Name: cell-free scaled production and adjuvant addition to a recombinant major outer membrane protein from chlamydia muridarum for vaccine development
Uploaded: 2022-03-16T12:30:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Public Health Service tilskud R21 AI20925 og U19 AI144184 fra National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Dette arbejde blev udført i regi af U.S. Department of Energy af Lawrence Livermore National Laboratory under kontrakt DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525, LLNL-VIDEO-832788].

Alle dyreforsøg blev udført på University of California, Irvine, i Public Health Service (PHS) -sikrede faciliteter i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Forberedelse af glasvarer
BEMÆRK: Alle materialer, der anvendes til fremstilling af formuleringer af vaccinekvalitet til dyr, er endotoksinfrie.
<ol><li>For at ødelægge forurenende endotoksin skal du bage renset glasvarer, der holder buffere i en ovn ved 180 ° C i 4 timer.</li>
</ol>2. Forberedelse af buffer
<ol><li>Der fremstilles 250 ml af Ni-affinitetsrensningsbufferne, der er anført i tabel 1. Opbevar dem ved 4 °C i op til 6 måneder.</li>
</ol>3. Forberedelse af reaktion
<ol><li>20 mg 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) afvejes i et endotoksinfrit, 1,5 ml centrifugerør. Opløs det i 1 ml endotoksinfrit vand, sonde-sonikere mindst fire gange ved 6 A i 1 min, med 1 min pauser imellem, indtil det er klart. Fjern ethvert forurenende metal fra sonden ved centrifugering ved 13.000 × g i 2 minutter ved 22 °C, og overfør derefter det opløselige lipid til et nyt 1,5 ml endotoksinfrit rør.</li>
	<li>Afvej 1 mg PEG5k-CA8 telodendrimer i et 1,5 ml endotoksinfrit rør. Opløs i endotoksinfrit vand til en koncentration på 20 mg / ml. Vortex, indtil den er helt opløst og fortyndes til 2 mg/ml.</li>
	<li>I et nyt endotoksinfrit rør kombineres 210 μL 20 mg/ml DMPC-opløsning med 210 μL 2 mg/ml telodendrimeropløsning.</li>
</ol>4. Cellefri produktion af MOMP-tNLP'er til underenhedsvaccineformuleringer
<ol><li>Forbered MOMP-tNLP'er ved hjælp af cellefrie metoder ændret fra en tidligere offentliggjort protokol5.<ol><li>To timer før opsætning af den cellefrie reaktion skal du åbne det prokaryote cellefrie proteinekspressionssæt og optø en af rekonstitutionsbufferne. Når den er optøet, tilsættes en tablet EDTA-fri proteasehæmmercocktail og lad den opløses helt.</li>
	</ol></li>
	<li>Følg denne protokol ved hjælp af et sæt, der er designet til at køre 5 x 1 ml reaktioner. BEMÆRK: En typisk opskaleringsproduktion er 3 x 1 ml.<ol><li>For hver 1 ml reaktion tilsættes 525 μL rekonstitutionsbuffer til E. coli-lysatflasken, og rullen forsigtigt for at opløse . Der tilsættes 250 μL rekonstitutionsbuffer til flasken med reaktionsadditiver (f.eks. ATP, GTP) og rulles forsigtigt for at opløses.</li>
		<li>Tilsæt 8,1 ml rekonstitutionsbuffer til reaktionsfødeflasken, sæt låget på med en gummiprop (pas på ikke at røre indersiden af gummiproppen), og vend/rul forsigtigt for at opløse.</li>
		<li>Tilsæt 3 ml rekonstitutionsbuffer til aminosyreblandingsflasken, sæt låg på med en gummiprop, og vend/rul forsigtigt for at opløse. BEMÆRK: Pas på ikke at røre ved indersiden af gummiproppen, da dette kan føre til forurening.</li>
		<li>Tilsæt 1,8 ml rekonstitutionsbuffer til methioninflasken, rul forsigtigt for at opløse den, og opbevar derefter på is indtil brug.</li>
	</ol></li>
	<li>Forbered reaktionsopløsningen.<ol><li>Til E. coli-lysatflasken tilsættes 225 μL rekonstitueret reaktionsblanding, 270 μL rekonstitueret aminosyreblanding uden methionin og 30 μL rekonstitueret methionin . Derudover tilsættes 400 μL DMPC/telodendrimer-blandingen, 15 μg MOMP-plasmid og 0,6 μg Δ49ApoA1-plasmid. Rul/ryst forsigtigt for at blande. BEMÆRK: Sørg for, at begge plasmider er konstrueret af den samme plasmidrygrad. Må ikke hvirvel.</li>
		<li>Tag 20 μL af den totale opløsning og læg den til side i et 1,5 ml rør til GFP-ekspressionskontrolreaktionen (se nedenfor).</li>
	</ol></li>
	<li>Forbered foderopløsningen. Til foderblandingsflasken tilsættes 2,65 ml rekonstitueret aminosyreblanding uden methionin og 300 μL rekonstitueret methionin. Rul/ryst forsigtigt for at opløse. BEMÆRK: På dette tidspunkt kan den ubrugte rekonstitutionsbuffer og methionin returneres til fryseren til opbevaring.</li>
	<li>Der overføres 1 ml af reaktionsopløsningen til det indre reaktionskammer, der er tilvejebragt i det cellefrie reaktionssæt, og forseglingen, når den er fyldt. 10 ml af fødeopløsningen overføres til reaktionsbeholderens ydre kammer og forseglingen. BEMÆRK: Overfyld ikke kamrene! Tilstedeværelsen af luftbobler øverst i både det indre reaktionskammer og det indre fødekammer vil påvirke reaktionen negativt. Enhver resterende reaktionsopløsning kan anbringes i et 1,5 ml rør og få lov til at blande sammen med hovedbeholderen.</li>
	<li>Der tilsættes 0,5 μL GFP-kontrolplasmidet (0,5 mg/ml) til den tidligere alikvotede 20 μL reaktionsblanding. BEMÆRK: Mange sæt leveres med et kontrolplasmid til kvalitetskontrolformål. De fleste GFP-ekspressionelle plasmider med en T7-promotor og E. coli-ribosombindingssted (RBS) kan også anvendes som kontrolplasmid.</li>
	<li>Reaktionen anbringes i en ryster ved 300 o/min, 30 °C i op til 18 timer. For at kontrollere, at reaktionen var vellykket, skal du bruge en UV-lyskilde til at kontrollere for fluorescens på grund af syntesen af kontrol-GFP (figur 1A) efter så lidt som 15 minutters inkubation. BEMÆRK: Disse forhold, især temperatur, skal muligvis optimeres til ekspression af andre membranproteiner.</li>
</ol>5. MOMP-tNLP oprensning
<ol><li>Brug immobiliseret nikkelaffinitetskromatografi til at rense MOMP-tNLP nanopartikelkomplekset fra den cellefrie reaktionsblanding ved hjælp af His-mærket på Δ49ApoA1-proteinet.<ol><li>Overfør 1 ml af en 50% opslæmning af His-Tag Purification Resin til en engangs 10 ml kromatografikolonne og ekvilibrer den med 3 ml bindingsbuffer.</li>
		<li>Lad bufferen dræne, hætte udløbet, og tilsæt 250 μL bindingsbuffer til harpiksen.</li>
		<li>Før du tilføjer den cellefrie reaktion til kolonnen, skal du gemme 20 μL til senere analyse med SDS-PAGE. Den cellefrie reaktion blandes med den ekvilibrerede harpiks og inkuberes på en laboratorievipper ved 4 °C i 1 time.</li>
	</ol></li>
	<li>Fjern hætten på søjlen, vask hætten med 500 μL ekstra bindingsbuffer, og tilsæt denne væske til resten af kolonnen.</li>
	<li>Opsaml væskegennemstrømningen fra kolonnen til senere analyse med SDS-PAGE.</li>
	<li>Kolonnen vaskes seks gange med 1 ml vaskebuffer indeholdende 20 mM imidazol, og fraktionerne opsamles. Pas på ikke at lade harpiksen tørre ud mellem vaske. Ved den anden vask omrøres harpiksen kraftigt ved pipettering op og ned med en 1 ml pipette.</li>
	<li>MOMP-tNLP'erne elueres i seks 300 μL fraktioner af elueringsbuffer 1 (indeholdende 250 mM imidazol) efterfulgt af en endelig eluering med 300 μL elueringsbuffer 2 (indeholdende 500 mM imidazol). På den anden eluering omrøres harpiksen kraftigt ved pipettering op og ned ved hjælp af en 1 ml pipette.</li>
</ol>6. Analyse af SDS-PAGE
BEMÆRK: Alle elueringsfraktioner skal analyseres af SDS-PAGE for at screene for mængde og renhed af proteinet af interesse.
