Name: cell-free scaled production and adjuvant addition to a recombinant major outer membrane protein from chlamydia muridarum for vaccine development
Uploaded: 2022-03-16T12:30:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Public Health Service grant R21 AI20925 en U19 AI144184 van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Dit werk werd uitgevoerd onder auspiciën van het Amerikaanse ministerie van Energie door Lawrence Livermore National Laboratory onder contract DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525, LLNL-VIDEO-832788].

Alle dierstudies werden uitgevoerd aan de Universiteit van Californië, Irvine, in public health service (PHS) -verzekerde faciliteiten in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Glaswerk voorbereiding
OPMERKING: Alle materialen die worden gebruikt bij het produceren van vaccinformuleringen voor dieren zijn endotoxinevrij.
<ol><li>Om vervuilende endotoxine te vernietigen, bakt u gereinigd glaswerk dat buffers in een oven op 180 °C gedurende 4 uur vasthoudt.</li>
</ol>2. Buffervoorbereiding
<ol><li>Bereid 250 ml van de Ni-affiniteitszuiveringsbuffers in tabel 1. Bewaar ze bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden.</li>
</ol>3. Reactie voorbereiding
<ol><li>Weeg 20 mg 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DMPC) af in een endotoxinevrije centrifugebuis van 1,5 ml. Los het op in 1 ml endotoxinevrij water, sonde-soniceer minstens vier keer bij 6 A gedurende 1 minuut, met pauzes van 1 minuut ertussen, totdat het helder is. Verwijder alle verontreinigingsmetalen uit de sonde door centrifugeren bij 13.000 × g gedurende 2 minuten bij 22 °C en breng het opgeloste lipide vervolgens over in een nieuwe endotoxinevrije buis van 1,5 ml.</li>
	<li>Weeg 1 mg PEG5k-CA8 telodendrimer af in een endotoxinevrije buis van 1,5 ml. Los op in endotoxinevrij water tot een concentratie van 20 mg / ml. Vortex totdat het volledig is opgelost en verdund tot 2 mg / ml.</li>
	<li>Combineer in een nieuwe endotoxinevrije buis 210 μL 20 mg/ml DMPC-oplossing met 210 μL 2 mg/ml telodendrimer-oplossing.</li>
</ol>4. Celvrije productie van MOMP-tNLP's voor subunitvaccinformuleringen
<ol><li>Bereid MOMP-tNLP's voor met behulp van celvrije methoden die zijn aangepast op basis van een eerder gepubliceerd protocol5.<ol><li>Twee uur voor het opzetten van de celvrije reactie, opent u de prokaryote celvrije eiwitexpressiekit en ontdooit u een van de reconstitutiebuffers. Voeg eenmaal ontdooid een tablet EDTA-vrije proteaseremmercocktail toe en laat deze volledig oplossen.</li>
	</ol></li>
	<li>Volg dit protocol met behulp van een kit die is ontworpen om 5 x 1 ml reacties uit te voeren. OPMERKING: Een typische opschalingsproductie is 3 x 1 ml.<ol><li>Voeg voor elke reactie van 1 ml 525 μL reconstitutiebuffer toe aan de E. coli-lysaatfles en rol voorzichtig om op te lossen . Voeg 250 μL reconstitutiebuffer toe aan de fles met reactieadditieven (bijv. ATP, GTP) en rol voorzichtig om op te lossen.</li>
		<li>Voeg 8,1 ml reconstitutiebuffer toe aan de reactietoevoerfles, sluit af met een rubberen stop (zorg ervoor dat u de binnenkant van de rubberen stop niet raakt) en keer / rol voorzichtig om op te lossen.</li>
		<li>Voeg 3 ml reconstitutiebuffer toe aan de fles met het aminozuurmengsel, sluit af met een rubberen stop en keer / rol voorzichtig om om op te lossen. OPMERKING: Zorg ervoor dat u de binnenkant van de rubberen stop niet aanraakt, omdat dit tot verontreiniging kan leiden.</li>
		<li>Voeg 1,8 ml reconstitutiebuffer toe aan de methioninefles, rol voorzichtig om op te lossen en bewaar vervolgens op ijs tot gebruik.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid de reactieoplossing voor.<ol><li>Voeg aan de E. coli-lysaatfles 225 μl gereconstitueerde reactiemix, 270 μl gereconstitueerd aminozuurmengsel zonder methionine en 30 μl gereconstitueerde methionine toe . Voeg daarnaast 400 μL van het DMPC/telodendrimer-mengsel, 15 μg MOMP-plasmide en 0,6 μg Δ49ApoA1-plasmide toe. Rol/schud zachtjes om te mengen. OPMERKING: Zorg ervoor dat beide plasmiden zijn opgebouwd uit dezelfde plasmide-ruggengraat. Niet vortexen.</li>
		<li>Neem 20 μL van de totale oplossing en zet deze opzij in een buis van 1,5 ml voor de GFP-expresserende controlereactie (zie hieronder).</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid de voedingsoplossing voor. Voeg aan de fles van de voedermix 2,65 ml gereconstitueerd aminozuurmengsel zonder methionine en 300 μl gereconstitueerde methionine toe. Rol/schud zachtjes om op te lossen. OPMERKING: Op dit moment kunnen de ongebruikte reconstitutiebuffer en methionine worden teruggebracht naar de vriezer voor opslag.</li>
	<li>Breng 1 ml van de reactieoplossing over naar de binnenste reactiekamer in de celvrije reactiekit en sluit deze af wanneer deze is gevuld. Breng 10 ml van de voedingsoplossing over naar de buitenste kamer van het reactievat en de afdichting. LET OP: Vul de kamers niet te vol! De aanwezigheid van luchtbellen aan de bovenkant van zowel de binnenste reactiekamer als de binnenste toevoerkamer zal de reactie nadelig beïnvloeden. Elke resterende reactieoplossing kan in een buis van 1,5 ml worden geplaatst en naast het hoofdvat worden gemengd.</li>
	<li>Voeg 0,5 μL van het GFP-controleplasmide (0,5 mg/ml) toe aan het eerder geciteerde reactiemengsel van 20 μL. OPMERKING: Veel kits worden geleverd met een controleplasmide voor kwaliteitscontroledoeleinden. De meeste GFP-expressieplasmide met een T7-promotor en E.coli-ribosoombindingsplaats (RBS) kunnen ook worden gebruikt als controleplasmide.</li>
	<li>Plaats de reactie in een schudder bij 300 tpm, 30 °C gedurende maximaal 18 uur. Om te controleren of de reactie succesvol was, gebruikt u een UV-lichtbron om te controleren op fluorescentie als gevolg van de synthese van de controle-GFP (figuur 1A) na slechts 15 minuten incubatie. OPMERKING: Deze omstandigheden, met name temperatuur, moeten mogelijk worden geoptimaliseerd voor expressie van andere membraaneiwitten.</li>
</ol>5. MOMP-tNLP zuivering
<ol><li>Gebruik geïmmobiliseerde nikkelaffiniteitschromatografie om het MOMP-tNLP nanodeeltjescomplex uit het celvrije reactiemengsel te zuiveren met behulp van de His-tag op het Δ49ApoA1-eiwit.<ol><li>Breng 1 ml van een 50% slurry van His-Tag Purification Resin over naar een wegwerpchromatografiekolom van 10 ml en breng deze in evenwicht met 3 ml bindingsbuffer.</li>
		<li>Laat de buffer leeglopen, sluit de uitlaat af en voeg 250 μL bindingsbuffer toe aan de hars.</li>
		<li>Voordat u de celvrije reactie aan de kolom toevoegt, slaat u 20 μL op voor latere analyse door SDS-PAGE. Meng de celvrije reactie met de gebalanceerde hars en incubeer deze op een laboratoriumwip bij 4 °C gedurende 1 uur.</li>
	</ol></li>
	<li>Maak de kolom los, was de dop met 500 μL extra bindingsbuffer en voeg deze vloeistof toe aan de rest van de kolom.</li>
	<li>Verzamel de vloeistofdoorstroming uit de kolom voor latere analyse door SDS-PAGE.</li>
	<li>Was de kolom zes keer met 1 ml wasbuffer met 20 mM imidazool en verzamel fracties. Zorg ervoor dat u de hars niet laat uitdrogen tussen de wasbeurten door. Roer bij de tweede wasbeurt de hars krachtig door op en neer te pipetteren met een pipet van 1 ml.</li>
	<li>Elueer de MOMP-tNLPs in zes 300 μL fracties van Elution buffer 1 (met 250 mM imidazool), gevolgd door een laatste elutie met 300 μL Elution buffer 2 (met 500 mM imidazool). Bij de tweede elutie roert u de hars krachtig door op en neer te pipetteren met behulp van een pipet van 1 ml.</li>
</ol>6. Analyse door SDS-PAGE
OPMERKING: Alle elutiefracties moeten worden geanalyseerd door SDS-PAGE om te screenen op hoeveelheid en zuiverheid van het eiwit van belang.
