+of+subunit+vaccines+to+prevent+West+Nile+encephalitis.">Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (6), 1018-1022 (2010).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalized+delivery+of+adjuvant+and+antigen+using+nanolipoprotein+particles+enhances+the+immune+response+to+recombinant+antigens.">Colocalized delivery of adjuvant and antigen using nanolipoprotein particles enhances the immune response to recombinant antigens.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (6), 2044-2047 (2013).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanolipoprotein+particles+(NLPs)+as+an+in+vivo+delivery+platform.">Evaluation of nanolipoprotein particles (NLPs) as an in vivo delivery platform.</a> PLoS One. 9 (3), 93342 (2014).</li><li>Pal, S., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+the+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein+can+elicit+an+immune+response+as+protective+as+that+resulting+from+inoculation+with+live+bacteria.">Vaccination with the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein can elicit an immune response as protective as that resulting from inoculation with live bacteria.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8153-8160 (2005).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+major+outer+membrane+protein+of+Chlamydia+trachomatis.">Structural and functional analyses of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 189 (17), 6222-6235 (2007).</li><li>Hafner, L. M., Wilson, D. P., Timms, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+status+and+future+prospects+for+a+vaccine+against+Chlamydia+trachomatis+infection.">Development status and future prospects for a vaccine against Chlamydia trachomatis infection.</a> Vaccine. 32 (14), 1563-1571 (2014).</li><li>Findlay, H. E., McClafferty, H., Ashley, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression,+single-channel+analysis+and+membrane+topology+of+recombinant+Chlamydia+trachomatis+Major+Outer+Membrane+Protein.">Surface expression, single-channel analysis and membrane topology of recombinant Chlamydia trachomatis Major Outer Membrane Protein.</a> BMC Microbiology. 5, 5 (2005).</li><li>Sun, G., Pal, S., Weiland, J., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+an+intranasal+challenge+by+vaccines+formulated+with+native+and+recombinant+preparations+of+the+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein.">Protection against an intranasal challenge by vaccines formulated with native and recombinant preparations of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein.</a> Vaccine. 27 (36), 5020-5025 (2009).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+of+functional+receptor+tyrosine+kinases.">Cell-free expression of functional receptor tyrosine kinases.</a> Scientific Reports. 5 (1), 12896 (2015).</li></ol>

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن يبدو أنها تؤثر على العمل المذكور في هذه الورقة.

الكلاميديا هي العدوى المنقولة جنسيا الأكثر شيوعا والتي تؤثر على كل من الرجال والنساء. على الرغم من أن أبحاث اللقاح على الكلاميديا تمتد لعقود ، إلا أن اللقاح الآمن والفعال الذي يمكن توسيع نطاقه إلى الإنتاج الضخم ظل بعيد المنال13. يعتبر الكلاميديا MOMP المرشح الرئيسي كمستضد لقاح وقائي. ومع ذلك ، فإن MOMP شديد الكارهة للماء وعرضة للطي غير الصحيح14,15. كشفت دراسة أخرى أن MOMP موجود في حالات قليلة القسيمات الضرورية لمناعته11. بالتفصيل هنا هو طريقة التعبير المشترك التي تم التحقق من صحتها والخالية من الخلايا والتي تنتج MOMP قليلة القسيمات المتكونة داخل الجسيمات النانوية tNLP كلقاح ، مع غلة تبلغ حوالي 1.5 ملغ من MOMP المنقى لكل 3 مل من المحللات. ويمكن توسيع نطاق هذا الإجراء المقارن بالكامل ليشمل الإنتاج الصناعي، مما يزيد من آفاقه كنهج مفيد لتوليد اللقاحات.
لقد نشرنا سابقا عن استخدام التعبير الخالي من الخلايا لإنتاج بروتينات غشائية مضمنة في البرمجة اللغوية العصبية3،16 ، بالإضافة إلى التعبير في الأقراص المستقرة بالتيلوديندريمر . ومع ذلك ، أنتجت هذه التقنية الأخيرة جزيئات غشاء البروتين مع عدم تجانس أكبر وقابلية ذوبان أقل. 4 بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاستمناع لجسيمات MOMP-telodendrimer غير واضح مقارنة بجسيمات MOMP-tNLP6.
يمكن تكييف هذا الإجراء لتوسيع نطاق التعبير عن بروتينات الغشاء البكتيري المرشحة الواعدة كمستضدات للاستخدام في لقاحات الوحدات الفرعية. لا ينتج هذا الإجراء بروتين غشاء بكتيري قابل للذوبان فحسب ، بل إن بنية الجسيمات النانوية الشاملة قابلة لمزيد من التعديل باستخدام مجموعة متنوعة من المواد المساعدة للقاح المحبة للدهون بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، CpG المترافق مع جزء الكوليسترول أو FSL-1. يعد التعبير عن المستضدات المرشحة الأخرى من البكتيريا أمرا ممكنا ، على الرغم من أن المعلمات مثل درجة حرارة التعبير واختيار الدهون ونوع نظام التعبير قد تحتاج إلى استكشاف لتحقيق الغلة المثلى.
بالإضافة إلى ذلك ، يعد اختيار البلازميد ونسبته أمرا بالغ الأهمية في هذه العملية. يجب بناء كل من البلازميدات المستخدمة من نفس العمود الفقري. إذا كانت الإدخالات بنفس الطول تقريبا ، فيمكن أن تستند النسب إلى كتلة البلازميد المضافة ، كما هو موضح هنا. ومع ذلك ، فإن النسب على أساس الشامات سيعطي نتائج أكثر قابلية للتكرار ، خاصة عند قياس التفاعلات. قد لا تنطبق النسب التي تعمل بشكل جيد في تفاعلات مقياس الشاشة (< 0.5 مل) على التفاعلات الأكبر وقد تتطلب تحسينا إضافيا. لا يزال من الممكن التعبير عن البروتينات غير الغشائية باستخدام مجموعات خالية من الخلايا ولكنها قد لا تتطلب الجسيمات النانوية الدهنية (التعبير المشترك) لإنتاج منتج قابل للذوبان. بالإضافة إلى ذلك ، بينما يصف هذا البروتوكول المساعدة باستخدام CpG و FSL-1 ، فإن هذا النظام قابل للصياغة مع المواد المساعدة الأخرى المحبة للدهون أو الاختلاط مع المواد المساعدة القابلة للذوبان حسب الرغبة.
من الضروري تجنب التلوث عند إعداد تفاعل التعبير الخالي من الخلايا لأن ذلك يمكن أن يؤثر على الغلة. يجب أن تكون أي إضافات للتفاعل ، بما في ذلك البلازميدات نفسها ، نقية للغاية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون البروتينات المعبر عنها على اتصال فقط بالمواد والمحاليل الخالية من تلوث السموم الداخلية. يمكن أن يؤدي تلوث السموم الداخلية في التركيبات المرشحة إلى نتائج غير متسقة وزائفة للمقايسات المناعية ويمكن أن يكون ضارا بكميات كافية. على الرغم من عدم وصفها هنا ، فقد يكون من الضروري إجراء تنقية إضافية بعد كروماتوغرافيا تقارب النيكل إذا لوحظت العديد من الملوثات في خطوات التحليل اللاحقة مثل من خلال SDS-PAGE. ويمكن تحقيق ذلك مع لجنة الأوراق المالية والبورصات، على الرغم من أن الظروف قد تتطلب التحسين على أساس كل صياغة على حدة.