<ol><li>Der fyldes 1 μL hver af de totale lysater og gennemstrømninger og derefter 5 μL for alle opsamlede vaske- og elueringsfraktioner.<ol><li>Bland alikvoter af de eluerede MOMP-tNLP'er, vasker, gennemstrømning og total lysat med 4x SDS-PAGE prøveindlæsningsbuffer. Prøverne blandes og varmedenatureres med 10x prøvereduktionsmiddel, medmindre andet er angivet.</li>
		<li>Analyser fraktionerne ved gelelektroforese ved hjælp af 1,0 mm, 4 til 12%, Bis-Tris SDS-PAGE geler med 1x MES-SDS løbende buffer sammen med en passende molekylvægtstandard. Kør gelerne i 35 min ved 200 V.</li>
	</ol></li>
	<li>Plet gelerne i henhold til producentens anvisninger.<ol><li>Fjern gelen fra kassetten og læg den i 60 ml gelplet. Mikrobølge gelen i gelpletten i 30 s, og vugge forsigtigt beholderen i 30 s for at fordele varmen jævnt. Mikrobølge gelen i pletten til 80-85 °C i yderligere 30 s, og læg gelen på en orbital shaker for at rocke i 5 min.</li>
		<li>Mikrobølge gelen en tredje gang i 30 s, og vend derefter tilbage til orbitalrysteren for at rocke i yderligere 23 minutter.</li>
		<li>Overfør gelen til en ren beholder og vask i 100 ml vaskeopløsning (10% methanol, 7% eddikesyre) i 30 min. BEMÆRK: Dette er et kritisk trin, da det er vigtigt at undgå opvarmning af vaskeopløsningen. I modsat fald kan det resultere i baggrundsfarvning og uregelmæssigheder i det endelige gelbillede.</li>
		<li>Efter vask skylles gelen i ultrarent vand to gange i 5 minutter hver.</li>
		<li>Gelerne afbildes ved hjælp af en gelbilleddanner ved 600 nm (figur 2). Brug SDS-PAGE til at kvantificere mængden af individuelt protein i nanopartikelopløsningen, hvis der er en proteinstandard til sammenligning. BEMÆRK: I dette eksempel opløses serielle fortyndinger af rekombinant udtrykt MOMP af SDS-PAGE, og båndenes tætheder kvantificeres ved hjælp af instrumentsoftware.</li>
		<li>Generer en standardkurve ved hjælp af MIMP-båndenes tætheder. MOMP-tNLP-prøverne opløses på den samme SDS-PAGE-gel, og partiklernes MOMP-komponent beregnes ved hjælp af MOMP-standardkurven (figur 3).</li>
	</ol></li>
</ol>7. Western og dot blots og opbevaring
<ol><li>Til western blotting opløses prøverne med SDS-PAGE og overføres gelerne ved hjælp af et kommercielt tørblottingsystem med standardindstillinger i henhold til producentens protokol.<ol><li>Blottene fjernes fra stakken, når overførslen er afsluttet, og hver plet inkuberes natten over ved 4 °C i en passende blokerende buffer indeholdende 0,2 % Tween 20 og enten 0,5 mg/ml MAb40 eller 0,2 mg/ml MAbHIS anti-His-tag antistof rettet mod His-mærket fra Δ49ApoA1-proteinet. BEMÆRK: De antistoffortyndinger, der anvendes til blotting, er 1: 1.000 for MAb40 og 1: 500-1.000 for MAbHIS antistof.</li>
		<li>Hver plet vaskes 3 gange i 5 minutter med PBS-T (1x PBS, 0,2% Tween 20, pH 7,4).</li>
		<li>Inkuber blottene i 1 time i blokerende buffer indeholdende sekundært antistof konjugeret med en fluorofor (f.eks. IRDye) ved en 1:10.000 fortynding.</li>
		<li>Vask blotterne igen 3 gange i 5 minutter med PBS-T. Brug et fluorescenskamera til at afbilde blotterne efter den endelige vask.</li>
	</ol></li>
	<li>For dot blots, blot 3 μg renset MOMP-tNLP og tom tNLP ved hjælp af et dot blot-apparat. Bloker og udvikl blotterne ved hjælp af de samme metoder, der er beskrevet ovenfor for western blotting.</li>
</ol>8. Vurdering af endotoksin
<ol><li>Kvantificer endotoksinniveauer ved hjælp af et endotoksintestsystem baseret på Limulus Amebocyte Lysate (LAL) assay. Forbered endotoksinfri 25 mM Tris, pH 7,4, prøvebuffer ved hjælp af 1 M Tris hydrochloridopløsning og endotoksinfrit vand. BEMÆRK: Prøver skal typisk fortyndes ved hjælp af denne prøvebuffer, og fortyndingerne justeres for at finde det passende interval for individuelle prøver. Her fortyndes MOMP-tNLP-prøver 500 gange i prøvebuffer, og 25 μL lægges i hver brønd i en enhedspatron med en følsomhed på 0,05 EU / ml. Endotoksinniveauerne af MOMP-tNLP og tom tNLP, der anvendes i museundersøgelserne beskrevet nedenfor, er mellem 0,4 og 12 EU/μg protein afhængigt af prøven.</li>
</ol>9. Lyofilisering
<ol><li>Frysefryse og opbevare MOMP-tNLP nanopartikler til langvarig (op til år) brug ved -20 °C. For at forberede tNLP- og MOMP-tNLP-suspensioner til lyofilisering tilsættes trehalose som beskyttelsesmiddel under fryse- og frysetørringsprocessen. BEMÆRK: Denne proces er blevet grundigt valideret for en række tNLP-formuleringer 7,8.</li>
	<li>Det aktuelle volumen af MOMP-tNLP-opløsningen divideres med 9 for at opnå volumenet på 1 M trehalose i sterilt, endotoksinfrit, deioniseret vand, der kræves for at nå en endelig koncentration på 0,1 M trehalose. Bemærk det endelige volumen og delprøve i endotoksinfrie 15 ml eller 50 ml polypropylenrør efter ønske.</li>
	<li>Frys den blandede opløsning på tøris og frysefiliser den natten over ved hjælp af en lyofilisator. De tørrede formuleringer opbevares ved -20 °C, indtil de skal bruges.</li>
	<li>Rekonstituer frysetørrede tNLP'er ved hjælp af endotoksinfrit vand. Rul forsigtigt, indtil den frysetørrede kage er helt opløst og rehydreret. For at fjerne trehalose dialyseres opløsningen mod PBS ved hjælp af en 3,5 kDa afskåret dialysemembran.</li>
</ol>10. Tilsætning af adjuvans
BEMÆRK: Disse og andre lignende NLP-baserede underenhedsvaccineformuleringer kan let inkorporere lipofile adjuvanser såsom CpG-ODN1826 og FSL-1. CpG-ODN1826 er et modificeret klasse B CpG-oligonukleotid (5'-tccatgacgttcctgacgtt-3') med en fuld phosphorothioat-rygrad med en 5' kolesteroldel (5'-chol-C6). Konjugeringen af CpG-ODN1826 til tNLP'er medieres af de hydrofobe interaktioner mellem kolesteroldelen og phospholipid-dobbeltlaget af tNLP og er blevet demonstreret og velkarakteriseret, som tidligere rapporteret 9,10.