<ol><li>Belast 1 μL elk van het totale lysaat en de doorstroom en vervolgens 5 μL voor alle verzamelde wasbeurten en elutiefracties.<ol><li>Meng aliquots van de geëlueerde MOMP-tNLPs, wasbeurten, doorstroming en totaal lysaat met 4x SDS-PAGE sample loading buffer. Meng en denatureer de monsters met 10x monsterreductiemiddel, tenzij anders aangegeven.</li>
		<li>Analyseer de fracties door gelelektroforese met behulp van 1,0 mm, 4 tot 12%, Bis-Tris SDS-PAGE-gels met 1x MES-SDS-loopbuffer, samen met een geschikte molecuulgewichtsstandaard. Laat de gels 35 minuten draaien op 200 V.</li>
	</ol></li>
	<li>Bevlek de gels volgens de instructies van de fabrikant.<ol><li>Verwijder de gel uit de cassette en plaats deze in 60 ml gelvlek. Magnetron de gel in de gelvlek gedurende 30 s en schommel de container voorzichtig gedurende 30 s om de warmte gelijkmatig te verdelen. Magnetron de gel in de vlek tot 80-85 °C gedurende nog eens 30 s en plaats de gel op een orbitale shaker om gedurende 5 minuten te schommelen.</li>
		<li>Magnetron de gel een derde keer gedurende 30 s en keer dan terug naar de orbitale shaker om nog eens 23 minuten te schommelen.</li>
		<li>Breng de gel over in een schone container en was gedurende 30 minuten in 100 ml wasoplossing (10% methanol, 7% azijnzuur). OPMERKING: Dit is een cruciale stap omdat het essentieel is om te voorkomen dat de wasoplossing wordt verwarmd. Als u dit niet doet, kan dit leiden tot achtergrondkleuring en onregelmatigheden in het uiteindelijke gelbeeld.</li>
		<li>Spoel de gel na het wassen twee keer af in ultrapuur water gedurende elk 5 minuten.</li>
		<li>Beeld de gels af met een gel-imager op 600 nm (figuur 2). Gebruik SDS-PAGE om de hoeveelheid individueel eiwit in de nanodeeltjesoplossing te kwantificeren als er een eiwitstandaard is voor vergelijking. OPMERKING: In dit voorbeeld worden seriële verdunningen van recombinant tot expressie gebrachte MOMP opgelost door SDS-PAGE en worden de dichtheden van de banden gekwantificeerd met behulp van instrumentsoftware.</li>
		<li>Genereer een standaardcurve met behulp van de dichtheden van de MOMP-banden. Los de MOMP-tNLP-monsters op dezelfde SDS-PAGE-gel op en bereken de MOMP-component van de deeltjes met behulp van de MOMP-standaardcurve (figuur 3).</li>
	</ol></li>
</ol>7. Western en dot blots en opslag
<ol><li>Voor western blotting, los de monsters op met SDS-PAGE en breng de gels over met behulp van een commercieel droog blottingsysteem met standaardinstellingen volgens het protocol van de fabrikant.<ol><li>Verwijder de vlekken uit de stapel nadat de overdracht is voltooid en incuber elke vlek 's nachts bij 4 °C in een geschikte blokkeringsbuffer met 0,2% Tween 20 en 0,5 mg / ml MAb40 of 0,2 mg / ml MAbHIS anti-His-tag-antilichaam gericht tegen het His-tag van Δ49ApoA1-eiwit. OPMERKING: De antilichaamverdunningen die worden gebruikt voor blotting zijn 1:1.000 voor MAb40 en 1:500-1.000 voor MAbHIS-antilichaam.</li>
		<li>Was elke vlek 3 keer gedurende 5 minuten met PBS-T (1x PBS, 0,2% Tween 20, pH 7,4).</li>
		<li>Incubeer de vlekken gedurende 1 uur in een blokkerende buffer met secundair antilichaam geconjugeerd aan een fluorofoor (bijv. IRDye) bij een verdunning van 1:10.000.</li>
		<li>Was de vlekken 3 keer gedurende 5 minuten opnieuw met PBS-T. Gebruik een fluorescentiebeeldcamera om de vlekken na de laatste wasbeurt in beeld te brengen.</li>
	</ol></li>
	<li>Voor dot blots, dep 3 μg gezuiverde MOMP-tNLP en leeg tNLP met behulp van een dot blot apparaat. Blokkeer en ontwikkel de vlekken met behulp van dezelfde methoden die hierboven zijn beschreven voor western blotting.</li>
</ol>8. Beoordeling van endotoxine
<ol><li>Kwantificeer endotoxineniveaus met behulp van een endotoxinetestsysteem op basis van de Limulus Amebocyte Lysate (LAL) -test. Bereid endotoxinevrije 25 mM Tris, pH 7,4, monsterbuffer met behulp van 1 M Tris-hydrochlorideoplossing en endotoxinevrij water. OPMERKING: Doorgaans moeten monsters worden verdund met behulp van deze monsterbuffer en moeten de verdunningen worden aangepast om het geschikte bereik voor afzonderlijke monsters te vinden. Hier worden MOMP-tNLP-monsters 500-voudig verdund in de monsterbuffer en wordt 25 μL in elke put van een apparaatpatroon geladen met een gevoeligheid van 0,05 EU/ml. De endotoxinespiegels van MOMP-tNLP en lege tNLP die in de hieronder beschreven muisstudies worden gebruikt, liggen tussen 0,4 en 12 EU/μg-eiwit, afhankelijk van het monster.</li>
</ol>9. Lyofilisatie
<ol><li>Lyofileer en bewaar de MOMP-tNLP nanodeeltjes voor langdurig (tot jaren) gebruik bij -20 °C. Om tNLP- en MOMP-tNLP-suspensies voor lyofilisatie voor te bereiden, voegt u trehalose toe als beschermmiddel tijdens het vries- en lyofilisatieproces. OPMERKING: Dit proces is uitgebreid gevalideerd voor een verscheidenheid aan tNLP-formuleringen 7,8.</li>
	<li>Deel het huidige volume van de MOMP-tNLP-oplossing door 9 om het volume van 1 M trehalose te verkrijgen in steriel, endotoxinevrij, gedeïoniseerd water dat nodig is om een eindconcentratie van 0,1 M trehalose te bereiken. Noteer het uiteindelijke volume en aliquot in endotoxinevrije polypropyleenbuizen van 15 ml of 50 ml naar wens.</li>
	<li>Vries de gemengde oplossing in op droogijs en lyofileer het een nacht met behulp van een lyofilisator. Bewaar de gedroogde formuleringen bij -20 °C totdat ze nodig zijn.</li>
	<li>Reconstitueer gelyofiliseerde tNLP's met behulp van endotoxinevrij water. Rol zachtjes totdat de gelyofiliseerde cake volledig is opgelost en gerehydrateerd. Om trehalose te verwijderen, dialyseert u de oplossing tegen PBS met behulp van een 3,5 kDa cutoff dialysemembraan.</li>
</ol>10. Adjuvante toevoeging
OPMERKING: Deze en andere soortgelijke op NLP gebaseerde sub-unit vaccinformuleringen kunnen gemakkelijk lipofiele adjuvantia zoals CpG-ODN1826 en FSL-1 bevatten. CpG-ODN1826 is een gemodificeerd klasse B CpG-oligonucleotide (5'-tccatgacgttcctgacgtt-3') met een volledige fosforothioaatruggegraat met een 5' cholesterolgroep (5'-chol-C6). De conjugatie van CpG-ODN1826 aan tNLP's wordt gemedieerd door de hydrofobe interacties tussen de cholesterolgroep en de fosfolipide bilaag van de tNLP en is aangetoond en goed gekarakteriseerd, zoals eerder gemeld 9,10.