تتوفر محللات بدائية النواة أو حقيقية النواة للتعبير الخالي من الخلايا للبروتينات بسهولة كمنتجات تجارية لتوليف البروتينات ذات الأهمية (للحصول على مراجعة كاملة ، انظر 1). تتوفر أنظمة التعبير هذه على مستويات مختلفة وتستخدم المحللات من الكائنات الحية المختلفة ، بما في ذلك الإشريكية القولونية ونباتات التبغ ومزارع الثدييات. تقدم المحللات الخالية من الخلايا فوائد متعددة مقارنة بأساليب إنتاج البروتين المؤتلف التقليدية ، بما في ذلك سهولة الاستخدام وإنتاج البروتين القوي والسريع. في حين أن هذه الأساليب تستخدم في المقام الأول لإنتاج البروتينات القابلة للذوبان ، فقد كانت هذه المجموعة رائدة في نهج لاستخدامها للتعبير عن البروتينات الغشائية.
يقوم هذا النهج الجديد بإجراء تعديلات طفيفة على أنظمة التعبير الخالية من الخلايا الحالية من خلال تضمين الحمض النووي الذي يشفر منتجين بروتينيين للتعبير ، والبروتين الشحمي والبروتين الغشائي محل الاهتمام. يتفاعل البروتين الشحمي المعبر عنه (مشتقات إما ApoA1 أو ApoE4) مع الدهون المضافة إلى المحللة الخالية من الخلايا لتجميع NLPs تلقائيا (~ 20 نانومتر). عند ترجمته مع بروتين غشاء مهم ، يشكل NLP والبروتين الغشائي مركب جسيمات نانوية قابلة للذوبان حيث يتم تضمين بروتين الغشاء داخل طبقة الدهون المزدوجة NLP. وبالتالي ، فإن البروتين الغشائي يمكن الوصول إليه بشكل أكبر للتطبيقات النهائية ، حيث يتم احتواؤه داخل جزيئات منفصلة قابلة للذوبان. يمكن أن ينتج هذا النهج معقدات بروتين قليل القسيمات وظيفية داخل الطبقة الثنائية من البرمجة اللغويةالعصبية 2 ويمكن أن ينتج مكون المستضد للقاح الوحدة الفرعية ، والذي يتم خلطه لاحقا مع المواد المساعدة المحبة للدهون لتشكيل لقاح للجسيمات النانوية يتميز بمستضد موضعي مشترك ومساعد مناسب للتقييم في الجسم الحي .
تم تعديل هذه الطريقة الحالية من بروتوكول3 تم نشره مسبقا. تركز التعديلات الرئيسية على توسيع نطاق التفاعل الخالي من الخلايا والتنقية اللاحقة لمركب البروتين - البرمجة اللغوية العصبية. يتضمن التعديل الآخر إضافة بوليمر برمائي يعرف باسم telodendrimer ، والذي يتم خلطه أولا مع الدهون قبل إضافته إلى التفاعل الخالي من الخلايا. الترجمة المشتركة للبلازميدات في وجود telodendrimer والدهون تنتج telodendrimer NLP (tNLP). تساعد إضافة telodendrimer أيضا على تعديل حجم وتشتت الجسيمات النانوية tNLP الناتجة4. تم تحسين هذا البروتوكول خصيصا لدراسات اللقاحات واسعة النطاق لإنتاج بروتين مستضد وحدة فرعية مرتبطة بالغشاء ، الكلاميديا MOMP 5,6. تنتج الطريقة MOMP المؤتلف المرتبط ب tNLP لتشكيل مركب MOMP-tNLP عالي الذوبان الذي يحتفظ بقلة MOMP. ينتج إنتاج نموذجي من 3 مل >1.5 مجم من MOMP المنقى. إن MOMP-tNLP المنتج الخالي من الخلايا قابل للإضافة المساعدة السريعة لاختبار المناعة في الجسم الحي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2600028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Trizma hydrochloride solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial, ACS reagent, &#8805;99.7%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer Dam for XCell SureLock</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C24 Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit</td>
			<td>BiotechRabbit</td>
			<td>BR1400201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete His-Tag Purification Resin</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td>5893682001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG-ODN1826</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71508-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe PTS cartridge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9594798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe-PTS Testing System</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl and NaOH solutions for pH adjustment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC with UV-vis diode array detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure culture-grade water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Dry Blotting System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>IB24001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio V2.0 software</td>
			<td>Li-COR Biiosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Fc imager</td>
			<td>Li-COR Biiosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (&#8805;99.9%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP000202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIVEX2.4d vector</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 1000 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 20 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 200 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipettes</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic NaH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200, 5/150 GL column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>GE28-9909-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>&#160;tlrl-fsl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby Protein Gel Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Bench Top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 15 mL conicals (89039-666)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 50 mL conicals (89039-656)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies )</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free scaled production and adjuvant addition to a recombinant major outer membrane protein from chlamydia muridarum for vaccine development