<ol><li>Før inkorporering i disse formuleringer renses den kolesterolmodificerede CpG ved omvendt fasekromatografi for at fjerne forurenende endotoksin såvel som eventuelle umodificerede CpG-molekyler.<ol><li>Efter modtagelse fra sælgeren rehydreres det frysetørrede CpG-materiale i endotoksinfrit vand og renses på en præparativ C4 RP-HPLC-søjle ved hjælp af en separationsgradient bestående af 10 mM triethylammoniumacetat (TEAA) (mobil fase A) og acetonitril (mobil fase B). BEMÆRK: Yderligere oplysninger findes i tabel 2.</li>
		<li>Pool og frysetørret fraktionerne indeholdende kolesterolmodificeret CpG. For at sikre fuldstændig fjernelse af resterende TEAA rekonstitueres CpG med 15 ml endotoksinfrit vand og frysefryses tre gange.</li>
		<li>Efter den endelige frysetørring rekonstitueres CpG i endotoksinfrit vand (>20 mg/ml endelig CpG-koncentration), alikvote, og opbevares ved -80 °C, indtil det er nødvendigt. For tilsætning til formuleringer fortyndes CpG til en koncentration på 1-2,5 mg / ml. BEMÆRK: FSL-1 fås som et frysetørret pulver af vaccinekvalitet. Dette rekonstitueres ved hjælp af sterilt og endotoksinfrit vand i en koncentration på 1 mg / ml. Vaccinen administreres intramuskulært (i.m.), hvor hver dosis indeholder 10 μg MOMP i et samlet volumen på 50 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>For at opnå den ønskede formuleringsdosis dialyseres nanopartiklerne i PBS og koncentreres ved hjælp af en centrifugalvakuumkoncentrator før tilsætning af adjuvans. Vær forsigtig, når du gør dette for at forhindre fuldstændig tørring af prøven - kontroller prøvevolumenet hvert 20.-30. minut under centrifugering.</li>
	<li>Tilsæt adjuvansen under sterile forhold i et biosikkerhedsskab. For at vurdere vellykket inkorporering skal du analysere de endelige formuleringer og deres komponenter ved analytisk størrelseseksklusionskromatografi (SEC). BEMÆRK: Til disse præparater blev der anvendt en SEC-kolonne i PBS-buffer (0,5 ml/m i strømningshastighed), og eluering blev detekteret ved hjælp af en UV-vis diode array-detektor. Inkorporeringen blev vurderet ved at sammenligne absorptionen af de adjuvanserede partikler med absorptionen af de ikke-adjuvanserede partikler ved 214 og 280 nm.</li>
	<li>Den adjuvanserede MOMP-tNLP opbevares og tømmes tNLP ved 4 °C inden dyrebrug i op til 14 dage. For fuldt ud at vurdere stabiliteten af en ny tNLP-formulering skal du regelmæssigt analysere de lagrede tNLP'er efter SEC. BEMÆRK: Stabiliteten varierer fra formulering til formulering.</li>
</ol>11. Serumtest
<ol><li>Få kvindelige 3 uger gamle mus (BALB / c, n = 6).</li>
	<li>Vacciner musene intramuskulært (i.m.) i hvert bagben med 10 μg MOMP i form af MOMP-tNLP adjuveret med 5 μg CpG og 1 μg FSL-1 (samlet volumen pr. injektion = 50 ml).</li>
	<li>Efter vaccination skal du observere musene, indtil de er i stand til at opretholde bryst liggende.</li>
	<li>Fire uger efter den første vaccination (prime) vaccineres dyrene for anden gang (boost) med 10 μg MOMP i form af MOMP-tNLP adjuvanseret med 5 μg CpG og 1 μg FSL-1 (totalvolumen pr. injektion = 50 ml).</li>
	<li>På dag 56 efter den første vaccination indsamles blod for at vurdere antistoftitere. Begynd med at bedøve musene ved at injicere i.p. en opløsning af xylazin (0,3 mg / 20 g legemsvægt) og ketamin (3,0 mg / 20 g legemsvægt). Klem for- og bagbenene for at sikre, at der ikke opstår ryk. Påfør vaselin omkring øjnene for at forhindre øjentørhed under anæstesi.</li>
	<li>Brug et mikro-hæmatokrit kapillarrør til at punktere retro-orbital plexus. Saml 100 ml blod i et mikrocentrifugerør.</li>
	<li>Efter blodindsamling skal du observere musene, indtil de kommer sig efter anæstesi og kan opretholde bryst liggende.</li>
	<li>Lad blodet størkne ved stuetemperatur i 30 min og drej derefter ned ved 2.000 × g i 10 min. Serumet opsamles og fryses ved -80 °C.</li>
	<li>På dette tidspunkt skal du udfordre dyrene med Chlamydia muridarum eller aflive dem. Afliv musene ved først at injicere i.p. en opløsning af xylazin (0,3 mg/20 g legemsvægt) og ketamin (3,0 mg/20 g legemsvægt) efterfulgt af cervikal dislokation.</li>
	<li>Testér serumantistoffer, der er specifikke for MOMP, ved hjælp af western blotting-teknikker som beskrevet ovenfor. Pool musesera fra alle immuniserede mus og brug det poolede serum i stedet for et primært antistof ved 1:5.000 fortynding.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li><li>Coleman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+association+of+the+Yersinia+pestis+translocon+proteins,+YopB+and+YopD,+are+facilitated+by+nanolipoprotein+particles.">Expression and association of the Yersinia pestis translocon proteins, YopB and YopD, are facilitated by nanolipoprotein particles.</a> PLoS One. 11 (3), 0150166 (2016).</li><li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein,+forming+soluble+nanolipoprotein+particles.">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+diameter,+monodispersity,+and+solubility+of+ApoA1+nanolipoprotein+particles+using+telodendrimer+chemistry.">Controlling the diameter, monodispersity, and solubility of ApoA1 nanolipoprotein particles using telodendrimer chemistry.</a> Protein Science. 22 (8), 1078-1086 (2013).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+production+of+a+functional+oligomeric+form+of+a+Chlamydia+major+outer-membrane+protein+(MOMP)+for+vaccine+development.">Cell-free production of a functional oligomeric form of a Chlamydia major outer-membrane protein (MOMP) for vaccine development.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 15121-15132 (2017).</li><li>Tifrea, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protection+in+mice+against+a+Chlamydia+muridarum+respiratory+challenge+by+a+vaccine+formulated+with+the+major+outer+membrane+protein+in+nanolipoprotein+particles.">Induction of protection in mice against a Chlamydia muridarum respiratory challenge by a vaccine formulated with the major outer membrane protein in nanolipoprotein particles.</a> Vaccines. 9 (7), 755 (2021).