<ol><li>Voordat het in deze formuleringen wordt opgenomen, zuivert u het cholesterolgemodificeerde CpG door middel van reversed-phase chromatografie om verontreinigende endotoxine en eventuele niet-gemodificeerde CpG-moleculen te verwijderen.<ol><li>Na ontvangst van de leverancier, rehydrateer het gelyofiliseerde CpG-materiaal in endotoxinevrij water en zuiver het op een preparatieve C4 RP-HPLC-kolom met behulp van een scheidingsgradiënt bestaande uit 10 mM triethylammoniumacetaat (TEAA) (mobiele fase A) en acetonitril (mobiele fase B). OPMERKING: Aanvullende details zijn beschikbaar in tabel 2.</li>
		<li>Pool en lyofiliseer de fracties die cholesterol-gemodificeerd CpG bevatten. Om volledige verwijdering van resterende TEAA te garanderen, reconstitueert u de CpG met 15 ml endotoxinevrij water en lyofiliseert u deze drie keer.</li>
		<li>Na de uiteindelijke lyofilisatie, reconstitueer CpG in endotoxinevrij water (>20 mg / ml uiteindelijke CpG-concentratie), aliquot, en bewaar het bij -80 °C totdat het nodig is. Verdun voor toevoeging aan formuleringen de CpG tot een concentratie van 1-2,5 mg / ml. OPMERKING: FSL-1 is beschikbaar als een vaccin-kwaliteit, gelyofiliseerd poeder. Dit wordt gereconstitueerd met steriel en endotoxinevrij water in een concentratie van 1 mg / ml. Het vaccin wordt intramusculair (i.m.) toegediend, waarbij elke dosis 10 μg MOMP bevat in een totaal volume van 50 μl.</li>
	</ol></li>
	<li>Om de gewenste formuleringsdosis te bereiken, dialyseert u de nanodeeltjes in PBS en concentreert u ze met behulp van een centrifugale vacuümconcentrator voordat u adjuvante toevoegt. Wees hierbij voorzichtig om te voorkomen dat het monster volledig droogt - controleer het monstervolume elke 20-30 minuten tijdens het centrifugeren.</li>
	<li>Voeg het adjuvans onder steriele omstandigheden toe in een bioveiligheidskast. Om een succesvolle integratie te beoordelen, analyseert u de uiteindelijke formuleringen en hun componenten door analytische grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). OPMERKING: Voor deze preparaten werd een SEC-kolom gebruikt in PBS-buffer (0,5 ml / m in stroomsnelheid) en elutie werd gedetecteerd met behulp van een UV-vis diode array-detector. De opname werd beoordeeld door de absorptie van de geadjuveerde deeltjes te vergelijken met die van de niet-geadjuveerde deeltjes bij 214 en 280 nm.</li>
	<li>Bewaar de adjuvante MOMP-tNLP en lege tNLP bij 4 °C vóór gebruik door dieren gedurende een periode van maximaal 14 dagen. Om de stabiliteit van een nieuwe tNLP-formulering volledig te beoordelen, analyseert u periodiek de opgeslagen tNLP's door SEC. OPMERKING: De stabiliteit varieert van formulering tot formulering.</li>
</ol>11. Serum testen
<ol><li>Verkrijg vrouwelijke muizen van 3 weken oud (BALB/c, n = 6).</li>
	<li>Vaccineer de muizen intramusculair (i.m.) in elke achterpoot met 10 μg MOMP in de vorm van MOMP-tNLP geadjuveerd met 5 μg CpG en 1 μg FSL-1 (totaal volume per injectie = 50 ml).</li>
	<li>Observeer na vaccinatie de muizen totdat ze in staat zijn om sternale ligkracht te behouden.</li>
	<li>Vier weken na de eerste vaccinatie (prime), vaccineer de dieren een tweede keer (boost) met 10 μg MOMP in de vorm van MOMP-tNLP geadjuvaniseerd met 5 μg CpG en 1 μg FSL-1 (totaal volume per injectie = 50 ml).</li>
	<li>Op dag 56 na de eerste vaccinatie bloed verzamelen om antilichaamtiters te beoordelen. Begin met het verdoven van de muizen door i.p. een oplossing van xylazine (0,3 mg/20 g lichaamsgewicht) en ketamine (3,0 mg/20 g lichaamsgewicht) te injecteren. Knijp in de voor- en achterpoten om ervoor te zorgen dat er geen schokken optreden. Breng vaseline aan rond de ogen om droge ogen tijdens de anesthesie te voorkomen.</li>
	<li>Gebruik een micro-hematocriet capillaire buis om de retro-orbitale plexus te doorboren. Verzamel 100 ml bloed in een microcentrifugebuis.</li>
	<li>Observeer na bloedafname de muizen totdat ze herstellen van anesthesie en sternale lighouding kunnen behouden.</li>
	<li>Laat het bloed gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur stollen en laat vervolgens gedurende 10 minuten bij 2.000 × g draaien. Verzamel het serum en vries in bij -80 °C.</li>
	<li>Daag op dit moment de dieren uit met Chlamydia muridarum of euthanaseer ze. Euthanaseer de muizen door eerst i.p. een oplossing van xylazine (0,3 mg/20 g lichaamsgewicht) en ketamine (3,0 mg/20 g lichaamsgewicht) te injecteren, gevolgd door cervicale dislocatie.</li>
	<li>Test serumantistoffen die specifiek zijn voor MOMP met behulp van western blotting-technieken zoals hierboven beschreven. Pool muizensera van alle geïmmuniseerde muizen en gebruik het gepoolde serum in plaats van een primair antilichaam bij een verdunning van 1:5.000.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li><li>Coleman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+association+of+the+Yersinia+pestis+translocon+proteins,+YopB+and+YopD,+are+facilitated+by+nanolipoprotein+particles.">Expression and association of the Yersinia pestis translocon proteins, YopB and YopD, are facilitated by nanolipoprotein particles.</a> PLoS One. 11 (3), 0150166 (2016).</li><li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein,+forming+soluble+nanolipoprotein+particles.">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+diameter,+monodispersity,+and+solubility+of+ApoA1+nanolipoprotein+particles+using+telodendrimer+chemistry.">Controlling the diameter, monodispersity, and solubility of ApoA1 nanolipoprotein particles using telodendrimer chemistry.</a> Protein Science. 22 (8), 1078-1086 (2013).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+production+of+a+functional+oligomeric+form+of+a+Chlamydia+major+outer-membrane+protein+(MOMP)+for+vaccine+development.">Cell-free production of a functional oligomeric form of a Chlamydia major outer-membrane protein (MOMP) for vaccine development.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 15121-15132 (2017).</li><li>Tifrea, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protection+in+mice+against+a+Chlamydia+muridarum+respiratory+challenge+by+a+vaccine+formulated+with+the+major+outer+membrane+protein+in+nanolipoprotein+particles.">Induction of protection in mice against a Chlamydia muridarum respiratory challenge by a vaccine formulated with the major outer membrane protein in nanolipoprotein particles.</a> Vaccines. 9 (7), 755 (2021).</li><li>Cleveland, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+X-ray+and+neutron+scattering+demonstrates+that+cell-free+expression+produces+properly+formed+disc-shaped+nanolipoprotein+particles.">Small-angle X-ray and neutron scattering demonstrates that cell-free expression produces properly formed disc-shaped nanolipoprotein particles.</a> Protein Science. 27 (3), 780-789 (2018).