توفر لقاحات الوحدات الفرعية مزايا على اللقاحات التقليدية المعطلة أو الموهنة المشتقة من الخلايا الكاملة في السلامة والاستقرار والتصنيع القياسي. لتحقيق لقاح فعال قائم على البروتين ، غالبا ما يحتاج مستضد البروتين إلى تبني شكل يشبه الأصلي. وهذا مهم بشكل خاص لمولدات الضد السطحية المسببة للأمراض التي هي بروتينات محاطة بغشاء. تم استخدام الطرق الخالية من الخلايا بنجاح لإنتاج بروتين غشاء وظيفي مطوي بشكل صحيح من خلال الترجمة المشتركة لجزيئات البروتين الدهني النانوي (NLPs) ، والمعروفة باسم الأقراص النانوية. 
يمكن استخدام هذه الاستراتيجية لإنتاج لقاحات الوحدة الفرعية التي تتكون من بروتينات غشائية في بيئة مرتبطة بالدهون. ومع ذلك ، غالبا ما يقتصر إنتاج البروتين الخالي من الخلايا على نطاق صغير (<1 مل). عادة ما تكون كمية البروتين المنتجة في عمليات الإنتاج على نطاق صغير كافية للدراسات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية. ومع ذلك ، يجب توسيع نطاق العملية الخالية من الخلايا وتحسينها واختبارها بعناية للحصول على ما يكفي من البروتين لدراسات اللقاح في النماذج الحيوانية. يجب تحسين العمليات الأخرى التي ينطوي عليها إنتاج اللقاح ، مثل التنقية وإضافة المواد المساعدة والتجفيد ، بالتوازي. تشير هذه الورقة إلى تطوير بروتوكول موسع للتعبير عن لقاح الوحدة الفرعية للبروتين المرتبط بالغشاء وتنقيته وصياغته. 
تتطلب التفاعلات الخالية من الخلايا الموسعة تحسين تركيزات ونسب البلازميد عند استخدام ناقلات تعبير البلازميد المتعددة ، واختيار الدهون ، وإضافة المواد المساعدة لإنتاج عالي المستوى لجزيئات البروتين الدهني النانوي المصاغة. يتم توضيح الطريقة هنا مع التعبير عن بروتين الغشاء الخارجي الرئيسي الكلاميديا (MOMP) ولكن يمكن تطبيقه على نطاق واسع على مستضدات البروتين الغشائي الأخرى. يمكن تقييم فعالية المستضد في الجسم الحي من خلال دراسات التحصين لقياس إنتاج الأجسام المضادة ، كما هو موضح هنا.