</li><li>Cleveland, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+X-ray+and+neutron+scattering+demonstrates+that+cell-free+expression+produces+properly+formed+disc-shaped+nanolipoprotein+particles.">Small-angle X-ray and neutron scattering demonstrates that cell-free expression produces properly formed disc-shaped nanolipoprotein particles.</a> Protein Science. 27 (3), 780-789 (2018).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+to+nickel-chelating+nanolipoprotein+particles+increases+the+potency+and+efficacy+of+subunit+vaccines+to+prevent+West+Nile+encephalitis.">Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (6), 1018-1022 (2010).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalized+delivery+of+adjuvant+and+antigen+using+nanolipoprotein+particles+enhances+the+immune+response+to+recombinant+antigens.">Colocalized delivery of adjuvant and antigen using nanolipoprotein particles enhances the immune response to recombinant antigens.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (6), 2044-2047 (2013).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanolipoprotein+particles+(NLPs)+as+an+in+vivo+delivery+platform.">Evaluation of nanolipoprotein particles (NLPs) as an in vivo delivery platform.</a> PLoS One. 9 (3), 93342 (2014).</li><li>Pal, S., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+the+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein+can+elicit+an+immune+response+as+protective+as+that+resulting+from+inoculation+with+live+bacteria.">Vaccination with the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein can elicit an immune response as protective as that resulting from inoculation with live bacteria.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8153-8160 (2005).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+major+outer+membrane+protein+of+Chlamydia+trachomatis.">Structural and functional analyses of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 189 (17), 6222-6235 (2007).</li><li>Hafner, L. M., Wilson, D. P., Timms, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+status+and+future+prospects+for+a+vaccine+against+Chlamydia+trachomatis+infection.">Development status and future prospects for a vaccine against Chlamydia trachomatis infection.</a> Vaccine. 32 (14), 1563-1571 (2014).</li><li>Findlay, H. E., McClafferty, H., Ashley, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression,+single-channel+analysis+and+membrane+topology+of+recombinant+Chlamydia+trachomatis+Major+Outer+Membrane+Protein.">Surface expression, single-channel analysis and membrane topology of recombinant Chlamydia trachomatis Major Outer Membrane Protein.</a> BMC Microbiology. 5, 5 (2005).</li><li>Sun, G., Pal, S., Weiland, J., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+an+intranasal+challenge+by+vaccines+formulated+with+native+and+recombinant+preparations+of+the+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein.">Protection against an intranasal challenge by vaccines formulated with native and recombinant preparations of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein.</a> Vaccine. 27 (36), 5020-5025 (2009).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+of+functional+receptor+tyrosine+kinases.">Cell-free expression of functional receptor tyrosine kinases.</a> Scientific Reports. 5 (1), 12896 (2015).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen kendte konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold, der kunne have syntes at påvirke det arbejde, der er rapporteret i dette papir.

Klamydia er den mest almindelige seksuelt overførte infektion, der påvirker både mænd og kvinder. Selvom vaccineforskning på klamydia spænder over årtier, er en sikker og effektiv vaccine, der kan skaleres til masseproduktion, forblevet undvigende13. Chlamydial MOMP betragtes som hovedkandidat som et beskyttende vaccineantigen; MOMP er dog meget hydrofob og tilbøjelig til forkert foldning14,15. Yderligere undersøgelser har afsløret, at MOMP findes i oligomere tilstande, der er afgørende for dets immunogenicitet11. Detaljeret her er en valideret, cellefri co-ekspressionsmetode, der producerer oligomere MOMP dannet i tNLP nanopartikel som en vaccine med udbytter på ca. 1,5 mg renset MOMP pr. 3 ml lysat. Denne fuldt indsamlede procedure kan skaleres yderligere til industriel produktion, hvilket øger udsigterne som en nyttig tilgang til generering af vacciner.
Vi har tidligere publiceret om brugen af cellefri ekspression til at producere membranproteiner indlejret i NLP'er 3,16, samt ekspression i telodendrimer-stabiliserede skiver. Denne sidstnævnte teknik producerede imidlertid membranproteinpartikler med større heterogenitet og lavere opløselighed. 4 Derudover er immunogeniciteten af MOMP-telodendrimerpartikler uklar sammenlignet med MOMP-tNLP-partikler6.
Denne procedure kan tilpasses til at opskalere ekspressionen af bakterielle membranproteiner, der er lovende kandidater som antigener til brug i underenhedsvacciner. Ikke alene producerer denne procedure opløseligt bakteriemembranprotein, men den overordnede nanopartikelstruktur kan ændres yderligere ved hjælp af en række lipofile vaccineadjuvanser, herunder, men ikke begrænset til, CpG konjugeret til en kolesteroldel eller FSL-1. Ekspression af andre kandidatantigener fra bakterier er mulig, selvom parametre som ekspressionstemperatur, lipidvalg og type ekspressionssystem muligvis skal undersøges for at opnå optimale udbytter.
Derudover er plasmidvalg og -forhold afgørende i denne proces. Begge anvendte plasmider skal konstrueres fra samme rygrad. Hvis indsatserne er omtrent samme længde, kan forholdene baseres på massen af det tilsatte plasmid som beskrevet her. Imidlertid vil forhold baseret på mol give mere reproducerbare resultater, især ved skalering af reaktionerne. Forhold, der fungerer godt i skærmskalareaktioner (< 0,5 ml), gælder muligvis ikke for større reaktioner og kan kræve yderligere optimering. Ikke-membranproteiner kan stadig udtrykkes ved hjælp af cellefrie kits, men kræver muligvis ikke lipidnanopartiklen (co-ekspression) for at producere et opløseligt produkt. Derudover, mens denne protokol beskriver adjuvans med CpG og FSL-1, er dette system egnet til formulering med andre lipofile adjuvanser eller blanding med opløselige adjuvanser efter ønske.