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+to+nickel-chelating+nanolipoprotein+particles+increases+the+potency+and+efficacy+of+subunit+vaccines+to+prevent+West+Nile+encephalitis.">Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (6), 1018-1022 (2010).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalized+delivery+of+adjuvant+and+antigen+using+nanolipoprotein+particles+enhances+the+immune+response+to+recombinant+antigens.">Colocalized delivery of adjuvant and antigen using nanolipoprotein particles enhances the immune response to recombinant antigens.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (6), 2044-2047 (2013).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanolipoprotein+particles+(NLPs)+as+an+in+vivo+delivery+platform.">Evaluation of nanolipoprotein particles (NLPs) as an in vivo delivery platform.</a> PLoS One. 9 (3), 93342 (2014).</li><li>Pal, S., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+the+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein+can+elicit+an+immune+response+as+protective+as+that+resulting+from+inoculation+with+live+bacteria.">Vaccination with the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein can elicit an immune response as protective as that resulting from inoculation with live bacteria.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8153-8160 (2005).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+major+outer+membrane+protein+of+Chlamydia+trachomatis.">Structural and functional analyses of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 189 (17), 6222-6235 (2007).</li><li>Hafner, L. M., Wilson, D. P., Timms, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+status+and+future+prospects+for+a+vaccine+against+Chlamydia+trachomatis+infection.">Development status and future prospects for a vaccine against Chlamydia trachomatis infection.</a> Vaccine. 32 (14), 1563-1571 (2014).</li><li>Findlay, H. E., McClafferty, H., Ashley, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression,+single-channel+analysis+and+membrane+topology+of+recombinant+Chlamydia+trachomatis+Major+Outer+Membrane+Protein.">Surface expression, single-channel analysis and membrane topology of recombinant Chlamydia trachomatis Major Outer Membrane Protein.</a> BMC Microbiology. 5, 5 (2005).</li><li>Sun, G., Pal, S., Weiland, J., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+an+intranasal+challenge+by+vaccines+formulated+with+native+and+recombinant+preparations+of+the+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein.">Protection against an intranasal challenge by vaccines formulated with native and recombinant preparations of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein.</a> Vaccine. 27 (36), 5020-5025 (2009).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+of+functional+receptor+tyrosine+kinases.">Cell-free expression of functional receptor tyrosine kinases.</a> Scientific Reports. 5 (1), 12896 (2015).</li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die van invloed lijken te zijn geweest op het werk dat in dit artikel wordt gerapporteerd.

Chlamydia is de meest voorkomende seksueel overdraagbare aandoening die zowel mannen als vrouwen treft. Hoewel vaccinonderzoek naar Chlamydia tientallen jaren beslaat, is een veilig en effectief vaccin dat kan worden opgeschaald naar massaproductie ongrijpbaar gebleven13. De chlamydia MOMP wordt beschouwd als de belangrijkste kandidaat als een beschermend vaccinantigeen; MOMP is echter zeer hydrofoob en gevoelig voor onjuiste vouwing14,15. Verdere studie heeft aangetoond dat MOMP bestaat in oligomere toestanden die essentieel zijn voor de immunogeniciteit11. Hier wordt een gevalideerde, celvrije co-expressiemethode beschreven die oligomere MOMP produceert die wordt gevormd in tNLP-nanodeeltje als een vaccin, met opbrengsten van ongeveer 1,5 mg gezuiverde MOMP per 3 ml lysaat. Deze volledig gecollifieerde procedure kan verder worden opgeschaald voor industriële productie, waardoor de vooruitzichten als een nuttige benadering voor het genereren van vaccins worden vergroot.
We hebben eerder gepubliceerd over het gebruik van celvrije expressie om membraaneiwitten te produceren die zijn ingebed in NLPs 3,16, evenals expressie in telodendrimer-gestabiliseerde schijven. Deze laatste techniek produceerde echter membraaneiwitdeeltjes met een grotere heterogeniteit en lagere oplosbaarheid. 4 Bovendien is de immunogeniciteit van MOMP-telodendrimer-deeltjes onduidelijk in vergelijking met MOMP-tNLP-deeltjes6.
Deze procedure kan worden aangepast om de expressie van bacteriële membraaneiwitten op te schalen die veelbelovende kandidaten zijn als antigenen voor gebruik in subunitvaccins. Niet alleen produceert deze procedure opgelost bacterieel membraaneiwit, maar de algehele nanodeeltjesstructuur is vatbaar voor verdere modificatie met behulp van een verscheidenheid aan lipofiele vaccinadjuvantia, waaronder, maar niet beperkt tot, CpG geconjugeerd aan een cholesterolgroep of FSL-1. Expressie van andere kandidaat-antigenen uit bacteriën is haalbaar, hoewel parameters zoals expressietemperatuur, lipidenkeuze en type expressiesysteem mogelijk moeten worden onderzocht om optimale opbrengsten te bereiken.
Bovendien zijn plasmidekeuze en -verhouding van cruciaal belang in dit proces. Beide gebruikte plasmiden moeten uit dezelfde ruggengraat worden opgebouwd. Als de inserts ongeveer even lang zijn, kunnen de verhoudingen worden gebaseerd op de massa van het toegevoegde plasmide, zoals hier beschreven. Verhoudingen op basis van moedervlekken zullen echter meer reproduceerbare resultaten opleveren, vooral bij het schalen van de reacties. Verhoudingen die goed werken in reacties op schermschaal (< 0,5 ml) zijn mogelijk niet van toepassing op grotere reacties en vereisen mogelijk extra optimalisatie. Niet-membraaneiwitten kunnen nog steeds tot expressie worden gebracht met behulp van celvrije kits, maar vereisen mogelijk niet dat het lipide nanodeeltje (co-expressie) een oplosbaar product produceert. Bovendien, terwijl dit protocol adjuvanting met CpG en FSL-1 beschrijft, is dit systeem vatbaar voor formulering met andere lipofiele adjuvantia of vermenging met oplosbare adjuvantia naar wens.
Het is essentieel om besmetting te voorkomen bij het opzetten van de celvrije expressiereactie, omdat dit de opbrengst kan beïnvloeden. Alle additieven voor de reactie, inclusief de plasmiden zelf, moeten zeer zuiver zijn. Bovendien mogen de tot expressie gebrachte eiwitten alleen in contact komen met materialen en oplossingen die vrij zijn van endotoxinebesmetting. Endotoxinebesmetting in kandidaatformuleringen kan leiden tot inconsistente en valse resultaten van immunologische testen en kan in voldoende hoeveelheden schadelijk zijn. Hoewel hier niet beschreven, kan aanvullende zuivering na nikkelaffiniteitschromatografie nodig zijn als veel verontreinigingen worden waargenomen in volgende analysestappen, zoals via SDS-PAGE. Dit kan worden bereikt met SEC, hoewel de omstandigheden mogelijk optimalisatie per formulering vereisen.