يظهر ملف تعريف SDS-PAGE لتنقية تقارب Ni ل MOMP-tNLP من تفاعل خال من الخلايا سعة 1 مل في الشكل 1B. أدى التفاعل إلى مستويات عالية من التعبير لكل من MOMP وبروتين Δ49ApoA1. أظهرت النتائج السابقة أن التعبير الخالي من الخلايا ل Δ49ApoA1 في وجود DMPC و telodendrimer أدى إلى تكوين جزيئات البروتين الدهني النانوي telodendrimer (tNLPs)4. أشار الشطف المشترك ل MOMP مع Δ49ApoA1 إلى أن MOMP مرتبط ب tNLPs ، حيث أن علامة His-tag موجودة فقط على سقالة tNLP Δ49ApoA1 وليس على MOMP. MOMP هو بروتين غير قابل للذوبان بدرجة عالية لا يمكن استخلاصه إلا من خلال التعقيد مع tNLPs ، والتي ثبت أنها تسهل إذابة البروتينات الغشائية.
تم تجميع أجزاء الشطف التي تحتوي على MOMP-tNLPs وتحديد تركيز البروتين الكلي باستخدام جهاز تكميم قائم على التألق ، أو جهاز يقيس التركيز من خلال الامتصاص عند 280 نانومتر ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة لكمية البروتين. للسماح بجرعات دقيقة من لقاح MOMP ، من المهم أيضا تحديد تركيز MOMP في المجمعات المنقى. لقد طورنا طريقة لقياس MOMP بناء على قياس كثافة الهلام (الشكل 2) حيث تم استخدام MOMP المنقى المؤتلف بتركيز معروف كمعيار. من خلال إنشاء المنحنى القياسي ومقارنته بعينة MOMP-tNLP ، يمكن قياس تركيز MOMP بدقة. مكن تحديد تركيز MOMP في العينة المنقاة من تقدير عائد MOMP في تفاعلات خالية من الخلايا على مستويات مختلفة ، وهو أمر مهم لتخطيط إعداد التفاعل المناسب للدراسات النهائية (الجدول 3).
يحتاج MOMP إلى تكوين oligomers لاستنباط استجابة مناعية قوية11. لاختبار حالة oligomeric من MOMP ، تم تحليل MOMP-tNLP في وجود وغياب كل من الحرارة وعامل الاختزال dithiothreitol (DTT ، 50 mM ، الشكل 3A). تم تحديد الأوليغومرات ذات الترتيب الأعلى من MOMP من خلال SDS-PAGE عندما لم تتم معالجة العينات بالحرارة و DTT. وبالمقارنة ، أظهرت العينات المعالجة بالحرارة في وجود DTT في المقام الأول شريطين متميزين على الهلام ، يقابلان MOMP و Δ49ApoA1 (حوالي 40 كيلو دالتون و 22 كيلو دالتون ، على التوالي). تشبه هذه النتائج إلى حد كبير نمط ربط الهلام المنسوب إلى تكوين oligomer ل MOMP ، وهو أمر بالغ الأهمية لفعاليته.
أظهر تحليل اللطخة الغربية الإضافي باستخدام MAb40 ، وهو جسم مضاد ضد الخاتم الخطي على المجال المتغير لبروتين MOMP ، نمطا مشابها للنطاقات ، مما يؤكد تكوين oligomer بواسطة بروتين MOMP في حالته غير المشوهة (الشكل 3B). أحد العوامل المهمة التي تؤثر على تكوين أوليغومر MOMP هو النسبة بين بلازميد MOMP وبلازميد Δ49ApoA1 أثناء إعداد التفاعل الخالي من الخلايا. يسرد الجدول 4 نسبة البلازميدات ومعدل إدخال MOMP الناتج في tNLPs. أشارت الدراسات السابقة إلى أن الكلاميديا MOMP وبروتينات الغشاء الخارجي الأخرى قد توجد في المقام الأول كقادين12. لتعظيم تكوين أداة التشذيب في التفاعل الخالي من الخلايا ، من المستحسن أن يكون معدل الإدخال قريبا من ثلاثة بروتينات MOMP لكل برمجة عصبية ، وهو ما يتوافق مع نسبة البلازميد ~ 25: 1 MOMP إلى Δ49ApoA1.
تم استخدام مقايسة اللطخة النقطية كطريقة أكثر بساطة للكشف عن وجود MOMP و tNLP. تم استخدام الجسم المضاد MAb40 للكشف عن MOMP الكلي. تم استخدام الجسم المضاد MAbHIS المستهدف لعلامة His-tag على سقالة Δ49ApoA1 من tNLP لتقييم وجود tNLP. أشارت الإشارات المشتركة للأجسام المضادة MAb40 و MAbHIS إلى تكوين MOMP-tNLP. أنتج تفاعل التحكم tNLP فارغا ، والذي أظهر فقط إشارة إيجابية من MAbHIS (الشكل 3C). لاختبار مناعة MOMP-tNLPs المنتجة في التفاعل الخالي من الخلايا ، قمنا بمساعدة MOMP-tNLP مع CpG + FSL-1 وحقننا في العضل (i.m) في الفئران في نظام التعزيز الأولي كما هو موضح أعلاه. تم جمع الأمصال من الفئران المحصنة ، وتم قياس الجسم المضاد IgG الخاص ب MOMP باستخدام مقايسة اللطخة الغربية (الشكل 4). أظهرت الأمصال المأخوذة من الفئران المحقونة ب MOMP-tNLP المساعد ارتباطا قويا ب MOMP ، مما يشير إلى أن MOMP-tNLP يمكن أن يثير استجابة مناعية في الجسم الحي.