Det er vigtigt at undgå kontaminering, når den cellefrie ekspressionsreaktion opsættes, da dette kan påvirke udbyttet. Eventuelle tilsætningsstoffer til reaktionen, herunder plasmiderne selv, bør være meget rene. Derudover bør de udtrykte proteiner kun være i kontakt med materialer og opløsninger, der er fri for endotoksinforurening. Endotoksinforurening i kandidatformuleringer kan føre til inkonsekvente og falske resultater af immunologiske assays og kan være skadelige i tilstrækkelige mængder. Selvom det ikke er beskrevet her, kan yderligere oprensning efter nikkelaffinitetskromatografi være nødvendig, hvis mange forurenende stoffer observeres i efterfølgende analysetrin, såsom gennem SDS-PAGE. Dette kan opnås med SEC, selvom forholdene kan kræve optimering på formuleringsbasis.

Prokaryote eller eukaryote lysater til cellefri ekspression af proteiner er let tilgængelige som kommercielle produkter til syntetisering af proteiner af interesse (for en fuldstændig gennemgang, se 1). Disse ekspressionssystemer er tilgængelige i forskellige skalaer og udnytter lysater fra forskellige organismer, herunder E. coli, tobaksplanter og pattedyrkulturer. Cellefri lysater tilbyder flere fordele i forhold til traditionelle rekombinante proteinproduktionsmetoder, herunder brugervenlighed og robust, hurtig proteinproduktion. Mens disse tilgange primært bruges til at producere opløselige proteiner, har denne gruppe været banebrydende for en tilgang til deres anvendelse til at udtrykke membranproteiner.
Denne nye tilgang foretager mindre ændringer af eksisterende cellefrie ekspressionssystemer ved at inkludere DNA, der koder for to proteinprodukter til ekspression, et apolipoprotein og membranproteinet af interesse. Det udtrykte apolipoprotein (derivater af enten ApoA1 eller ApoE4) interagerer med lipider tilsat til det cellefrie lysat for spontant at samle (~ 20 nm) NLP'er. Når det oversættes sammen med et membranprotein af interesse, danner NLP og membranproteinet et opløseligt nanopartikelkompleks, hvori membranproteinet er indlejret i NLP-lipiddobbeltlaget. Således er membranproteinet mere tilgængeligt til downstream-applikationer, da det er indeholdt i opløselige, diskrete partikler. Denne tilgang kan producere funktionelle oligomere proteinkomplekser inden for NLP-dobbeltlag2 og kan producere antigenkomponenten i en underenhedsvaccine, som efterfølgende blandes med lipofile adjuvanser til dannelse af en nanopartikelvaccine med co-lokaliseret antigen og adjuvans egnet til in vivo-vurdering .
Denne aktuelle metode er ændret fra en tidligere offentliggjort protokol3. Nøglemodifikationer er fokuseret på opskalering af den cellefrie reaktion og efterfølgende oprensning af protein-NLP-komplekset. En yderligere modifikation indbefatter tilsætning af en amfifil polymer kendt som en telodendrimer, som først blandes med lipiderne før tilsætning til den cellefrie reaktion. Co-oversættelse af plasmiderne i nærvær af telodendrimer og lipiderne producerer en telodendrimer NLP (tNLP). Tilsætningen af telodendrimer hjælper også med at modulere størrelsen og monodispersiteten af de resulterende tNLP nanopartikler4. Denne protokol er specifikt optimeret til store vaccinestudier til fremstilling af et membranbundet underenhedsantigenprotein, chlamydial MOMP 5,6. Metoden producerer rekombinant MOMP forbundet med tNLP til dannelse af et meget opløseligt MOMP-tNLP-kompleks, der bevarer MOMP-oligomerisering. En typisk 3 ml opskaleringsproduktion giver >1,5 mg renset MOMP. Den cellefri producerede MOMP-tNLP kan hurtigt tilsættes adjuvans til in vivo immunogenicitetstest.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2600028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Trizma hydrochloride solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial, ACS reagent, &#8805;99.7%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer Dam for XCell SureLock</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C24 Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit</td>
			<td>BiotechRabbit</td>
			<td>BR1400201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete His-Tag Purification Resin</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td>5893682001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG-ODN1826</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71508-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe PTS cartridge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9594798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe-PTS Testing System</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl and NaOH solutions for pH adjustment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC with UV-vis diode array detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure culture-grade water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Dry Blotting System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>IB24001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio V2.0 software</td>
			<td>Li-COR Biiosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Fc imager</td>
			<td>Li-COR Biiosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (&#8805;99.9%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP000202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIVEX2.4d vector</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 1000 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 20 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 200 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipettes</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic NaH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200, 5/150 GL column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>GE28-9909-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>&#160;tlrl-fsl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby Protein Gel Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Bench Top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 15 mL conicals (89039-666)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 50 mL conicals (89039-656)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies )</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free scaled production and adjuvant addition to a recombinant major outer membrane protein from chlamydia muridarum for vaccine development

Underenhedsvacciner giver fordele i forhold til mere traditionelle inaktiverede eller svækkede helcelleafledte vacciner i sikkerhed, stabilitet og standardfremstilling. For at opnå en effektiv proteinbaseret underenhedsvaccine skal proteinantigenet ofte vedtage en native-lignende konformation. Dette er især vigtigt for patogenoverfladeantigener, der er membranbundne proteiner. Cellefrie metoder er med succes blevet anvendt til at producere korrekt foldet funktionelt membranprotein gennem co-oversættelse af nanolipoproteinpartikler (NLP'er), almindeligvis kendt som nanodiske. 
Denne strategi kan bruges til at producere underenhedsvacciner bestående af membranproteiner i et lipidbundet miljø. Imidlertid er cellefri proteinproduktion ofte begrænset til lille skala (<1 ml). Mængden af protein, der produceres i små produktionsserier, er normalt tilstrækkelig til biokemiske og biofysiske undersøgelser. Den cellefrie proces skal dog skaleres op, optimeres og omhyggeligt testes for at opnå nok protein til vaccinestudier i dyremodeller. Andre processer, der er involveret i vaccineproduktion, såsom oprensning, tilsætning af adjuvans og lyofilisering, skal optimeres parallelt. Dette papir rapporterer udviklingen af en opskaleret protokol til at udtrykke, rense og formulere en membranbundet proteinunderenhedsvaccine. 
Opskalerede cellefrie reaktioner kræver optimering af plasmidkoncentrationer og -forhold, når der anvendes flere plasmidekspressionsvektorer, lipidudvælgelse og adjuvanstilsætning til produktion på højt niveau af formulerede nanolipoproteinpartikler. Metoden demonstreres her med ekspression af et chlamydial major ydre membranprotein (MOMP), men kan anvendes bredt på andre membranproteinantigener. Antigeneffektivitet kan evalueres in vivo gennem immuniseringsundersøgelser for at måle antistofproduktion, som demonstreret her.

SDS-PAGE-profilen for Ni-affinitetsoprensning af MOMP-tNLP fra en 1 ml cellefri reaktion er vist i figur 1B. Reaktionen resulterede i høje ekspressionsniveauer for både MOMP og Δ49ApoA1-proteinet. Tidligere resultater viste, at den cellefrie ekspression af Δ49ApoA1 i nærvær af DMPC og telodendrimer resulterede i dannelsen af telodendrimer nanolipoproteinpartikler (tNLP'er)4. Sam-elueringen af MOMP med Δ49ApoA1 indikerede, at MOMP er forbundet med tNLP'er, da His-mærket kun er til stede på tNLP-stilladset Δ49ApoA1 og ikke på MOMP. MOMP er et meget uopløseligt protein, der kun kan elueres gennem kompleksdannelse med tNLP'er, som har vist sig at lette opløseligheden af membranproteiner.