Prokaryote of eukaryote lysaten voor celvrije expressie van eiwitten zijn gemakkelijk verkrijgbaar als commerciële producten voor het synthetiseren van eiwitten van belang (voor een volledig overzicht, zie 1). Deze expressiesystemen zijn beschikbaar op verschillende schalen en maken gebruik van lysaten van verschillende organismen, waaronder E. coli, tabaksplanten en zoogdierculturen. Celvrije lysaten bieden meerdere voordelen ten opzichte van traditionele recombinante eiwitproductiebenaderingen, waaronder gebruiksgemak en robuuste, snelle eiwitproductie. Hoewel deze benaderingen voornamelijk worden gebruikt om oplosbare eiwitten te produceren, heeft deze groep een baanbrekende aanpak ontwikkeld voor het gebruik ervan om membraaneiwitten tot expressie te brengen.
Deze nieuwe benadering brengt kleine wijzigingen aan in bestaande celvrije expressiesystemen door DNA op te nemen dat codeert voor twee eiwitproducten voor expressie, een apolipoproteïne en het membraaneiwit van belang. Het tot expressie gebrachte apolipoproteïne (derivaten van ApoA1 of ApoE4) interageert met lipiden die aan het celvrije lysaat worden toegevoegd om spontaan (~ 20 nm) NLP's samen te stellen. Wanneer het membraaneiwit wordt gecombineerd met een membraaneiwit van belang, vormen het NLP- en membraaneiwit een oplosbaar nanodeeltjescomplex waarin het membraaneiwit is ingebed in de NLP-lipidebilaag. Het membraaneiwit is dus toegankelijker voor downstream-toepassingen, omdat het zich in oplosbare, discrete deeltjes bevindt. Deze aanpak kan functionele oligomere eiwitcomplexen produceren binnen de NLP bilayer2 en kan de antigeencomponent van een subunitvaccin produceren, die vervolgens wordt gemengd met lipofiele adjuvantia om een nanodeeltjesvaccin te vormen met co-gelokaliseerd antigeen en adjuvans dat geschikt is voor in vivo beoordeling.
Deze huidige methode is aangepast van een eerder gepubliceerd protocol3. Belangrijke modificaties zijn gericht op de opschaling van de celvrije reactie en de daaropvolgende zuivering van het eiwit-NLP-complex. Een verdere wijziging omvat de toevoeging van een amfifiel polymeer dat bekend staat als een telodendrimeer, dat eerst wordt gemengd met de lipiden voordat het wordt toegevoegd aan de celvrije reactie. Co-translatie van de plasmiden in aanwezigheid van de telodendrimer en de lipiden levert een telodendrimer NLP (tNLP) op. De toevoeging van de telodendrimer helpt ook bij het moduleren van de grootte en monodispersiteit van de resulterende tNLP nanodeeltjes4. Dit protocol is specifiek geoptimaliseerd voor grootschalige vaccinstudies om een membraangebonden subeenheidsantigeeneiwit te produceren, chlamydiaal MOMP 5,6. De methode produceert recombinant MOMP geassocieerd met tNLP om een zeer oplosbaar MOMP-tNLP-complex te vormen dat MOMP-oligomerisatie behoudt. Een typische opschalingsproductie van 3 ml levert >1,5 mg gezuiverde MOMP op. De celvrij geproduceerde MOMP-tNLP is vatbaar voor snelle adjuvante toevoeging voor in vivo immunogeniciteitstests.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2600028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Trizma hydrochloride solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial, ACS reagent, &#8805;99.7%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer Dam for XCell SureLock</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C24 Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit</td>
			<td>BiotechRabbit</td>
			<td>BR1400201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete His-Tag Purification Resin</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td>5893682001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG-ODN1826</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71508-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe PTS cartridge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9594798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe-PTS Testing System</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl and NaOH solutions for pH adjustment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC with UV-vis diode array detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure culture-grade water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Dry Blotting System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>IB24001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio V2.0 software</td>
			<td>Li-COR Biiosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Fc imager</td>
			<td>Li-COR Biiosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (&#8805;99.9%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP000202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIVEX2.4d vector</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 1000 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 20 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 200 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipettes</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic NaH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200, 5/150 GL column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>GE28-9909-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>&#160;tlrl-fsl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby Protein Gel Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Bench Top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 15 mL conicals (89039-666)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 50 mL conicals (89039-656)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies )</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free scaled production and adjuvant addition to a recombinant major outer membrane protein from chlamydia muridarum for vaccine development

Subunitvaccins bieden voordelen ten opzichte van meer traditionele geïnactiveerde of verzwakte van hele cellen afgeleide vaccins op het gebied van veiligheid, stabiliteit en standaardproductie. Om een effectief op eiwitten gebaseerd subunitvaccin te bereiken, moet het eiwitantigeen vaak een inheems-achtige conformatie aannemen. Dit is vooral belangrijk voor pathogeen-oppervlakte-antigenen die membraangebonden eiwitten zijn. Celvrije methoden zijn met succes gebruikt om correct gevouwen functioneel membraaneiwit te produceren door de co-translatie van nanolipoproteïnedeeltjes (NLP's), algemeen bekend als nanodiscs. 
Deze strategie kan worden gebruikt om subunitvaccins te produceren die bestaan uit membraaneiwitten in een lipidegebonden omgeving. De celvrije eiwitproductie is echter vaak beperkt tot kleinschaligheid (<1 ml). De hoeveelheid eiwit die in kleinschalige productieruns wordt geproduceerd, is meestal voldoende voor biochemische en biofysische studies. Het celvrije proces moet echter worden opgeschaald, geoptimaliseerd en zorgvuldig worden getest om voldoende eiwit te verkrijgen voor vaccinstudies in diermodellen. Andere processen die betrokken zijn bij de productie van vaccins, zoals zuivering, adjuvante toevoeging en lyofilisatie, moeten parallel worden geoptimaliseerd. Dit artikel rapporteert de ontwikkeling van een opgeschaald protocol om een membraangebonden eiwitsubeenheidvaccin tot expressie te brengen, te zuiveren en te formuleren. 
Geschaalde celvrije reacties vereisen optimalisatie van plasmideconcentraties en -verhoudingen bij gebruik van meerdere plasmide-expressievectoren, lipidenselectie en adjuvante toevoeging voor productie op hoog niveau van geformuleerde nanolipoproteïnedeeltjes. De methode wordt hier gedemonstreerd met de expressie van een chlamydiaal major outer membrane protein (MOMP), maar kan op grote schaal worden toegepast op andere membraaneiwitantigenen. De effectiviteit van antigeen kan in vivo worden geëvalueerd door middel van immunisatiestudies om de productie van antilichamen te meten, zoals hier wordt aangetoond.

Het SDS-PAGE-profiel van de Ni-affiniteitszuivering van MOMP-tNLP uit een celvrije reactie van 1 ml is weergegeven in figuur 1B. De reactie resulteerde in hoge expressieniveaus voor zowel het MOMP- als het Δ49ApoA1-eiwit. Eerdere resultaten toonden aan dat de celvrije expressie van Δ49ApoA1 in aanwezigheid van DMPC en telodendrimer resulteerde in de vorming van telodendrimer nanolipoproteïnedeeltjes (tNLPs)4. De co-elutie van MOMP met Δ49ApoA1 gaf aan dat MOMP geassocieerd is met tNLPs, omdat de His-tag alleen aanwezig is op de tNLP-steiger Δ49ApoA1 en niet op MOMP. MOMP is een zeer onoplosbaar eiwit dat alleen kan worden geëlueerd door complexering met tNLPs, waarvan is aangetoond dat het de oplosbaarheid van membraaneiwitten vergemakkelijkt.