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig01.jpg"> الشكل 1: التعبير عن MOMP-tNLP وتنقيته. (أ) صورة لأنابيب تحتوي على قسومات صغيرة من تفاعل خال من الخلايا يعبر بنجاح عن عناصر تحكم GFP في الإضاءة تحت مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية (يمين) مقارنة بالمحللين بدون بلازميد GFP (يسار). (ب) جل البروتين الملون ب SYPRO Ruby بعد أن يظهر SDS-PAGE ملف تنقية MOMP-tNLP. يهاجر MOMP عند 40 كيلو دالتون ويهاجر 49ApoA1 عند 22 كيلو دالتون. الاختصارات: MOMP = بروتين الغشاء الخارجي الرئيسي الكلاميدي. tNLP = جسيم البروتين الدهني النانوي تيلوديندريمر ؛ MOMP-tNLP = مجمع MOMP-tNLP ؛ GFP = بلازميد ترميز البروتين الفلوري الأخضر ؛ MW = علامة الوزن الجزيئي ؛ T = إجمالي المحللة الخالية من الخلايا ؛ FT = التدفق من خلال ؛ R1-R3 = حصص التفاعل الخالية من الخلايا ؛ W1 ، W6 = يغسل 1 و 6 ؛ E1-E7 = Elutions من 1 إلى 7 ؛ Δ49ApoA1 = مشتق ApoA1 للماوس الموسوم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig02.jpg"> الشكل 2: القياس الكمي ل MOMP في عينات MOMP-tNLP . (أ) جل SDS-PAGE ملطخ ب SYPRO Ruby لتحديد كمية MOMP. تم تحميل MOMP المؤتلف بتركيز معروف على الجل للحصول على المنحنى القياسي. يحتوي كل ممر على 0.1 ميكروغرام و 0.5 ميكروغرام و 1.0 ميكروغرام و 2.0 ميكروغرام و 4.0 ميكروغرام من MOMP. تم تحميل عينات MOMP-tNLP التي تم قياسها كميا على نفس الجل. (ب) تم إنشاء منحنى معيار تركيز MOMP باستخدام قياس الكثافة. تم إنشاء معادلة تربط كثافة النطاق الطبيعي ومقدار MOMP. تم استخدام المعادلة لحساب محتوى MOMP في العينات غير المعروفة. الاختصارات: MOMP = بروتين الغشاء الخارجي الرئيسي الكلاميدي. tNLP = جسيم البروتين الدهني النانوي تيلوديندريمر ؛ MOMP-tNLP = مجمع MOMP-tNLP ؛ SDS-PAGE = الصوديوم دوديسيل سلفات بولي أكريلاميد هلام الكهربائي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig03.jpg"> الشكل 3: تسمح MOMP-tNLP المنتجة بدون خلايا ل MOMP بتكوين هياكل أعلى مرتبة. (أ) جل SDS-PAGE من MOMP-tNLP مع وبدون معالجة الحرارة وعامل الاختزال DTT ، ملطخ ب SYPRO Ruby. مع الحرارة و DTT ، ظهر MOMP بشكل أساسي كنطاق مونومر عند ~ 40 كيلو دالتون ، حيث كسرت الحرارة وعامل الاختزال غالبية بنية MOMP ذات الترتيب الأعلى. في غياب الحرارة و DTT ، كانت النطاقات ذات الترتيب الأعلى موجودة ، مما يشير إلى تشكل oligomer MOMP. (ب) اللطخة الغربية من MOMP-tNLP و MOMP وحدها ، غير معالجة ومعالجة بالحرارة و DTT. بعد النقل ، تم فحص الغشاء باستخدام MAb40 (تخفيف 1: 1000). لوحظ نمط ربط مشابه للهلام المصبوغ بالياقوت SYPRO ، مما يؤكد أن نطاقات الوزن الجزيئي الأعلى كانت بالفعل أوليغومرات MOMP. (C) بقعة بقعة من MOMP-tNLP وعينات tNLP فارغة (في نسختين) تم فحصها باستخدام MAb40 و MAbHIS. الاختصارات: MOMP = بروتين الغشاء الخارجي الرئيسي الكلاميدي. tNLP = جسيم البروتين الدهني النانوي تيلوديندريمر ؛ MOMP-tNLP = مجمع MOMP-tNLP ؛ SDS-PAGE = الصوديوم دوديسيل سلفات بولي أكريلاميد هلام الكهربائي. DTT = ديثيوثريتول. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig04.jpg"> الشكل 4: MOMP-tNLP المنتج بدون خلايا مناعي للغاية. أظهر المصل من الفئران المحصنة إشارة قوية مضادة ل MOMP IgG. تم استخدام MOMP-tNLP المساعد مع CpG + FSL-1 لتحصين الفئران. تم جمع الأمصال من ستة فئران محصنة وتجميعها واستخدامها لفحص MOMP-tNLP. كان المصل قادرا على الارتباط ب MOMP في مقايسة النشاف الغربية وأظهر إشارة IgG قوية (يسار). أظهرت اللطخة الغربية التي تستخدم MAb40 كجسم مضاد أساسي (يمين) نطاقات مماثلة ، مما يشير إلى أن المصل يحتوي على IgG خاص ب MOMP. الاختصارات: MOMP = بروتين الغشاء الخارجي الرئيسي الكلاميدي. tNLP = جسيم البروتين الدهني النانوي تيلوديندريمر ؛ MOMP-tNLP = مجمع MOMP-tNLP ؛ CpG = مساعد CpG المعدل للكوليسترول ؛ FSL-1 = مساعد محبة للدهون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>اسم المخزن المؤقت</td>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>كلوريد الصوديوم</td>
			<td>إيميدازول</td>
			<td>الرقم الهيدروجيني</td>
		</tr><tr><td>عازلة ملزمة</td>
			<td>50 مللي متر</td>
			<td>300 مللي متر</td>
			<td>10 مللي متر</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>غسل العازلة</td>
			<td>50 مللي متر</td>
			<td>300 مللي متر</td>
			<td>20 مللي متر</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>العازلة للشطف 1</td>
			<td>50 مللي متر</td>
			<td>300 مللي متر</td>
			<td>250 مللي متر</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>العازلة للشطف 2</td>
			<td>50 مللي متر</td>
			<td>300 مللي متر</td>
			<td>500 مللي متر</td>
			<td>8.0</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: قائمة المخازن المؤقتة اللازمة لتنقية تقارب النيكل مع تفصيل تركيزات كل مكون ودرجة الحموضة.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>وقت التشغيل</td>
			<td>50 دقيقة</td>
		</tr><tr><td>معدل التدفق</td>
			<td>6.0 مل / دقيقة</td>
		</tr><tr><td>نوع التدرج</td>
			<td>ثنائي</td>
		</tr><tr><td>المخزن المؤقت أ</td>
			<td>10 مللي متر TEAA في H20</td>
		</tr><tr><td>المخزن المؤقت ب</td>
			<td>مكن</td>
		</tr><tr><td>التدرج</td>
			<td>٪ المخزن المؤقت ب</td>
		</tr><tr><td>0 دقيقة</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>30 دقيقة</td>
			<td>60%</td>
		</tr><tr><td>30.5 دقيقة</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>40 دقيقة</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>40.5 دقيقة</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>50 دقيقة</td>
			<td>25%</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 2: شروط المرحلة العكسية HPLC تنقية CpG المعدلة للكوليسترول. الاختصارات: TEAA = أسيتات ثلاثي إيثيل الأمونيوم. MeCN = الأسيتونيتريل.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>محللة خالية من الخلايا (مل)</td>
			<td>DMPC الدهون (ملغ)</td>
			<td>تيلوديندريمر (ملغ)</td>
			<td>بلازميد MOMP (ميكروغرام)</td>
			<td>العائد المنقى MOMP (ملغ)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>0.4</td>
			<td>15</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>8</td>
			<td>0.8</td>
			<td>30</td>
			<td>1.1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>12</td>
			<td>1.2</td>
			<td>45</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>75</td>
			<td>2.7</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 3: كمية الليبيدات والتيلوديندريمر والبلازميدات المستخدمة في التفاعلات الخالية من الخلايا ذات القشور المختلفة والعوائد المقابلة. الاختصارات: MOMP = بروتين الغشاء الخارجي الرئيسي الكلاميدي. DMPC = 1،2-ديميريستويل-sn-غليسيرو-3-فوسفوكولين.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">نسب مدخلات البلازميد ، MOMP: Δ49ApoA1</td>
			<td>1:1</td>
			<td>5:1</td>
			<td>10:1</td>
			<td>25:1</td>
			<td>50:1</td>
			<td>100:1</td>
		</tr><tr><td colspan="2">نسب كمية البروتين المنتجة ، MOMP: Δ49ApoA1</td>
			<td>0.02</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.64</td>
			<td>3.46</td>
			<td>6.55</td>
			<td>20.04</td>
		</tr><tr><td colspan="2">العدد المقدر لإدخال MOMP لكل tNLP</td>
			<td>0.03</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.75</td>
			<td>4.04</td>
			<td>7.65</td>
			<td>23.39</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 4: نسب البلازميد في تفاعل خال من الخلايا ومعدلات إدخال MOMP الناتجة. الاختصارات: MOMP = بروتين الغشاء الخارجي الرئيسي الكلاميدي. tNLP = جسيم البروتين الدهني النانوي تيلوديندريمر ؛ Δ49ApoA1 = مشتق ApoA1 للماوس الموسوم.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development at JoVE.com

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

يصف هذا البروتوكول استخدام مجموعات تعبير البروتين التجارية الخالية من الخلايا لإنتاج بروتينات غشائية مدعومة في القرص النانوي يمكن استخدامها كمستضدات في لقاحات الوحدات الفرعية.

إنتاج متدرج خال من الخلايا وإضافة مساعدة إلى بروتين الغشاء الخارجي الرئيسي المؤتلف من الكلاميديا موريداروم لتطوير اللقاح

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard ...

العديد من مستضدات لقاح الوحدة الفرعية المرشحة هي بروتينات غشائية. تاريخيا ، كان من الصعب إنتاجها وتنقيتها بكميات كافية. باستخدام هذه التقنية، يمكننا تكوين مولدات ضد مهمة مضمنة داخل الغشاء الدهني للمساعدة في ضمان تأكيد يشبه الطبيعي.تسهل هذه العملية أيضا الصياغة مع المواد المساعدة ذات الأهمية. يتيح التعبير الخالي من الخلايا الإنتاج السريع للبروتينات ذات الأهمية في بنيتها الأصلية الخالية من العلامات. هذه التقنية قابلة للتطوير أيضا ونحن نعمل بالفعل مع الشركات التجارية لتطوير تركيبات اللقاح باستخدام هذه العملية.نوضح هنا عملية الكشف عن مولد ضد الكلاميديا، لكن يمكن تكييف العملية بسهولة لإنتاج مولدات الضد المهمة بغض النظر عما إذا كانت بروتينات غشائية أم لا. قد تكون هذه العملية قابلة للتطبيق على كل من تطوير لقاح مسببات الأمراض والسرطان. للبدء ، قم بإعداد MOMP-tNLPs باستخدام طريقة خالية من الخلايا.قم بإذابة محلول إعادة التكوين من مجموعة تعبير البروتين الخالي من الخلايا قبل ساعتين من ضبط التفاعل وأضف مثبط الأنزيم البروتيني الخالي من EDTA إلى المخزن المؤقت. استخدم مجموعة مصممة لتشغيل خمسة تفاعلات سعة ملليلتر واحد. لكل تفاعل سعة ملليلتر واحد ، أضف 525 ميكرولترا من المخزن المؤقت لإعادة التكوين إلى زجاجة تحلل E.coli ولفها حتى تذوب.أضف 250 ميكرولترا من المخزن المؤقت لإعادة التكوين إلى زجاجة التفاعل التي تحتوي على المادة المضافة وتذوب عن طريق التدحرج. بعد ذلك ، أضف 8.1 ملليلتر من المخزن المؤقت لإعادة التكوين إلى زجاجة تغذية التفاعل ولفها حتى تذوب. إلى زجاجة من خليط الأحماض الأمينية ، أضف ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت لإعادة التكوين لإذابته.إلى زجاجة أخرى من الميثيونين ، أضف 1.8 ملليلتر من المخزن المؤقت لإعادة التكوين ، وقم بحله ، وقم بتخزينه على الجليد. أضف 225 ميكرولترا من الخليط المعاد تكوينه ، و 270 ميكرولترا من خليط الأحماض الأمينية المعاد تكوينه بدون ميثيونين ، و 30 ميكرولترا من الميثيونين المعاد تكوينه إلى زجاجة تحلل الإشريكية القولونية. علاوة على ذلك ، أضف 400 ميكرولتر من خليط DMPC / telodendrimer 15 ميكروغرام من بلازميد MOMP ، و 0.6 ميكروغرام من delta-49ApoA1 إلى الخليط واخلطه.القسمة 20 ميكرولتر من المحلول الكلي في أنبوب 1.5 ملليلتر لتفاعل التحكم المعرب عن GFP. تحضير محلول تغذية عن طريق إضافة 2.65 ملليلتر من خليط الأحماض الأمينية المعاد تكوينه بدون ميثيونين و 300 ميكرولتر من الميثيونين المعاد تكوينه. انقل ملليلترا واحدا من محلول التفاعل إلى غرفة التفاعل الداخلية في مجموعة التفاعل الخالية من الخلايا وأغلقها.املأ الغرفة الخارجية لوعاء التفاعل ب 10 ملليلتر من محلول التغذية وأغلقه. أضف 0.5 ميكرولتر من بلازميد التحكم GFP إلى حصص 20 ميكرولتر من خليط التفاعل. ضع التفاعل في شاكر عند 300 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة عند 30 درجة سلزية.راقب التفاعل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بعد 15 دقيقة من أجل التألق بسبب تخليق GFP. قم بتنقية مركب الجسيمات النانوية MOMP-tNLP من خليط التفاعل الخالي من الخلايا عن طريق كروماتوغرافيا تقارب النيكل المجمدة باستخدام علامة HIS-على بروتين delta-49ApoA1. انقل ملليلترا واحدا من ملاط 50٪ من راتنج تنقية HIS-tag إلى عمود كروماتوغرافي يمكن التخلص منه سعة 10 ملليلتر ، وأضف ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للربط لتحقيق التوازن.بعد ذلك ، قم بتصريف المخزن المؤقت وإضافة 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط إلى الراتنج. استخراج 20 ميكرولتر من خليط التفاعل الخالي من الخلايا لتحليل SDS-PAGE. أضف خليط التفاعل الخالي من الخلايا المتبقي مع الراتنج المتوازن واحتضانه على هزاز المختبر لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية.قم بإزالة غطاء العمود واغسله ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط. أضف سائل الغسيل إلى العمود واجمع التدفق من خلاله لتحليل SDS-PAGE. اغسل العمود بمليلتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل مع 20 مليمول إيميدازول ست مرات واجمع الكسور.أثناء الغسيل للمرة الثانية ، استخدم ماصة سعة ملليلتر واحد لتحريك الراتنج. تخلص من MOMP-tNLPs في ستة أجزاء سعة 300 ميكرولتر من محلول الشطف I الذي يحتوي على 250 مللي مولار إيميدازول وشطف نهائي مع 300 ميكرولتر من محلول الشطف II يحتوي على 500 مليمول إيميدازول. في الشطف الثاني ، حرك الراتنج بقوة عن طريق سحب الماصة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة ملليلتر واحد.استخدم جهاز تصوير جل لالتقاط الصور بسرعة 600 نانومتر. بعد ذلك ، حدد كمية البروتينات المختلفة في الجسيمات النانوية من خلال تحليل SDS-PAGE باستخدام معيار البروتين. ارسم منحنى قياسيا باستخدام كثافات نطاقات MOMP.ثم حدد مكون MOMP للجسيمات النانوية مع المعيار. حل العينات بواسطة SDS-PAGE ونقل مداخن الهلام باستخدام نظام نشاف جاف تجاري لتحليل البقع الغربية. قم بإزالة البقع من المكدس واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية في مخزن مؤقت مانع يحتوي على 0.2٪ TWEEN 20 و 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر MAb40 ، أو 0.2 ميكروغرام لكل مليلتر MAbHIS antiHIS-tag الجسم المضاد الموجه ضد علامة HIS-من بروتين delta-49ApoA1.اغسل كل لطخة باستخدام PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسلة. احتضان البقع لمدة ساعة واحدة في مخزن مؤقت يحتوي على جسم مضاد ثانوي مقترن بفلوروفور بتخفيف 1:10،000. كرر الغسلات باستخدام PBST والتقط الصورة باستخدام جهاز تصوير مضان بعد الغسيل النهائي.باستخدام جهاز لطخة نقطية ، لطخة ثلاثة ميكروغرام من MOMP-tNLP و tNLP فارغة. قم بتطوير ومنع البقع باستخدام نفس طريقة النشاف الغربي. قم بتجميد المحلول المختلط على الثلج الجاف وقم بتجفيفه بالتجميد طوال الليل باستخدام مجفف التجميد.قم بتخزين التركيبات المجففة في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. عند الحاجة ، أعد تكوين tNLPs المجففة بالتجميد بالماء الخالي من السموم الداخلية ولفها لتذوب وتعيد الترطيب. قم بغسيل المحلول باستخدام برنامج تلفزيوني وقم بإزالة التريهالوز باستخدام غشاء غسيل الكلى المقطوع 3.5 كيلو دالتون.أجهزة الطرد المركزي محلول الجسيمات النانوية في مكثف فراغ قبل إضافة المساعد. راقب حجم العينة بعد 20 إلى 30 دقيقة لمنع التجفيف الكامل. في خزانة السلامة البيولوجية ، أضف المادة المساعدة في ظل ظروف معقمة.باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي ، قم بتحليل صياغة الدمج الناجح. قم بتخزين MOMP-tNLPs المساعدة وإفراغ tNLP عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى 14 يوما. تحليل استقرار صيغة tNLP مع كروماتوغرافيا استبعاد الحجم.تم إجراء تحليل SDS-PAGE ل MOMP-tNLP من خلال كروماتوغرافيا تقارب النيكل ، والتي أظهرت أن خليط التفاعل الخالي من الخلايا يحتوي على مستويات عالية من التعبير لكل من بروتينات MOMP و delta-49ApoA1. من خلال استخدام قياس كثافة الهلام ، تم تحديد تركيز MOMP باستخدام MOMP المنقى المؤتلف بتركيز معروف كمعيار. لتحديد تكوين oligomer ، تمت معالجة SDS-PAGE MOMP و MOMP-tNLP بالحرارة و DTT ، والتي أظهرت نطاقات مميزة ل MOMP و delta-49ApoA1.تم استخدام تحليل اللطخة الغربية باستخدام الجسم المضاد MAb40 ضد بروتين MOMP ، والذي كشف عن نمط ربط يؤكد تكوين oligomer بواسطة بروتين MOMP في حالته غير المشوهة. تم إجراء فحص لطخة نقطية في وجود الأجسام المضادة MAb40 و MAbHIS ، والتي أشارت إلى تكوين MOMP-tNLP. ومع ذلك ، أظهر tNLP الفارغ إشارة إيجابية ل MAbHIS.أظهرت الأمصال من الفئران المحصنة التي تم حقنها ب MOMP-tNLP المساعد ارتباطا قويا ب MOMP وأشارت إلى أن MOMP-tNLP يمكن أن تثير استجابة مناعية. نظرا لأن هذا البروتوكول يولد البروتين من الحمض النووي ، فمن الضروري تجنب تلويث التفاعل مع DNase و RNase ، وكذلك الحمض النووي الدخيل والحمض النووي الريبي. يجب أن تكون أي مواد أو كواشف مستخدمة في التفاعلات خالية من هذا النوع من الجزيئات.بعد التعبير عن المواد المساعدة وتنقيتها وإضافتها ، يمكن تقييم هذه اللقاحات المرشحة في نماذج حيوانية مناسبة لمسببات الأمراض ذات الأهمية لتقييم علامات التنشيط المناعي أو تقييم الحماية أثناء التحدي. بالنسبة للكلاميديا ، يعتبر بروتين الغشاء الخارجي الرئيسي ، أو MOMP ، مستضدا مرشحا رئيسيا للقاحات الوحدات الفرعية لسنوات عديدة ، ولكن كان من الصعب إنتاجه على المستويات اللازمة لتطبيق اللقاح. يعد التعبير المشترك الخالي من الخلايا لهذا البروتين الغشائي طريقة قابلة للتطبيق لبدء تحريك هذا البروتين نحو التقييم في النماذج الحيوانية مثل الفئران ، وفي النهاية الدخول في الاختبارات البشرية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

المؤتلف إنتاج فيروسات الرجعية والعدوى من خلايا B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

إنتاج وناقلات Titering الغدة المؤتلف المرتبطة الفيروسية

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

تعداد خلايا الدم البيضاء الكبرى الطرفية بالسكان الدم للمحاكمات متعددة المراكز السريرية باستخدام الدم الكامل الفحص Phenotyping

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

النهج الوراثية إلى الأمام في<em&gt; الكلاميديا ​​المتدثرة</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

جيل من الفيروسة الرملية المؤتلف استحداث اللقاحات وافقت عليها الهيئة في خلايا فيرو

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

باستخدام الكيمياء فوق لقياس تأثير عدوى فيروسية في خلية المضيف RNA التجميعي

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

في تحليل المختبر من الاستجابة المناعية الخلوية بوساطة Myd88 لفيروس غرب النيل المسخ سلالة العدوى

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

البكتيريا المستروحة الخارجي غشاء الحويصلات: عزل وتحليل إمكاناتهم الموالية للالتهابات في الضامة

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

كوانتيتيشن خلية واحدة مرناً و "سطح التعبير البروتين" في خلايا CD4 المصابين "فيروس نقص المناعة القردي"+ "تي الخلايا المعزولة" من macaques ريسوس