Elueringsfraktionerne indeholdende MOMP-tNLP'er blev samlet, og den totale proteinkoncentration blev bestemt ved hjælp af en fluorescensbaseret kvantificeringsanordning eller en anordning, der måler koncentrationen gennem absorbans ved 280 nm, efter producentens anvisninger for proteinkvantificering. For at muliggøre præcis dosering af MOMP-vaccinen er det også vigtigt at bestemme koncentrationen af MOMP i de oprensede komplekser. Vi udviklede en metode til kvantificering af MOMP baseret på geldensitometri (figur 2), hvor en oprenset rekombinant MOMP med kendt koncentration blev anvendt som standard. Ved at etablere standardkurven og sammenligne den med MOMP-tNLP-prøven kan MOMP-koncentrationen kvantificeres nøjagtigt. Bestemmelsen af MOMP-koncentrationen i den oprensede prøve gjorde det muligt at estimere udbyttet af MOMP i cellefrie reaktioner på forskellige skalaer, hvilket er vigtigt for planlægningen af reaktionsopsætningen, der er passende for downstream-undersøgelser (tabel 3).
MOMP skal danne oligomerer for at fremkalde et robust immunrespons11. For at teste MOMP's oligomere tilstand blev MOMP-tNLP analyseret i nærvær og fravær af både varme og reduktionsmidlet dithiothreitol (DTT, 50 mM, figur 3A). Højere ordens oligomerer af MOMP blev identificeret gennem SDS-PAGE, når prøver ikke blev behandlet med varme og DTT. Til sammenligning viste prøver behandlet med varme i nærvær af DTT primært to forskellige bånd på gelen, svarende til MOMP og Δ49ApoA1 (henholdsvis ca. 40 kDa og 22 kDa). Disse resultater ligner meget gelbåndsmønsteret, der tilskrives oligomerdannelse af MOMP, hvilket er kritisk for dets effektivitet.
Yderligere western blot-analyse ved hjælp af MAb40, et antistof mod den lineære epitop på MOMP-proteinets variable domæne, viste et lignende båndmønster, hvilket bekræftede oligomerdannelsen af MOMP-protein i dets ikke-denaturerede tilstand (figur 3B). En vigtig faktor, der påvirker MOMP-oligomerdannelsen, er forholdet mellem MOMP-plasmidet og Δ49ApoA1-plasmidet under den cellefrie reaktionsopsætning. Tabel 4 viser forholdet mellem plasmider og den resulterende indsættelseshastighed for MOMP i tNLP'er. Tidligere undersøgelser viste, at chlamydial MOMP og andre ydre membranproteiner primært kan eksistere som trimere12. For at maksimere trimerdannelsen i den cellefrie reaktion er det ønskeligt at have indsættelseshastigheden tæt på tre MOMP-proteiner pr. NLP, hvilket svarer til et ~ 25: 1 MOMP-til-Δ49ApoA1 plasmidforhold.
Et punktum blot-assay blev brugt som en mere strømlinet metode til at detektere tilstedeværelsen af MOMP og tNLP. MAb40-antistoffet blev brugt til at detektere total MOMP. MAbHIS-antistoffet rettet mod His-mærket på Δ49ApoA1-stilladset på tNLP blev brugt til at vurdere tilstedeværelsen af tNLP. Co-signaleringen af MAb40 og MAbHIS antistoffer indikerede MOMP-tNLP dannelse. Kontrolreaktionen producerede tom tNLP, som kun viste et positivt signal fra MAbHIS (figur 3C). For at teste immunogeniciteten af MOMP-tNLP'er produceret i den cellefrie reaktion adjuvanserede vi MOMP-tNLP med CpG + FSL-1 og injicerede intramuskulært (i.m.) i mus i et prime-boost-regime som beskrevet ovenfor. Sera blev indsamlet fra de immuniserede mus, og MOMP-specifikt IgG-antistof blev målt ved hjælp af et western blot-assay (figur 4). Sera fra mus injiceret med adjuveret MOMP-tNLP viste stærk MOMP-binding, hvilket indikerer, at MOMP-tNLP kunne fremkalde et immunrespons in vivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig01.jpg"> Figur 1: Ekspression og oprensning af MOMP-tNLP. (A) Billede af rør indeholdende små delprøver af en cellefri reaktion, der med succes udtrykte GFP-kontroller, der lyser under UV-lyskilde (højre) sammenlignet med lysater uden GFP-plasmid (venstre). (B) Proteingel farvet med SYPRO Ruby efter SDS-PAGE viser rensningsprofilen for MOMP-tNLP. MOMP migrerer ved 40 kDa og 49ApoA1 migrerer ved 22 kDa. Forkortelser: MOMP = chlamydial major ydre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoprotein partikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-kompleks; GFP = grønt fluorescerende proteinkodende plasmid; MW = Molekylvægtsmarkør; T = total cellefri lysat; FT = gennemstrømning; R1-R3 = cellefrie reaktionsallikvotter; W1, W6 = vasker 1 og 6; E1-E7 = Elutioner 1 til 7; Δ49ApoA1 = Hans-tagget mus ApoA1 derivat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig02.jpg"> Figur 2: Kvantificering af MOMP i MOMP-tNLP-prøver. (A) SDS-PAGE gel farvet med SYPRO Ruby til kvantificering af MOMP. Rekombinant MOMP med kendt koncentration blev lagt på gelen for at opnå standardkurven. Hver bane indeholdt 0,1 μg, 0,5 μg, 1,0 μg, 2,0 μg og 4,0 μg MOMP. MOMP-tNLP-prøver, der blev kvantificeret, blev lagt på den samme gel. (B) MOMP-koncentrationsstandardkurven blev genereret ved hjælp af densitometri. En ligning vedrørende normaliseret båndtæthed og mængden af MOMP blev etableret. Ligningen blev brugt til at beregne MOMP-indholdet i de ukendte prøver. Forkortelser: MOMP = chlamydial major ydre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoprotein partikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-kompleks; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig03.jpg"> Figur 3: Cellefrit produceret MOMP-tNLP tillader MOMP at danne strukturer af højere orden. (A) SDS-PAGE gel af MOMP-tNLP med og uden behandling af varme og reduktionsmiddel DTT, farvet med SYPRO Ruby. Med varme og DTT fremstod MOMP primært som et monomerbånd ved ~40 kDa, da varme og reduktionsmidlet nedbrød størstedelen af MOMP-strukturen af højere orden. I fravær af varme og DTT var de højere ordensbånd til stede, hvilket indikerer MOMP oligomerkonformation. B) Western blottet af MOMP-tNLP og MOMP alene, ubehandlet og behandlet med varme og DTT. Efter overførslen blev membranen undersøgt med MAb40 (1:1.000 fortynding). Et båndmønster svarende til SYPRO Ruby-farvet gel blev observeret, hvilket bekræftede, at båndene med højere molekylvægt faktisk var MOMP-oligomerer. (C) Dot blot, MOMP-tNLP og tomme tNLP-prøver (i to eksemplarer) undersøgt med MAb40 og MAbHIS. Forkortelser: MOMP = chlamydial major ydre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoprotein partikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-kompleks; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese; DTT = dithiothreitol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig04.jpg"> Figur 4: Cellefrit produceret MOMP-tNLP er stærkt immunogent. Serum fra immuniserede mus viste stærkt anti-MOMP IgG-signal. MOMP-tNLP adjuvanseret med CpG + FSL-1 blev brugt til at immunisere mus. Sera fra seks immuniserede mus blev indsamlet, samlet og brugt til at sonde MOMP-tNLP. Serummet var i stand til at binde til MOMP i et western blotting-assay og viste stærkt IgG-signal (venstre). Western blot, der brugte MAb40 som primært antistof (højre), viste lignende bånd, hvilket indikerer, at serumet indeholdt MOMP-specifikt IgG. Forkortelser: MOMP = chlamydial major ydre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoprotein partikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-kompleks; CpG = kolesterolmodificeret CpG-adjuvans; FSL-1 = lipofil adjuvans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Buffer navn</td>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>Imidazol</td>