De elutiefracties die MOMP-tNLP's bevatten, werden samengevoegd en de totale eiwitconcentratie werd bepaald met behulp van een op fluorescentie gebaseerd kwantificeringsapparaat, of een apparaat dat de concentratie meet door absorptie bij 280 nm, volgens de instructies van de fabrikant voor eiwitkwantificering. Om een nauwkeurige dosering van het MOMP-vaccin mogelijk te maken, is het ook belangrijk om de concentratie MOMP in de gezuiverde complexen te bepalen. We ontwikkelden een methode om MOMP te kwantificeren op basis van geldensitometrie (figuur 2) waarbij een gezuiverde recombinant MOMP met bekende concentratie als standaard werd gebruikt. Door de standaardcurve vast te stellen en te vergelijken met het MOMP-tNLP-monster, kan de MOMP-concentratie nauwkeurig worden gekwantificeerd. Aan de hand van de bepaling van de MOMP-concentratie in het gezuiverde monster kon de opbrengst van MOMP in celvrije reacties op verschillende schalen worden geschat, wat belangrijk is voor het plannen van de reactieopstelling die geschikt is voor downstreamstudies (tabel 3).
MOMP moet oligomeren vormen om een robuuste immuunrespons op te wekken11. Om de oligomere toestand van MOMP te testen, werd MOMP-tNLP geanalyseerd in de aan- en afwezigheid van zowel warmte als het reductiemiddel dithiothreitol (DTT, 50 mM, figuur 3A). Hogere orde oligomeren van MOMP werden geïdentificeerd via SDS-PAGE wanneer monsters niet werden behandeld met warmte en DTT. Ter vergelijking: monsters die met warmte werden behandeld in aanwezigheid van DTT vertoonden voornamelijk twee verschillende banden op de gel, overeenkomend met MOMP en Δ49ApoA1 (respectievelijk ongeveer 40 kDa en 22 kDa). Deze resultaten lijken sterk op het gelbandpatroon dat wordt toegeschreven aan oligomeervorming van MOMP, wat van cruciaal belang is voor de effectiviteit ervan.
Verdere western blot-analyse met MAb40, een antilichaam tegen het lineaire epitoop op het variabele domein van MOMP-eiwit, toonde een vergelijkbaar bandingpatroon, wat de oligomeervorming door MOMP-eiwit in niet-gedenatureerde toestand bevestigde (figuur 3B). Een belangrijke factor die de vorming van MOMP-oligomeren beïnvloedt, is de verhouding tussen het MOMP-plasmide en het Δ49ApoA1-plasmide tijdens de celvrije reactie-opstelling. Tabel 4 geeft een overzicht van de verhouding van plasmiden en de resulterende insertiesnelheid van MOMP in tNLPs. Eerdere studies gaven aan dat chlamydia MOMP en andere buitenmembraaneiwitten voornamelijk als trimers kunnen bestaan12. Om de trimervorming in de celvrije reactie te maximaliseren, is het wenselijk om de insertiesnelheid dicht bij drie MOMP-eiwitten per NLP te hebben, wat overeenkomt met een ~25:1 MOMP-to-Δ49ApoA1 plasmideverhouding.
Een dot blot assay werd gebruikt als een meer gestroomlijnde methode om de aanwezigheid van MOMP en tNLP te detecteren. Het MAb40-antilichaam werd gebruikt om totale MOMP te detecteren. Het MAbHIS-antilichaam gericht op de His-tag op de Δ49ApoA1-steiger van de tNLP werd gebruikt om de aanwezigheid van tNLP te beoordelen. De co-signalering van MAb40- en MAbHIS-antilichamen duidde op MOMP-tNLP-vorming. De controlereactie produceerde lege tNLP, die alleen een positief signaal van MAbHIS liet zien (figuur 3C). Om de immunogeniciteit van MOMP-tNLPs geproduceerd in de celvrije reactie te testen, hebben we MOMP-tNLP geadjuveerd met CpG + FSL-1 en intramusculair (i.m.) geïnjecteerd in muizen in een prime-boost regime zoals hierboven beschreven. Sera werden verzameld van de geïmmuniseerde muizen en MOMP-specifiek IgG-antilichaam werd gemeten met behulp van een western blot-test (figuur 4). De sera van muizen geïnjecteerd met geadjuveerde MOMP-tNLP vertoonden een sterke MOMP-binding, wat aangeeft dat MOMP-tNLP in vivo een immuunrespons kon uitlokken.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig01.jpg"> Figuur 1: Expressie en zuivering van MOMP-tNLP. (A) Afbeelding van buisjes met kleine aliquots van een celvrije reactie die met succes GFP-controles tot expressie bracht die lumineren onder UV-lichtbron (rechts) in vergelijking met lysaten zonder GFP-plasmide (links). (B) Protein Gel gekleurd met SYPRO Ruby na SDS-PAGE toont het zuiveringsprofiel van MOMP-tNLP. MOMP migreert met 40 kDa en de 49ApoA1 migreert met 22 kDa. Afkortingen: MOMP = chlamydia major outer membrane protein; tNLP = telodendrimer nanolipoproteïne deeltje; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP complex; GFP = groen fluorescerend eiwitcoderend plasmide; MW = Molecuulgewichtsmarker; T = totaal celvrij lysaat; FT = doorstroming; R1-R3 = celvrije reactie-aliquots; W1, W6 = Wast 1 en 6; E1-E7 = Elutions 1 tot en met 7; Δ49ApoA1 = His-tagged muis ApoA1 afgeleide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig02.jpg"> Figuur 2: Kwantificering van MOMP in MOMP-tNLP monsters. (A) SDS-PAGE gel gekleurd met SYPRO Ruby voor de kwantificering van MOMP. Recombinant MOMP met bekende concentratie werd op de gel geladen om de standaardcurve te verkrijgen. Elke baan bevatte 0,1 μg, 0,5 μg, 1,0 μg, 2,0 μg en 4,0 μg MOMP. MOMP-tNLP-monsters die werden gekwantificeerd, werden op dezelfde gel geladen. (B) De MOMP-concentratiestandaardcurve werd gegenereerd met behulp van densitometrie. Er werd een vergelijking gemaakt met betrekking tot de genormaliseerde banddichtheid en de hoeveelheid MOMP. De vergelijking werd gebruikt om het MOMP-gehalte in de onbekende monsters te berekenen. Afkortingen: MOMP = chlamydia major outer membrane protein; tNLP = telodendrimer nanolipoproteïne deeltje; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP complex; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig03.jpg"> Figuur 3: Celvrij geproduceerde MOMP-tNLP stelt MOMP in staat om hogere-orde structuren te vormen. (A) SDS-PAGE gel van MOMP-tNLP met en zonder behandeling van warmte en reductiemiddel DTT, gekleurd met SYPRO Ruby. Met warmte en DTT verscheen MOMP voornamelijk als een monomeerband bij ~ 40 kDa, omdat warmte en het reductiemiddel de meerderheid van de MOMP-structuur van de hogere orde afbraken. Bij afwezigheid van warmte en DTT waren de hogere-ordebanden aanwezig, wat wijst op MOMP-oligomeerconformatie. B) Western blot van MOMP-tNLP en MOMP alleen, onbehandeld en behandeld met warmte en DTT. Na overdracht werd het membraan gesondeerd met MAb40 (1:1.000 verdunning). Een bandingpatroon vergelijkbaar met de SYPRO Ruby-gekleurde gel werd waargenomen, wat bevestigt dat de hogere molecuulgewichtsbanden inderdaad MOMP-oligomeren waren. (C) Dot blot van MOMP-tNLP en lege tNLP-monsters (in tweevoud) onderzocht met MAb40 en MAbHIS. Afkortingen: MOMP = chlamydia major outer membrane protein; tNLP = telodendrimer nanolipoproteïne deeltje; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP complex; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese; DTT = dithiothreitol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig04.jpg"> Figuur 4: Celvrij geproduceerde MOMP-tNLP is zeer immunogeen. Serum van geïmmuniseerde muizen vertoonde een sterk anti-MOMP IgG-signaal. MOMP-tNLP adjuvans met CpG + FSL-1 werd gebruikt om muizen te immuniseren. Sera van zes geïmmuniseerde muizen werden verzameld, gepoold en gebruikt om MOMP-tNLP te onderzoeken. Het serum kon binden aan MOMP in een western blotting assay en vertoonde een sterk IgG-signaal (links). De western blot met MAb40 als primair antilichaam (rechts) vertoonde vergelijkbare banden, wat aangeeft dat het serum MOMP-specifiek IgG bevatte. Afkortingen: MOMP = chlamydia major outer membrane protein; tNLP = telodendrimer nanolipoproteïne deeltje; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP complex; CpG = cholesterolgemodificeerd CpG-adjuvans; FSL-1 = lipofiel adjuvans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Buffernaam</td>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>Imidazool</td>
			<td>Ph</td>
		</tr><tr><td>Bindingsbuffer</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Wasbuffer</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>20mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Elutiebuffer 1</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>250mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Elution Buffer 2</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Lijst van buffers die nodig zijn voor nikkelaffiniteitszuivering met details over de concentraties van elke component en pH.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Runtime</td>
			<td>50 min</td>
		</tr><tr><td>Debiet</td>
			<td>6,0 ml/min</td>
		</tr><tr><td>Type verloop</td>
			<td>Binair</td>
		</tr><tr><td>Buffer A</td>
			<td>10 mM TEAA in H20</td>
		</tr><tr><td>Buffer B</td>
			<td>MeCN</td>
		</tr><tr><td>Gradiënt</td>
			<td>% Buffer B</td>
		</tr><tr><td>0 min</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>30 min</td>
			<td>60%</td>
		</tr><tr><td>30,5 min</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>40 min</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>40,5 min</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>50 min</td>
			<td>25%</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Voorwaarden voor omgekeerde fase HPLC-zuivering van cholesterolgemodificeerd CpG. Afkortingen: TEAA = triethylammoniumacetaat; MeCN = acetonitril.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Celvrij lysaat (ml)</td>
			<td>DMPC lipide (mg)</td>
			<td>Telodendrimer (mg)</td>
			<td>MOMP plasmide (μg)</td>
			<td>Gezuiverde MOMP-opbrengst (mg)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>0.4</td>
			<td>15</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>8</td>
			<td>0.8</td>
			<td>30</td>
			<td>1.1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>12</td>
			<td>1.2</td>
			<td>45</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>75</td>
			<td>2.7</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 3: De hoeveelheid lipiden, telodendrimeren en plasmiden die worden gebruikt voor verschillend geschaalde celvrije reacties en de bijbehorende opbrengsten. Afkortingen: MOMP = chlamydia major outer membrane protein; DMPC = 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Verhoudingen van plasmide-input, MOMP : Δ49ApoA1</td>
			<td>1:1</td>
			<td>5:1</td>
			<td>10:1</td>
			<td>25:1</td>
			<td>50:1</td>
			<td>100:1</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Verhoudingen van de hoeveelheid geproduceerd eiwit, MOMP : Δ49ApoA1</td>
			<td>0.02</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.64</td>
			<td>3.46</td>
			<td>6.55</td>
			<td>20.04</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Geschat aantal MOMP-inserties per tNLP</td>
			<td>0.03</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.75</td>
			<td>4.04</td>
			<td>7.65</td>
			<td>23.39</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 4: De plasmideverhoudingen in een celvrije reactie en de resulterende MOMP-inbrengsnelheden. Afkortingen: MOMP = chlamydia major outer membrane protein; tNLP = telodendrimer nanolipoproteïne deeltje; Δ49ApoA1 = His-tagged muis ApoA1 afgeleide.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development at JoVE.com

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Dit protocol beschrijft het gebruik van commerciële, celvrije eiwitexpressiekits om membraaneiwitten te produceren die worden ondersteund in nanodisc die kunnen worden gebruikt als antigenen in subunitvaccins.

Celvrije geschaalde productie en adjuvante toevoeging aan een recombinant belangrijk buitenmembraaneiwit van Chlamydia muridarum voor vaccinontwikkeling

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard ...

Veel kandidaat-subunitvaccinantigenen zijn membraaneiwitten. Historisch gezien zijn deze moeilijk te produceren en te zuiveren in voldoende hoeveelheden. Met deze techniek zijn we in staat om antigenen van belang te maken die zijn ingebed in een lipidemembraan om een inheems-achtige bevestiging te garanderen.Dit proces vergemakkelijkt ook de formulering met interessante adjuvantia. Celvrije expressie maakt een snelle productie mogelijk van eiwitten die van belang zijn in hun oorspronkelijke tagloze structuur. Deze techniek is ook schaalbaar en we werken al samen met commerciële bedrijven voor het ontwikkelen van vaccinformuleringen met behulp van dit proces.We demonstreren hier het proces voor een chlamydia-antigeen, maar het proces kan gemakkelijk worden aangepast om antigenen van belang te produceren, ongeacht of het membraaneiwitten zijn of niet. Dit proces kan van toepassing zijn op zowel de ontwikkeling van pathogenen als kankervaccins. Om te beginnen, bereid MOMP-tNLP's voor door een celvrije methode te gebruiken.Ontdooi de reconstitutiebuffer uit de celvrije eiwitexpressiekit twee uur voor het instellen van de reactie en voeg EDTA-vrije proteaseremmer toe aan de buffer. Gebruik een kit die is ontworpen om vijf reacties van één milliliter uit te voeren. Voeg voor elke reactie van één milliliter 525 microliter reconstitutiebuffer toe aan de E.coli-lysaatfles en rol deze op om op te lossen.Voeg 250 microliter van de reconstitutiebuffer toe aan de reactiefles met het additief en los op door te rollen. Voeg vervolgens 8,1 milliliter reconstitutiebuffer toe aan de reactietoevoerfles en rol deze op om op te lossen. Voeg aan een fles aminozuurmengsel drie milliliter reconstitutiebuffer toe om het op te lossen.Voeg aan een andere fles methionine 1,8 milliliter reconstitutiebuffer toe, los het op en bewaar het op ijs. Voeg 225 microliter van het gereconstitueerde mengsel, 270 microliter van het gereconstitueerde aminozuurmengsel zonder methionine en 30 microliter gereconstitueerd methionine toe aan de E.coli-lysaatfles. Voeg verder 400 microliter van het DMPC / telodendrimer-mengsel, 15 microgram MOMP-plasmide en 0,6 microgram delta-49ApoA1 toe aan het mengsel en meng het.Aliquot 20 microliter van de totale oplossing in een buis van 1,5 milliliter Voor een GFP-uitdrukkende controlereactie. Bereid een voedingsoplossing door 2,65 milliliter van het gereconstitueerde aminozuurmengsel zonder methionine en 300 microliter gereconstitueerd methionine toe te voegen. Breng één milliliter van de reactieoplossing over naar de binnenste reactiekamer in de celvrije reactiekit en sluit deze af.Vul de buitenste kamer van het reactievat met 10 milliliter van de voedingsoplossing en sluit deze. Voeg 0,5 microliter van het GFP-controleplasmide toe aan de 20 microliter aliquots van het reactiemengsel. Doe de reactie in een shaker met 300 omwentelingen per minuut gedurende 18 uur bij 30 graden Celsius.Controleer de reactie onder een UV-licht na 15 minuten op fluorescentie als gevolg van GFP-synthese. Zuiver het MOMP-tNLP nanodeeltjescomplex uit het celvrije reactiemengsel door geïmmobiliseerde nikkelaffiniteitschromatografie met behulp van de HIS-tag op het delta-49ApoA1-eiwit. Breng één milliliter van de 50% slurry van de HIS-tag zuiveringshars over in een wegwerpchromatografiekolom van 10 milliliter en voeg drie milliliter bindingsbuffer toe om in evenwicht te komen.Giet daarna de buffer af en voeg 250 microliter bindbuffer toe aan de hars. Extraheer 20 microliter van het celvrije reactiemengsel voor SDS-PAGE-analyse. Voeg het resterende celvrije reactiemengsel toe aan de gebalanceerde hars en incubeer gedurende een uur op een laboratoriumwip bij vier graden Celsius.Verwijder de kolomdop en was deze met 500 microliter bindbuffer. Voeg het wasmiddel toe aan de kolom en verzamel de doorstroom voor SDS-PAGE-analyse. Was de kolom met één milliliter wasbuffer met 20 millimolaire imidazool zes keer en verzamel de fracties.Gebruik tijdens het wassen voor de tweede keer een pipet van één milliliter om de hars te roeren. Elueer de MOMP-tNLP's in zes 300-microliterfracties van elutiebuffer I met 250 millimolair imidazool en een uiteindelijke elutie met 300 microliter elutiebuffer II met 500 millimolair imidazool. Bij de tweede elutie roert u de hars krachtig door op en neer te pipetteren met behulp van een pipet van één milliliter.Gebruik een gel-imager om de beelden vast te leggen op 600 nanometer. Kwantificeer vervolgens de hoeveelheid verschillende eiwitten in de nanodeeltjes door middel van SDS-PAGE-analyse met behulp van een eiwitstandaard. Teken een standaardcurve met behulp van de dichtheden van de MOMP-banden.Bepaal vervolgens de MOMP-component van de nanodeeltjes met de standaard. Los de monsters op met SDS-PAGE en breng de gelstapels over met behulp van een commercieel droog blottingsysteem voor Western blot-analyse. Verwijder de vlekken uit de stapel en incubeer ze een nacht bij vier graden Celsius in een blokkerende buffer met 0,2% TWEEN 20 en 0,5 microgram per milliliter MAb40, of 0,2 microgram per milliliter MAbHIS antiHIS-tag antilichaam gericht tegen de HIS-tag van delta-49ApoA1 eiwit.Was elke vlek met PBST drie keer gedurende vijf minuten per wasbeurt. Incubeer de vlekken gedurende een uur in een blokkerende buffer met secundaire antilichamen geconjugeerd aan een fluorofoor in een verdunning van 1:10.000. Herhaal de wasbeurten met PBST en leg het beeld vast met behulp van een fluorescentiebeeldcamera na de laatste wasbeurt.Dep met behulp van een dot blot-apparaat drie microgram MOMP-tNLP en leeg tNLP. Ontwikkel en blokkeer de vlekken met dezelfde methode voor Western blotting. Vries de gemengde oplossing in op droogijs en lyofileer het een nacht met behulp van een lyofilisator.Bewaar de gedroogde formuleringen bij min 20 graden Celsius. Indien nodig, reconstitueer de gelyofiliseerde tNLPs met endotoxinevrij water en rol het om op te lossen en te rehydrateren. Dialyseer de oplossing met PBS en verwijder de trehalose met een dialysemembraan van 3,5 kilodalton.Centrifugeer de nanodeeltjesoplossing in een vacuümconcentrator voordat u het adjuvans toevoegt. Controleer het monstervolume na 20 tot 30 minuten om volledige droging te voorkomen. Voeg in een bioveiligheidskast het adjuvans toe onder steriele omstandigheden.Met behulp van analytische grootte-uitsluitingschromatografie analyseert u de formulering voor een succesvolle integratie. Bewaar de adjuvante MOMP-tNLP's en leeg tNLP bij vier graden Celsius gedurende maximaal 14 dagen. Analyseer de stabiliteit van de tNLP-formulering met grootte-uitsluitingschromatografie.De SDS-PAGE-analyse van MOMP-tNLP werd uitgevoerd door middel van nikkelaffiniteitschromatografie, waaruit bleek dat het celvrije reactiemengsel hoge expressieniveaus heeft voor zowel de MOMP- als de delta-49ApoA1-eiwitten. Door gebruik te maken van geldensitometrie werd de MOMP-concentratie gekwantificeerd met behulp van een gezuiverde recombinante MOMP met een bekende concentratie als standaard. Om de oligomeervorming te bepalen, werden SDS-PAGE MOMP en MOMP-tNLP behandeld met warmte en DTT, die verschillende banden vertoonden voor MOMP en delta-49ApoA1.Western blot-analyse met behulp van een antilichaam MAb40 werd gebruikt tegen MOMP-eiwit, dat een bandingpatroon onthulde dat de oligomeervorming door MOMP-eiwit in zijn niet-gedenatureerde toestand bevestigde. Een dot blot assay werd uitgevoerd in aanwezigheid van MAb40 en MAbHIS antilichamen, die wezen op de vorming van MOMP-tNLP. Lege tNLP liet echter een positief signaal zien voor MAbHIS.Sera van de geïmmuniseerde muizen geïnjecteerd met geadjuveerde MOMP-tNLP vertoonden een sterke MOMP-binding en gaven aan dat MOMP-tNLP een immuunrespons kon uitlokken. Omdat dit protocol eiwit uit DNA genereert, is het essentieel om besmetting van de reactie met DNase, RNase, evenals het externe DNA en RNA te voorkomen. Alle materialen of reagentia die bij de reacties worden gebruikt, moeten vrij zijn van dit soort moleculen.Na expressie, zuivering en toevoeging van adjuvantia kunnen deze vaccinkandidaten worden geëvalueerd in geschikte diermodellen voor de pathogenen die van belang zijn om immuunactivatiemarkers te beoordelen of de bescherming tijdens een uitdaging te evalueren. Voor chlamydia wordt het belangrijkste buitenmembraaneiwit, of MOMP, al vele jaren beschouwd als een toonaangevend kandidaat-antigeen voor subunitvaccins, maar het is moeilijk om te produceren op schalen die nodig zijn voor vaccintoepassing. Celvrije co-expressie van dit membraaneiwit is een haalbare manier om dit eiwit te verplaatsen naar evaluatie in diermodellen zoals muizen en uiteindelijk naar menselijke tests te gaan.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Recombinante retrovirale Productie en Infectie van B-cellen

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Productie en Titering van recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Opsomming van belangrijke perifeer bloed leukocyten populaties voor Multicenter klinische proeven met behulp van een volbloed Fenotypering Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetische technieken in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generatie van recombinant arenavirus for Vaccine Development in FDA-goedgekeurde Vero cellen

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Met Click Chemie aan het effect van de virale infectie Meet op Host-cel RNA Synthese

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analyse van Myd88 gemedieerde cellulaire immuunrespons op West Nile Virus mutantstam Infectie

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer membraanvesicles: Isolatie en analyse van hun pro-inflammatoire Potential op macrofagen

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Een nieuwe Feeder-vrij systeem voor massaproductie van lymfkliertest Natural Killer cellen In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Eencellige kwantificatie van mRNA en oppervlak eiwituitdrukking in Simian Immunodeficiëntie Virus-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van Rhesus Makaken