			<td>ph</td>
		</tr><tr><td>Bindende buffer</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Vask buffer</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Elueringsbuffer 1</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>250 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Elueringsbuffer 2</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Liste over buffere, der er nødvendige til rensning af nikkelaffinitet, med detaljerede koncentrationer af hver komponent og pH.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Runtime</td>
			<td>50 minutter</td>
		</tr><tr><td>Strømningshastighed</td>
			<td>6,0 ml/min</td>
		</tr><tr><td>Gradueringstype</td>
			<td>Binær</td>
		</tr><tr><td>Buffer A</td>
			<td>10 mM TEAA i H20</td>
		</tr><tr><td>Buffer B</td>
			<td>MeCN</td>
		</tr><tr><td>Stigning</td>
			<td>% buffer B</td>
		</tr><tr><td>0 min</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>30 minutter</td>
			<td>60%</td>
		</tr><tr><td>30,5 min</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>40 minutter</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>40,5 min</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>50 minutter</td>
			<td>25%</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Betingelser for omvendt fase HPLC-oprensning af kolesterolmodificeret CpG. Forkortelser: TEAA = triethylammoniumacetat; MeCN = acetonitril.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Cellefrit lysat (ml)</td>
			<td>DMPC lipid (mg)</td>
			<td>Telodendrimer (mg)</td>
			<td>MOMP plasmid (μg)</td>
			<td>Renset MOMP-udbytte (mg)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>0.4</td>
			<td>15</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>8</td>
			<td>0.8</td>
			<td>30</td>
			<td>1.1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>12</td>
			<td>1.2</td>
			<td>45</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>75</td>
			<td>2.7</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 3: Mængden af lipider, telodendrimer og plasmider, der anvendes til forskelligt skalerede cellefrie reaktioner og de tilsvarende udbytter. Forkortelser: MOMP = chlamydial major ydre membranprotein; DMPC = 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Forhold mellem plasmidinput, MOMP: Δ49ApoA1</td>
			<td>1:1</td>
			<td>5:1</td>
			<td>10:1</td>
			<td>25:1</td>
			<td>50:1</td>
			<td>100:1</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Forholdet mellem mængden af produceret protein, MOMP : Δ49ApoA1</td>
			<td>0.02</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.64</td>
			<td>3.46</td>
			<td>6.55</td>
			<td>20.04</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Anslået antal MIMP-indsættelser pr. tNLP</td>
			<td>0.03</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.75</td>
			<td>4.04</td>
			<td>7.65</td>
			<td>23.39</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 4: Plasmidforholdene i en cellefri reaktion og de resulterende MOMP-indsættelseshastigheder. Forkortelser: MOMP = chlamydial major ydre membranprotein; tNLP = telodendrimer nanolipoprotein partikel; Δ49ApoA1 = Hans-tagget mus ApoA1 derivat.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development at JoVE.com

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Denne protokol beskriver brugen af kommercielle, cellefrie proteinekspressionssæt til fremstilling af membranproteiner understøttet i nanodisk, der kan bruges som antigener i underenhedsvacciner.

Cellefri skaleret produktion og adjuvans tilsætning til et rekombinant større ydre membranprotein fra Chlamydia muridarum til vaccineudvikling

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard ...

Mange kandidatunderenhedsvaccineantigener er membranproteiner. Historisk set har disse været vanskelige at producere og rense i tilstrækkelige mængder. Med denne teknik er vi i stand til at skabe antigener af interesse indlejret i en lipidmembran for at hjælpe med at sikre en native-lignende bekræftelse.Denne proces letter også formulering med adjuvanser af interesse. Cellefri ekspression muliggør hurtig produktion af proteiner af interesse i deres oprindelige tagless struktur. Denne teknik er også skalerbar, og vi arbejder allerede med kommercielle virksomheder om at udvikle vaccineformuleringer ved hjælp af denne proces.Vi demonstrerer processen her for et klamydiaantigen, men processen kan let tilpasses til at producere antigener af interesse, uanset om de er membranproteiner eller ej. Denne proces kan være anvendelig til udvikling af både patogen og kræftvaccine. Til at begynde med skal du forberede MOMP-tNLP'er ved at anvende en cellefri metode.Optø rekonstitutionsbufferen fra det cellefrie proteinekspressionssæt to timer før indstilling af reaktionen, og tilsæt EDTA-fri proteasehæmmer til bufferen. Brug et sæt designet til at køre fem milliliter reaktioner. For hver milliliter reaktion tilsættes 525 mikroliter rekonstitutionsbuffer til E. coli-lysatflasken og rulles for at opløses.Der tilsættes 250 mikroliter rekonstitutionsbuffer til reaktionsflasken indeholdende tilsætningsstoffet, og opløsningen opløses ved valsning. Derefter tilsættes 8,1 ml rekonstitutionsbuffer til reaktionsfødeflasken og rulles for at opløses. Til en flaske aminosyreblanding tilsættes tre ml rekonstitutionsbuffer for at opløse den.Til en anden flaske methionin tilsættes 1,8 ml rekonstitutionsbuffer, opløses og opbevares på is. Tilsæt 225 mikroliter af den rekonstituerede blanding, 270 mikroliter af den rekonstituerede aminosyreblanding uden methionin og 30 mikroliter rekonstitueret methionin til E. coli-lysatflasken. Yderligere tilsættes 400 mikroliter DMPC / telodendrimerblandingen, 15 mikrogram MOMP-plasmid og 0,6 mikrogram delta-49ApoA1 til blandingen og blandes den.Alikvote 20 mikroliter af den samlede opløsning i et 1,5 ml rør For en GFP-ekspressionskontrolreaktion. Forbered en foderopløsning ved at tilsætte 2,65 ml af den rekonstituerede aminosyreblanding uden methionin og 300 mikroliter rekonstitueret methionin. Overfør en milliliter af reaktionsopløsningen til det indre reaktionskammer i det cellefrie reaktionssæt og forsegl det.Fyld reaktionsbeholderens ydre kammer med 10 ml af fødeopløsningen og luk den. Der tilsættes 0,5 mikroliter GFP-kontrolplasmidet til 20 mikroliter alikvoter af reaktionsblandingen. Sæt reaktionen i en ryster ved 300 rotationer i minuttet i 18 timer ved 30 grader Celsius.Overvåg reaktionen under et UV-lys efter 15 minutter for fluorescens på grund af GFP-syntese. MOMP-tNLP nanopartikelkomplekset renses fra den cellefrie reaktionsblanding ved immobiliseret nikkelaffinitetskromatografi ved hjælp af HIS-mærket på delta-49ApoA1-proteinet. Overfør en milliliter af 50% opslæmningen af HIS-tag-rensningsharpiksen til en 10-ml engangskromatografikolonne, og tilsæt tre milliliter bindingsbuffer for at ekvilibrere.Derefter drænes bufferen og tilsættes 250 mikroliter bindingsbuffer til harpiksen. Uddrag 20 mikroliter af den cellefrie reaktionsblanding til SDS-PAGE-analyse. Tilsæt den resterende cellefrie reaktionsblanding med den ekvilibrerede harpiks og inkuber på en laboratorievipper i en time ved fire grader Celsius.Fjern søjlehætten og vask den med 500 mikroliter bindingsbuffer. Tilsæt vaskevæsken til søjlen, og opsaml gennemstrømningen til SDS-PAGE-analyse. Vask søjlen med en milliliter vaskebuffer med 20 millimolær imidazol seks gange og saml fraktionerne.Mens du vasker for anden gang, skal du bruge en milliliter pipette til at omrøre harpiksen. MOMP-tNLP'erne elueres i seks 300 mikroliter fraktioner af elueringsbuffer I indeholdende 250 millimolær imidazol og en endelig eluering med 300 mikroliter elueringsbuffer II indeholdende 500 millimolær imidazol. På den anden eluering omrøres harpiksen kraftigt ved pipettering op og ned ved hjælp af en milliliter pipette.Brug et gelkamera til at tage billederne ved 600 nanometer. Derefter kvantificeres mængden af forskellige proteiner i nanopartiklerne gennem SDS-PAGE-analyse ved hjælp af en proteinstandard. Tegn en standardkurve ved hjælp af tæthederne af MOMP-båndene.Bestem derefter MIMP-komponenten i nanopartiklerne med standarden. Opløs prøverne med SDS-PAGE og overfør gelstablerne ved hjælp af et kommercielt tørblottingsystem til Western blotting-analyse. Fjern blotterne fra stakken og inkuber dem natten over ved fire grader Celsius i en blokerende buffer indeholdende 0,2% TWEEN 20 og 0,5 mikrogram pr. milliliter MAb40 eller 0,2 mikrogram pr. milliliter MAbHIS antiHIS-tag antistof rettet mod HIS-mærket fra delta-49ApoA1 protein.Hver plet vaskes med PBST tre gange i fem minutter pr. vask. Inkuber blotterne i en time i en blokerende buffer indeholdende sekundært antistof konjugeret til en fluorofor i en fortynding på 1:10.000. Gentag vaskerne med PBST, og tag billedet ved hjælp af et fluorescenskamera efter den sidste vask.Brug et dot blot-apparat til at blotte tre mikrogram MOMP-tNLP og tømme tNLP. Udvikle og blokere blots ved hjælp af samme metode til Western blotting. Frys den blandede opløsning på tøris og frysefiliser den natten over ved hjælp af en lyofilisator.Opbevar de tørrede formuleringer ved minus 20 grader Celsius. Når det er nødvendigt, rekonstituere de frysetørrede tNLP'er med endotoksinfrit vand og rulle det for at opløse og rehydrere. Dialyser opløsningen med PBS og fjern trehalosen med en 3,5 kilodalton-cutoff dialysemembran.Nanopartikelopløsningen centrifugeres i en vakuumkoncentrator, inden adjuvansen tilsættes. Overvåg prøvevolumenet efter 20 til 30 minutter for at forhindre fuldstændig tørring. I et biosikkerhedsskab tilsættes adjuvansen under sterile forhold.Brug analytisk størrelseseksklusionskromatografi til at analysere formuleringen for vellykket inkorporering. Opbevar de adjuvanserede MOMP-tNLP'er og tøm tNLP ved fire grader Celsius i op til 14 dage. Analyser stabiliteten af tNLP-formuleringen med størrelsesekskluderingskromatografi.SDS-PAGE-analysen af MOMP-tNLP blev udført gennem nikkelaffinitetskromatografi, som viste, at den cellefrie reaktionsblanding har høje ekspressionsniveauer for både MOMP- og delta-49ApoA1-proteinerne. Ved at anvende geldensitometri blev MOMP-koncentrationen kvantificeret ved anvendelse af en renset rekombinant MOMP med en kendt koncentration som standard. For at bestemme oligomerdannelsen blev SDS-PAGE MOMP og MOMP-tNLP behandlet med varme og DTT, som viste forskellige bånd for MOMP og delta-49ApoA1.Western blot-analyse ved hjælp af et antistof MAb40 blev anvendt mod MOMP-protein, som afslørede et båndmønster, der bekræftede oligomerdannelsen af MOMP-protein i dets ikke-denaturerede tilstand. Et dot blot-assay blev udført i nærvær af MAb40- og MAbHIS-antistoffer, hvilket indikerede dannelsen af MOMP-tNLP. Tom tNLP viste imidlertid et positivt signal for MAbHIS.Sera fra de immuniserede mus injiceret med adjuveret MOMP-tNLP viste stærk MOMP-binding og indikerede, at MOMP-tNLP kunne fremkalde et immunrespons. Da denne protokol genererer protein fra DNA, er det vigtigt at undgå at forurene reaktionen med DNase, RNase, såvel som det fremmede DNA og RNA. Alle materialer eller reagenser, der anvendes i reaktionerne, skal være fri for denne type molekyler.Efter ekspression, oprensning og tilsætning af adjuvanser kan disse vaccinekandidater evalueres i passende dyremodeller for patogener af interesse for at vurdere immunaktiveringsmarkører eller evaluere beskyttelse under en udfordring. For klamydia er det vigtigste ydre membranprotein, eller MOMP, blevet betragtet som et førende kandidatantigen til underenhedsvacciner i mange år, men det har været vanskeligt at producere i skalaer, der er nødvendige for vaccineanvendelse. Cellefri co-ekspression af dette membranprotein er en levedygtig måde at begynde at flytte dette protein mod evaluering i dyremodeller som mus og til sidst gå ind i human testning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion og Titering af rekombinant adeno-associeret virale vektorer

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Optælling af Major perifert blod leukocytpopulationer for multicenter kliniske undersøgelser med en Whole Blood fænotypebestemmelse Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetiske tilgange i<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Fremstilling af rekombinant arenavirus for Vaccine Development i FDA-godkendte Vero celler

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Brug Klik Chemistry at måle effekten af ​​Viral infektion på Host-celle RNA-syntese

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In vitro analyse af MyD88-medieret Cellular immunrespons til West Nile Virus mutantstamme Infektion

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila ydermembranvesikler: Isolering og analyse af deres pro-inflammatorisk potentiale på makrofager

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman Feeder-fri ordning for masseproduktion af Murine naturlige dræberceller In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques