Name: cell-free scaled production and adjuvant addition to a recombinant major outer membrane protein from chlamydia muridarum for vaccine development
Uploaded: 2022-03-16T12:30:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss des Public Health Service R21 AI20925 und U19 AI144184 des National Institute of Allergy and Infectious Diseases unterstützt. Diese Arbeit wurde unter der Schirmherrschaft des U.S. Department of Energy vom Lawrence Livermore National Laboratory unter dem Vertrag DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525, LLNL-VIDEO-832788] durchgeführt.

<ol>
	<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li><li>Coleman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+association+of+the+Yersinia+pestis+translocon+proteins,+YopB+and+YopD,+are+facilitated+by+nanolipoprotein+particles.">Expression and association of the Yersinia pestis translocon proteins, YopB and YopD, are facilitated by nanolipoprotein particles.</a> PLoS One. 11 (3), 0150166 (2016).</li><li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein,+forming+soluble+nanolipoprotein+particles.">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+diameter,+monodispersity,+and+solubility+of+ApoA1+nanolipoprotein+particles+using+telodendrimer+chemistry.">Controlling the diameter, monodispersity, and solubility of ApoA1 nanolipoprotein particles using telodendrimer chemistry.</a> Protein Science. 22 (8), 1078-1086 (2013).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+production+of+a+functional+oligomeric+form+of+a+Chlamydia+major+outer-membrane+protein+(MOMP)+for+vaccine+development.">Cell-free production of a functional oligomeric form of a Chlamydia major outer-membrane protein (MOMP) for vaccine development.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 15121-15132 (2017).</li><li>Tifrea, D. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+X-ray+and+neutron+scattering+demonstrates+that+cell-free+expression+produces+properly+formed+disc-shaped+nanolipoprotein+particles.">Small-angle X-ray and neutron scattering demonstrates that cell-free expression produces properly formed disc-shaped nanolipoprotein particles.</a> Protein Science. 27 (3), 780-789 (2018).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+to+nickel-chelating+nanolipoprotein+particles+increases+the+potency+and+efficacy+of+subunit+vaccines+to+prevent+West+Nile+encephalitis.">Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (6), 1018-1022 (2010).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalized+delivery+of+adjuvant+and+antigen+using+nanolipoprotein+particles+enhances+the+immune+response+to+recombinant+antigens.">Colocalized delivery of adjuvant and antigen using nanolipoprotein particles enhances the immune response to recombinant antigens.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (6), 2044-2047 (2013).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanolipoprotein+particles+(NLPs)+as+an+in+vivo+delivery+platform.">Evaluation of nanolipoprotein particles (NLPs) as an in vivo delivery platform.</a> PLoS One. 9 (3), 93342 (2014).</li><li>Pal, S., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+the+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein+can+elicit+an+immune+response+as+protective+as+that+resulting+from+inoculation+with+live+bacteria.">Vaccination with the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein can elicit an immune response as protective as that resulting from inoculation with live bacteria.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8153-8160 (2005).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+major+outer+membrane+protein+of+Chlamydia+trachomatis.">Structural and functional analyses of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 189 (17), 6222-6235 (2007).</li><li>Hafner, L. M., Wilson, D. P., Timms, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+status+and+future+prospects+for+a+vaccine+against+Chlamydia+trachomatis+infection.">Development status and future prospects for a vaccine against Chlamydia trachomatis infection.</a> Vaccine. 32 (14), 1563-1571 (2014).</li><li>Findlay, H. E., McClafferty, H., Ashley, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression,+single-channel+analysis+and+membrane+topology+of+recombinant+Chlamydia+trachomatis+Major+Outer+Membrane+Protein.">Surface expression, single-channel analysis and membrane topology of recombinant Chlamydia trachomatis Major Outer Membrane Protein.</a> BMC Microbiology. 5, 5 (2005).</li><li>Sun, G., Pal, S., Weiland, J., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+an+intranasal+challenge+by+vaccines+formulated+with+native+and+recombinant+preparations+of+the+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein.">Protection against an intranasal challenge by vaccines formulated with native and recombinant preparations of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein.</a> Vaccine. 27 (36), 5020-5025 (2009).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+of+functional+receptor+tyrosine+kinases.">Cell-free expression of functional receptor tyrosine kinases.</a> Scientific Reports. 5 (1), 12896 (2015).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die den Anschein erwecken könnten, dass sie die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben.

Chlamydien sind die häufigste sexuell übertragbare Infektion, die sowohl Männer als auch Frauen betrifft. Obwohl sich die Impfstoffforschung zu Chlamydien über Jahrzehnte erstreckt, ist ein sicherer und wirksamer Impfstoff, der auf die Massenproduktion skaliert werden kann, nach wie vor schwer zu finden13. Das Chlamydien-MOMP gilt als Hauptkandidat als schützendes Impfantigen; MOMP ist jedoch stark hydrophob und anfällig für falsche Faltungen14,15. Weitere Studien haben gezeigt, dass MOMP in oligomeren Zuständen existiert, die für seine Immunogenität unerlässlich sind11. Hier wird eine validierte, zellfreie Co-Expressionsmethode beschrieben, die oligomeres MOMP produziert, das in tNLP-Nanopartikeln als Impfstoff gebildet wird, mit Ausbeuten von ca. 1,5 mg gereinigtem MOMP pro 3 ml Lysat. Dieses vollständig zusammengetragene Verfahren kann für die industrielle Produktion weiter skaliert werden, was seine Aussichten als nützlicher Ansatz für die Herstellung von Impfstoffen erhöht.
Wir haben bereits über die Verwendung der zellfreien Expression zur Herstellung von Membranproteinen, die in NLPseingebettet sind, 3,16 sowie über die Expression in Telodendrimer-stabilisierten Scheiben veröffentlicht. Diese letztere Technik erzeugte jedoch Membranproteinpartikel mit größerer Heterogenität und geringerer Löslichkeit. 4 Darüber hinaus ist die Immunogenität von MOMP-Telodendrimer-Partikeln im Vergleich zu MOMP-tNLP-Partikeln unklar6.
Dieses Verfahren kann angepasst werden, um die Expression von bakteriellen Membranproteinen zu erhöhen, die vielversprechende Kandidaten als Antigene für den Einsatz in Subunit-Impfstoffen sind. Dieses Verfahren erzeugt nicht nur ein gelöstes bakterielles Membranprotein, sondern die gesamte Nanopartikelstruktur ist auch für eine weitere Modifikation mit einer Vielzahl von lipophilen Impfstoffadjuvantien zugänglich, einschließlich, aber nicht beschränkt auf CpG, das an einen Cholesterinanteil oder FSL-1 konjugiert ist. Die Expression anderer Antigenkandidaten aus Bakterien ist möglich, obwohl Parameter wie Expressionstemperatur, Lipidwahl und Art des Expressionssystems möglicherweise untersucht werden müssen, um optimale Ausbeuten zu erzielen.
Darüber hinaus sind die Wahl und das Verhältnis der Plasmide in diesem Prozess entscheidend. Beide verwendeten Plasmide sollten aus dem gleichen Rückgrat aufgebaut sein. Wenn die Inserts annähernd gleich lang sind, können die Verhältnisse auf der Masse des zugegebenen Plasmids basieren, wie hier beschrieben. Die Verhältnisierung auf der Grundlage von Molen führt jedoch zu reproduzierbareren Ergebnissen, insbesondere bei der Skalierung der Reaktionen. Verhältnisse, die bei Reaktionen im Bildschirmmaßstab gut funktionieren (< 0,5 ml), sind möglicherweise nicht auf größere Reaktionen anwendbar und erfordern möglicherweise zusätzliche Optimierungen. Nicht-Membranproteine können weiterhin mit zellfreien Kits exprimiert werden, benötigen jedoch möglicherweise nicht das Lipid-Nanopartikel (Co-Expression), um ein lösliches Produkt zu produzieren. Während dieses Protokoll die Adjuvantierung mit CpG und FSL-1 beschreibt, ist dieses System für die Formulierung mit anderen lipophilen Adjuvantien oder das Mischen mit löslichen Adjuvantien nach Wunsch zugänglich.
Es ist wichtig, bei der Einrichtung der zellfreien Expressionsreaktion eine Kontamination zu vermeiden, da dies die Ausbeute beeinträchtigen kann. Alle Zusätze zur Reaktion, einschließlich der Plasmide selbst, sollten hochrein sein. Darüber hinaus sollten die exprimierten Proteine nur mit Materialien und Lösungen in Kontakt kommen, die frei von Endotoxin-Kontamination sind. Eine Endotoxin-Kontamination in Formulierungskandidaten kann zu inkonsistenten und falschen Ergebnissen immunologischer Assays führen und in ausreichenden Mengen schädlich sein. Obwohl hier nicht beschrieben, kann eine zusätzliche Reinigung nach der Nickelaffinitätschromatographie erforderlich sein, wenn viele Verunreinigungen in nachfolgenden Analyseschritten wie z. B. DURCH SDS-PAGE beobachtet werden. Dies könnte mit SEC erreicht werden, obwohl die Bedingungen möglicherweise von Formulierung zu Formulierung optimiert werden müssen.

Prokaryotische oder eukaryotische Lysate für die zellfreie Expression von Proteinen sind als kommerzielle Produkte für die Synthese von Proteinen von Interesse leicht erhältlich (für eine vollständige Übersicht siehe 1). Diese Expressionssysteme sind in verschiedenen Größenordnungen verfügbar und verwenden Lysate aus verschiedenen Organismen, darunter E. coli, Tabakpflanzen und Säugetierkulturen. Zellfreie Lysate bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen rekombinanten Proteinproduktionsansätzen, darunter Benutzerfreundlichkeit und robuste, schnelle Proteinproduktion. Während diese Ansätze in erster Linie zur Herstellung löslicher Proteine verwendet werden, hat diese Gruppe einen Ansatz für ihre Verwendung zur Expression von Membranproteinen entwickelt.
Dieser neuartige Ansatz nimmt geringfügige Modifikationen an bestehenden zellfreien Expressionssystemen vor, indem er DNA einbezieht, die für zwei Proteinprodukte für die Expression kodiert, ein Apolipoprotein und das Membranprotein von Interesse. Das exprimierte Apolipoprotein (Derivate von ApoA1 oder ApoE4) interagiert mit Lipiden, die dem zellfreien Lysat zugesetzt werden, um spontan (~20 nm) NLPs zusammenzusetzen. Bei Co-Translation mit einem interessierenden Membranprotein bilden das NLP und das Membranprotein einen löslichen Nanopartikelkomplex, wobei das Membranprotein in die NLP-Lipiddoppelschicht eingebettet ist. Somit ist das Membranprotein für nachgelagerte Anwendungen leichter zugänglich, da es in löslichen, diskreten Partikeln enthalten ist. Dieser Ansatz kann funktionelle oligomere Proteinkomplexe innerhalb der NLP-Doppelschicht2 erzeugen und die Antigenkomponente eines Untereinheitsimpfstoffs herstellen, der anschließend mit lipophilen Adjuvantien gemischt wird, um einen Nanopartikel-Impfstoff mit kolokalisiertem Antigen und Adjuvans zu bilden, der für die In-vivo-Bewertung geeignet ist.
Dieses aktuelle Verfahren ist eine Modifikation eines zuvor veröffentlichten Protokolls3. Wesentliche Modifikationen konzentrieren sich auf das Scale-up der zellfreien Reaktion und die anschließende Aufreinigung des Protein-NLP-Komplexes. Eine weitere Modifikation beinhaltet die Zugabe eines amphiphilen Polymers, das als Telodendrimer bekannt ist, das zunächst mit den Lipiden vermischt wird, bevor es zur zellfreien Reaktion hinzugefügt wird. Die Co-Translation der Plasmide in Gegenwart des Telodendrimers und der Lipide erzeugt ein Telodendrimer NLP (tNLP). Die Zugabe des Telodendrimers trägt auch dazu bei, die Größe und Monodispersität der resultierenden tNLP-Nanopartikel zu modulieren4. Dieses Protokoll ist speziell für groß angelegte Impfstoffstudien optimiert, um ein membrangebundenes Untereinheits-Antigenprotein, Chlamydien MOMP5,6, herzustellen. Die Methode erzeugt rekombinantes MOMP, das mit tNLP assoziiert ist, um einen hochlöslichen MOMP-tNLP-Komplex zu bilden, der die MOMP-Oligomerisierung beibehält. Eine typische 3-ml-Scale-up-Produktion ergibt >1,5 mg gereinigtes MOMP. Das zellfrei hergestellte MOMP-tNLP ist für eine schnelle adjuvante Zugabe für In-vivo-Immunogenitätstests geeignet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2600028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Trizma hydrochloride solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial, ACS reagent, &#8805;99.7%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer Dam for XCell SureLock</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C24 Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit</td>
			<td>BiotechRabbit</td>
			<td>BR1400201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete His-Tag Purification Resin</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td>5893682001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG-ODN1826</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71508-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe PTS cartridge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9594798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe-PTS Testing System</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl and NaOH solutions for pH adjustment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC with UV-vis diode array detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure culture-grade water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Dry Blotting System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>IB24001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio V2.0 software</td>
			<td>Li-COR Biiosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Fc imager</td>
			<td>Li-COR Biiosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (&#8805;99.9%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP000202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIVEX2.4d vector</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 1000 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 20 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 200 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipettes</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic NaH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200, 5/150 GL column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>GE28-9909-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>&#160;tlrl-fsl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby Protein Gel Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Bench Top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 15 mL conicals (89039-666)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 50 mL conicals (89039-656)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies )</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free scaled production and adjuvant addition to a recombinant major outer membrane protein from chlamydia muridarum for vaccine development

Subunit-Impfstoffe bieten Vorteile gegenüber herkömmlichen inaktivierten oder abgeschwächten Ganzzell-Impfstoffen in Bezug auf Sicherheit, Stabilität und Standardherstellung. Um einen wirksamen proteinbasierten Subunit-Impfstoff zu erhalten, muss das Proteinantigen oft eine native Konformation annehmen. Dies ist besonders wichtig für Pathogen-Oberflächenantigene, bei denen es sich um membrangebundene Proteine handelt. Zellfreie Methoden wurden erfolgreich eingesetzt, um korrekt gefaltetes funktionelles Membranprotein durch die Co-Translation von Nanolipoproteinpartikeln (NLPs), allgemein bekannt als Nanodiscs, herzustellen. 
Mit dieser Strategie können Untereinheiten-Impfstoffe hergestellt werden, die aus Membranproteinen in einer lipidgebundenen Umgebung bestehen. Die zellfreie Proteinproduktion ist jedoch oft auf den kleinen Maßstab (<1 ml) beschränkt. Die Menge an Protein, die in kleinen Produktionsläufen produziert wird, reicht in der Regel für biochemische und biophysikalische Studien aus. Der zellfreie Prozess muss jedoch skaliert, optimiert und sorgfältig getestet werden, um genügend Protein für Impfstoffstudien in Tiermodellen zu erhalten. Andere Prozesse, die an der Impfstoffherstellung beteiligt sind, wie z. B. die Reinigung, die Adjuvans-Zugabe und die Gefriertrocknung, müssen parallel optimiert werden. In diesem Artikel wird über die Entwicklung eines skalierten Protokolls zur Expression, Reinigung und Formulierung eines membrangebundenen Proteinuntereinheitsimpfstoffs berichtet. 
Skalierte zellfreie Reaktionen erfordern eine Optimierung der Plasmidkonzentrationen und -verhältnisse bei der Verwendung mehrerer Plasmidexpressionsvektoren, der Lipidauswahl und der Adjuvansaddition für die Herstellung von formulierten Nanolipoproteinpartikeln auf hohem Niveau. Die Methode wird hier mit der Expression eines Chlamydien-Hauptmembranproteins (MOMP) demonstriert, kann aber auch auf andere Membranproteinantigene angewendet werden. Die Wirksamkeit von Antigenen kann in vivo durch Immunisierungsstudien zur Messung der Antikörperproduktion bewertet werden, wie hier gezeigt.

Das SDS-PAGE-Profil der Ni-Affinitätsreinigung von MOMP-tNLP aus einer zellfreien 1-ml-Reaktion ist in Abbildung 1B dargestellt. Die Reaktion führte zu einer hohen Expression sowohl des MOMP- als auch des Δ49ApoA1-Proteins. Frühere Ergebnisse zeigten, dass die zellfreie Expression von Δ49ApoA1 in Gegenwart von DMPC und Telodendrimer zur Bildung von Telodendrimer-Nanolipoproteinpartikeln (tNLPs) führte4. Die Ko-Elution von MOMP mit Δ49ApoA1 deutete darauf hin, dass MOMP mit tNLPs assoziiert ist, da der His-Tag nur auf dem tNLP-Gerüst Δ49ApoA1 und nicht auf MOMP vorhanden ist. MOMP ist ein hochgradig unlösliches Protein, das nur durch Komplexierung mit tNLPs eluiert werden kann, die nachweislich die Solubilisierung von Membranproteinen erleichtern.
Die Elutionsfraktionen, die MOMP-tNLPs enthielten, wurden gepoolt und die Gesamtproteinkonzentration mit einem fluoreszenzbasierten Quantifizierungsgerät oder einem Gerät, das die Konzentration durch Absorption bei 280 nm misst, gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Proteinquantifizierung bestimmt. Um eine präzise Dosierung des MOMP-Impfstoffs zu ermöglichen, ist es auch wichtig, die Konzentration von MOMP in den gereinigten Komplexen zu bestimmen. Wir entwickelten eine Methode zur Quantifizierung von MOMP auf der Grundlage der Geldensitometrie (Abbildung 2), bei der ein gereinigtes rekombinantes MOMP mit bekannter Konzentration als Standard verwendet wurde. Durch die Erstellung der Standardkurve und den Vergleich mit der MOMP-tNLP-Probe kann die MOMP-Konzentration genau quantifiziert werden. Die Bestimmung der MOMP-Konzentration in der gereinigten Probe ermöglichte die Abschätzung der Ausbeute von MOMP in zellfreien Reaktionen auf verschiedenen Skalen, was für die Planung des Reaktionsaufbaus für nachgelagerte Studien wichtig ist (Tabelle 3).
MOMP muss Oligomere bilden, um eine robuste Immunantwort hervorzurufen11. Um den oligomeren Zustand von MOMP zu testen, wurde MOMP-tNLP in Gegenwart und Abwesenheit von Wärme und dem Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT, 50 mM, Abbildung 3A) analysiert. Oligomere höherer Ordnung von MOMP wurden mittels SDS-PAGE identifiziert, wenn die Proben nicht mit Hitze und DTT behandelt wurden. Im Vergleich dazu zeigten Proben, die mit Hitze in Gegenwart von DTT behandelt wurden, hauptsächlich zwei unterschiedliche Banden auf dem Gel, die MOMP und Δ49ApoA1 (ca. 40 kDa bzw. 22 kDa) entsprechen. Diese Ergebnisse ähneln stark dem Gelbandenmuster, das der Oligomerbildung von MOMP zugeschrieben wird, was für seine Wirksamkeit entscheidend ist.
Eine weitere Western-Blot-Analyse mit MAb40, einem Antikörper gegen das lineare Epitop auf der variablen Domäne des MOMP-Proteins, zeigte ein ähnliches Bandenmuster, das die Oligomerbildung durch das MOMP-Protein in seinem nicht denaturierten Zustand bestätigte (Abbildung 3B). Ein wichtiger Faktor, der die Bildung von MOMP-Oligomeren beeinflusst, ist das Verhältnis zwischen dem MOMP-Plasmid und dem Δ49ApoA1-Plasmid während des zellfreien Reaktionsaufbaus. Tabelle 4 listet das Verhältnis der Plasmide und die resultierende Insertionsrate von MOMP in tNLPs auf. Frühere Studien deuteten darauf hin, dass Chlamydien-MOMP und andere Proteine der äußeren Membran hauptsächlich als Trimere vorliegenkönnten 12. Um die Trimerbildung in der zellfreien Reaktion zu maximieren, ist es wünschenswert, die Insertionsrate nahe bei drei MOMP-Proteinen pro NLP zu haben, was einem Plasmidverhältnis von ~25:1 MOMP zu Δ49ApoA1 entspricht.
Ein Dot-Blot-Assay wurde als optimierte Methode verwendet, um das Vorhandensein von MOMP und tNLP nachzuweisen. Der MAb40-Antikörper wurde zum Nachweis der Gesamt-MOMP verwendet. Der MAbHIS-Antikörper, der auf den His-Tag auf dem Δ49ApoA1-Gerüst des tNLP gerichtet war, wurde verwendet, um das Vorhandensein von tNLP zu bestimmen. Die Co-Signaltransduktion von MAb40- und MAbHIS-Antikörpern deutete auf die Bildung von MOMP-tNLP hin. Die Kontrollreaktion produzierte leeres tNLP, das nur ein positives Signal von MAbHIS zeigte (Abbildung 3C). Um die Immunogenität von MOMP-tNLPs, die in der zellfreien Reaktion produziert werden, zu testen, haben wir MOMP-tNLP mit CpG + FSL-1 adjuvantiert und Mäusen in einem Prime-Boost-Regime, wie oben beschrieben, intramuskulär (i.m.) injiziert. Den immunisierten Mäusen wurden Seren entnommen und der MOMP-spezifische IgG-Antikörper wurde mit einem Western-Blot-Assay gemessen (Abbildung 4). Die Seren von Mäusen, denen adjuvantiertes MOMP-tNLP injiziert wurde, zeigten eine starke MOMP-Bindung, was darauf hindeutet, dass MOMP-tNLP in vivo eine Immunantwort hervorrufen könnte.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig01.jpg"> Abbildung 1: Expression und Aufreinigung von MOMP-tNLP. (A) Bild von Röhrchen, die kleine Aliquots einer zellfreien Reaktion enthalten, die erfolgreich exprimiert, GFP kontrolliert die Luminanz unter UV-Lichtquelle (rechts) im Vergleich zu Lysaten ohne GFP-Plasmid (links). (B) Das mit SYPRO Ruby gefärbte Proteingel nach SDS-PAGE zeigt das Aufreinigungsprofil von MOMP-tNLP. MOMP migriert mit 40 kDa und der 49ApoA1 mit 22 kDa. Abkürzungen: MOMP = chlamydiales major outer membrane protein; tNLP = Telodendrimer-Nanolipoproteinpartikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-Komplex; GFP = grün fluoreszierendes Protein-kodierendes Plasmid; MW = Molekulargewichtsmarker; T = zellfreies Lysat insgesamt; FT = Durchfluss; R1-R3 = zellfreie Reaktionsaliquote; W1, W6 = Waschgänge 1 und 6; E1-E7 = Elutionen 1 bis 7; Δ49ApoA1 = ApoA1-Derivat der His-markierten Maus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig02.jpg"> Abbildung 2: Quantifizierung von MOMP in MOMP-tNLP-Proben . (A) SDS-PAGE-Gel, gefärbt mit SYPRO Ruby zur Quantifizierung von MOMP. Rekombinantes MOMP mit bekannter Konzentration wurde auf das Gel geladen, um die Standardkurve zu erhalten. Jede Spur enthielt 0,1 μg, 0,5 μg, 1,0 μg, 2,0 μg und 4,0 μg MOMP. MOMP-tNLP-Proben, die quantifiziert wurden, wurden auf dasselbe Gel geladen. (B) Die MOMP-Konzentrationsstandardkurve wurde mittels Densitometrie erstellt. Es wurde eine Gleichung aufgestellt, die die normalisierte Banddichte und die Menge an MOMP in Beziehung setzt. Die Gleichung wurde verwendet, um den MOMP-Gehalt in den unbekannten Proben zu berechnen. Abkürzungen: MOMP = chlamydiales major outer membrane protein; tNLP = Telodendrimer-Nanolipoproteinpartikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-Komplex; SDS-PAGE = Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig03.jpg"> Abbildung 3: Zellfrei produziertes MOMP-tNLP ermöglicht es MOMP, Strukturen höherer Ordnung zu bilden. (A) SDS-PAGE-Gel aus MOMP-tNLP mit und ohne Behandlung von Hitze und Reduktionsmittel DTT, gefärbt mit SYPRO Ruby. Mit Hitze und DTT trat MOMP in erster Linie als Monomerbande bei ~40 kDa auf, da Wärme und das Reduktionsmittel den Großteil der MOMP-Struktur höherer Ordnung abbauten. In Abwesenheit von Wärme und DTT waren die Banden höherer Ordnung vorhanden, was auf eine MOMP-Oligomerkonformation hindeutet. (B) Western Blot von MOMP-tNLP und MOMP allein, unbehandelt und mit Hitze und DTT behandelt. Nach dem Transfer wurde die Membran mit MAb40 (1:1.000 Verdünnung) untersucht. Es wurde ein Bandenmuster beobachtet, das dem SYPRO-Rubin-gefärbten Gel ähnelte, was bestätigte, dass es sich bei den Banden mit höherem Molekulargewicht tatsächlich um MOMP-Oligomere handelte. (C) Punktfleck von MOMP-tNLP und leeren tNLP-Proben (in doppelter Ausführung), die mit MAb40 und MAbHIS untersucht wurden. Abkürzungen: MOMP = chlamydiales major outer membrane protein; tNLP = Telodendrimer-Nanolipoproteinpartikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-Komplex; SDS-PAGE = Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese; DTT = Dithiothreitol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig04.jpg"> Abbildung 4: Zellfrei produziertes MOMP-tNLP ist hochgradig immunogen. Das Serum von immunisierten Mäusen zeigte ein starkes Anti-MOMP-IgG-Signal. MOMP-tNLP adjuvantiert mit CpG + FSL-1 wurde zur Immunisierung von Mäusen verwendet. Seren von sechs immunisierten Mäusen wurden gesammelt, gepoolt und zur Untersuchung von MOMP-tNLP verwendet. Das Serum konnte in einem Western-Blotting-Assay an MOMP binden und zeigte ein starkes IgG-Signal (links). Der Western Blot mit MAb40 als primärem Antikörper (rechts) zeigte ähnliche Banden, was darauf hindeutet, dass das Serum MOMP-spezifisches IgG enthielt. Abkürzungen: MOMP = chlamydiales major outer membrane protein; tNLP = Telodendrimer-Nanolipoproteinpartikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-Komplex; CpG = cholesterinmodifiziertes CpG-Adjuvans; FSL-1 = lipophiles Adjuvans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Name des Puffers</td>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>Imidazol</td>
			<td>Ph</td>
		</tr><tr><td>Bindungspuffer</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Wasch-Puffer</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Elutions-Puffer 1</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>250 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Elutions-Puffer 2</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Liste der Puffer, die für die Reinigung der Nickelaffinität benötigt werden, mit Angabe der Konzentrationen der einzelnen Komponenten und des pH-Werts.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Laufzeit</td>
			<td>50 Minuten</td>
		</tr><tr><td>Durchflussmenge</td>
			<td>6,0 ml/min</td>
		</tr><tr><td>Verlaufstyp</td>
			<td>Binär</td>
		</tr><tr><td>Puffer A</td>
			<td>10 mM TEAA in H20</td>
		</tr><tr><td>Puffer B</td>
			<td>MeCN</td>
		</tr><tr><td>Steigung</td>
			<td>% Puffer B</td>
		</tr><tr><td>0 min</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>30 min</td>
			<td>60%</td>
		</tr><tr><td>30,5 Minuten</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>40 Minuten</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>40,5 Minuten</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>50 Minuten</td>
			<td>25%</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Bedingungen für die Umkehrphasen-HPLC-Aufreinigung von cholesterinmodifiziertem CpG. Abkürzungen: TEAA = Triethylammoniumacetat; MeCN = Acetonitril.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Zellfreies Lysat (ml)</td>
			<td>DMPC-Lipid (mg)</td>
			<td>Telodendrimer (mg)</td>
			<td>MOMP-Plasmid (μg)</td>
			<td>Gereinigte MOMP-Ausbeute (mg)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>0.4</td>
			<td>15</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>8</td>
			<td>0.8</td>
			<td>30</td>
			<td>1.1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>12</td>
			<td>1.2</td>
			<td>45</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>75</td>
			<td>2.7</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 3: Die Menge an Lipiden, Telodendrimeren und Plasmiden, die für unterschiedlich skalierte zellfreie Reaktionen verwendet werden, und die entsprechenden Ausbeuten. Abkürzungen: MOMP = chlamydiales major outer membrane protein; DMPC = 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Verhältnisse des Plasmideingangs, MOMP : Δ49ApoA1</td>
			<td>1:1</td>
			<td>5:1</td>
			<td>10:1</td>
			<td>25:1</td>
			<td>50:1</td>
			<td>100:1</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Verhältnis der produzierten Proteinmenge, MOMP : Δ49ApoA1</td>
			<td>0.02</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.64</td>
			<td>3.46</td>
			<td>6.55</td>
			<td>20.04</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Geschätzte Anzahl der MOMP-Insertionen pro tNLP</td>
			<td>0.03</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.75</td>
			<td>4.04</td>
			<td>7.65</td>
			<td>23.39</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 4: Die Plasmidverhältnisse in einer zellfreien Reaktion und die resultierenden MOMP-Insertionsraten. Abkürzungen: MOMP = chlamydiales major outer membrane protein; tNLP = Telodendrimer-Nanolipoproteinpartikel; Δ49ApoA1 = ApoA1-Derivat der His-markierten Maus.

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Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung kommerzieller, zellfreier Proteinexpressionskits zur Herstellung von Membranproteinen, die in Nanodisc unterstützt werden und als Antigene in Subunit-Impfstoffen verwendet werden können.

Zellfreie skalierte Produktion und adjuvante Zugabe zu einem rekombinanten Haupt-Außenmembranprotein aus Chlamydia muridarum für die Impfstoffentwicklung

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard ...

Viele mögliche Impfstoffantigene für Untereinheiten sind Membranproteine. In der Vergangenheit war es schwierig, diese in ausreichender Menge herzustellen und zu reinigen. Mit dieser Technik sind wir in der Lage, interessante Antigene zu erzeugen, die in eine Lipidmembran eingebettet sind, um eine native Bestätigung zu gewährleisten.Dieses Verfahren erleichtert auch die Formulierung mit interessanten Adjuvantien. Die zellfreie Expression ermöglicht die schnelle Produktion von Proteinen von Interesse in ihrer nativen taglosen Struktur. Diese Technik ist auch skalierbar und wir arbeiten bereits mit kommerziellen Unternehmen zusammen, um Impfstoffformulierungen mit diesem Verfahren zu entwickeln.Wir demonstrieren den Prozess hier für ein Chlamydien-Antigen, aber der Prozess könnte leicht angepasst werden, um Antigene von Interesse zu produzieren, unabhängig davon, ob es sich um Membranproteine handelt oder nicht. Dieser Prozess könnte sowohl auf die Entwicklung von Krankheitserregern als auch auf die Entwicklung von Krebsimpfstoffen anwendbar sein. Bereiten Sie zunächst MOMP-tNLPs mit einer zellfreien Methode vor.Tauen Sie den Rekonstitutionspuffer aus dem zellfreien Proteinexpressionskit zwei Stunden vor dem Einstellen der Reaktion auf und fügen Sie dem Puffer EDTA-freien Proteaseinhibitor hinzu. Verwenden Sie ein Kit, das für fünf Ein-Milliliter-Reaktionen ausgelegt ist. Für jede Ein-Milliliter-Reaktion werden 525 Mikroliter Rekonstitutionspuffer in die E.coli-Lysatflasche gegeben und gerollt, um sie aufzulösen.250 Mikroliter des Rekonstitutionspuffers in die Reaktionsflasche mit dem Additiv geben und durch Rollen auflösen. Als nächstes werden 8,1 Milliliter Rekonstitutionspuffer in die Reaktionsflasche gegeben und zum Auflösen gerollt. Fügen Sie einer Flasche mit einer Aminosäuremischung drei Milliliter Rekonstitutionspuffer hinzu, um sie aufzulösen.Zu einer weiteren Flasche Methionin geben Sie 1,8 Milliliter Rekonstitutionspuffer, lösen Sie ihn auf und lagern Sie ihn auf Eis. 225 Mikroliter der rekonstituierten Mischung, 270 Mikroliter der rekonstituierten Aminosäuremischung ohne Methionin und 30 Mikroliter rekonstituiertes Methionin in die E.coli-Lysatflasche geben. Des Weiteren werden 400 Mikroliter der DMPC/Telodendrimer-Mischung, 15 Mikrogramm MOMP-Plasmid und 0,6 Mikrogramm Delta-49ApoA1 zu der Mischung gegeben und gemischt.Aliquot 20 Mikroliter der Gesamtlösung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen Für eine GFP-exprimierende Kontrollreaktion. Bereiten Sie eine Futterlösung vor, indem Sie 2,65 Milliliter der rekonstituierten Aminosäuremischung ohne Methionin und 300 Mikroliter rekonstituiertes Methionin hinzufügen. Einen Milliliter der Reaktionslösung in die innere Reaktionskammer des zellfreien Reaktionskits überführen und verschließen.Füllen Sie die äußere Kammer des Reaktionsgefäßes mit 10 Millilitern der Zufuhrlösung und verschließen Sie sie. Zu den 20-Mikroliter-Aliquoten des Reaktionsgemisches werden 0,5 Mikroliter des GFP-Kontrollplasmids gegeben. Die Reaktion wird 18 Stunden lang bei 30 Grad Celsius mit 300 Umdrehungen pro Minute in einen Shaker gegeben.Überwachen Sie die Reaktion unter UV-Licht nach 15 Minuten auf Fluoreszenz aufgrund der GFP-Synthese. Reinigen Sie den MOMP-tNLP-Nanopartikelkomplex aus dem zellfreien Reaktionsgemisch durch immobilisierte Nickelaffinitätschromatographie unter Verwendung des HIS-Tags auf dem Delta-49ApoA1-Protein. Geben Sie einen Milliliter der 50%igen Aufschlämmung des HIS-Tag-Reinigungsharzes in eine 10-Milliliter-Einweg-Chromatographiesäule und fügen Sie drei Milliliter Bindungspuffer hinzu, um das Gleichgewicht herzustellen.Danach den Puffer abtropfen lassen und dem Harz 250 Mikroliter Bindepuffer hinzufügen. Extrahieren Sie 20 Mikroliter der zellfreien Reaktionsmischung für die SDS-PAGE-Analyse. Die restliche zellfreie Reaktionsmischung mit dem äquilibrierten Harz zugeben und eine Stunde auf einer Laborwippe bei vier Grad Celsius inkubieren.Entfernen Sie die Säulenkappe und waschen Sie sie mit 500 Mikrolitern Bindepuffer. Geben Sie die Waschflüssigkeit in die Säule und sammeln Sie den Durchfluss für die SDS-PAGE-Analyse. Waschen Sie die Säule sechsmal mit einem Milliliter Waschpuffer mit 20-Millimolar-Imidazol und sammeln Sie die Fraktionen.Verwenden Sie beim zweiten Waschen eine Ein-Milliliter-Pipette, um das Harz zu rühren. Die MOMP-tNLPs werden in sechs 300-Mikroliter-Fraktionen des Elutionspuffers I mit 250-Millimolar-Imidazol und einer endgültigen Elution mit 300 Mikrolitern Elutionspuffer II mit 500-Millimolar-Imidazol eluiert. Bei der zweiten Elution wird das Harz kräftig gerührt, indem Sie es mit einer Ein-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren.Verwenden Sie einen Gel-Imager, um die Bilder bei 600 Nanometern aufzunehmen. Quantifizieren Sie dann die Menge der verschiedenen Proteine in den Nanopartikeln durch SDS-PAGE-Analyse unter Verwendung eines Proteinstandards. Zeichnen Sie eine Standardkurve mit den Dichten der MOMP-Bänder.Bestimmen Sie dann die MOMP-Komponente der Nanopartikel mit dem Standard. Lösen Sie die Proben mit SDS-PAGE auf und übertragen Sie die Gelstapel mit einem handelsüblichen Trockenblotting-System für die Western-Blot-Analyse. Entfernen Sie die Blots aus dem Stapel und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius in einem Blockierungspuffer, der 0,2 % TWEEN 20 und 0,5 Mikrogramm pro Milliliter MAb40 oder 0,2 Mikrogramm pro Milliliter MAbHIS-AntiHIS-Tag-Antikörper enthält, der gegen den HIS-Tag des Delta-49ApoA1-Proteins gerichtet ist.Waschen Sie jeden Klecks dreimal für fünf Minuten pro Waschgang mit PBST. Inkubieren Sie die Blots für eine Stunde in einem Blockierungspuffer, der sekundäre Antikörper enthält, die mit einem Fluorophor in einer Verdünnung von 1:10.000 konjugiert sind. Wiederholen Sie die Wäschen mit PBST und nehmen Sie das Bild nach der letzten Wäsche mit einem Fluoreszenz-Imager auf.Tupfen Sie mit einem Dot-Blot-Gerät drei Mikrogramm MOMP-tNLP und entleeren Sie tNLP. Entwickeln und blockieren Sie die Blots mit der gleichen Methode wie beim Western Blotting. Die gemischte Lösung auf Trockeneis einfrieren und über Nacht mit einem Gefriertrockner gefrieren.Lagern Sie die getrockneten Rezepturen bei minus 20 Grad Celsius. Rekonstituieren Sie bei Bedarf die gefriergetrockneten tNLPs mit endotoxinfreiem Wasser und rollen Sie es, um es aufzulösen und zu rehydrieren. Dialysieren Sie die Lösung mit PBS und entfernen Sie die Trehalose mit einer 3,5-Kilodalton-Cutoff-Dialysemembran.Zentrifugieren Sie die Nanopartikellösung in einem Vakuumkonzentrator, bevor Sie das Adjuvans hinzufügen. Überwachen Sie das Probenvolumen nach 20 bis 30 Minuten, um ein vollständiges Austrocknen zu verhindern. Geben Sie das Adjuvans in einer Biosicherheitswerkbank unter sterilen Bedingungen hinzu.Analysieren Sie die Formulierung mit Hilfe der analytischen Größenausschlusschromatographie für eine erfolgreiche Einarbeitung. Lagern Sie die adjuvantierten MOMP-tNLPs und entleeren Sie tNLP bei vier Grad Celsius für bis zu 14 Tage. Analysieren Sie die Stabilität der tNLP-Formulierung mit Größenausschlusschromatographie.Die SDS-PAGE-Analyse von MOMP-tNLP wurde mittels Nickel-Affinitätschromatographie durchgeführt, die zeigte, dass das zellfreie Reaktionsgemisch sowohl für das MOMP- als auch für das delta-49ApoA1-Protein eine hohe Expression aufweist. Mit Hilfe der Geldensitometrie wurde die MOMP-Konzentration unter Verwendung eines gereinigten rekombinanten MOMP mit einer bekannten Konzentration als Standard quantifiziert. Um die Oligomerbildung zu bestimmen, wurden SDS-PAGE MOMP und MOMP-tNLP mit Hitze und DTT behandelt, die unterschiedliche Banden für MOMP und delta-49ApoA1 aufwiesen.Die Western-Blot-Analyse mit dem Antikörper MAb40 wurde gegen das MOMP-Protein durchgeführt, was ein Bandenmuster zeigte, das die Oligomerbildung durch das MOMP-Protein in seinem nicht denaturierten Zustand bestätigte. In Gegenwart von MAb40- und MAbHIS-Antikörpern wurde ein Dot-Blot-Assay durchgeführt, der auf die Bildung von MOMP-tNLP hindeutete. Leeres tNLP zeigte jedoch ein positives Signal für MAbHIS.Seren von immunisierten Mäusen, denen adjuvantiertes MOMP-tNLP injiziert wurde, zeigten eine starke MOMP-Bindung und deuteten darauf hin, dass MOMP-tNLP eine Immunantwort hervorrufen könnte. Da dieses Protokoll Protein aus DNA erzeugt, ist es wichtig, eine Kontamination der Reaktion mit DNase, RNase sowie der fremden DNA und RNA zu vermeiden. Alle Materialien oder Reagenzien, die in den Reaktionen verwendet werden, sollten frei von dieser Art von Molekülen sein.Nach der Expression, Reinigung und Zugabe von Adjuvantien können diese Impfstoffkandidaten in geeigneten Tiermodellen für die interessierenden Krankheitserreger evaluiert werden, um Immunaktivierungsmarker zu bewerten oder den Schutz während einer Herausforderung zu bewerten. Für Chlamydien gilt das Hauptprotein der äußeren Membran (MOMP) seit vielen Jahren als führender Kandidat für Subunit-Impfstoffe, aber es war schwierig, es in den für die Impfstoffanwendung erforderlichen Maßstäben herzustellen. Die zellfreie Co-Expression dieses Membranproteins ist ein gangbarer Weg, um dieses Protein in Tiermodellen wie Mäusen zu evaluieren und schließlich am Menschen zu testen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Rekombinanten retroviralen Produktion und Infektion von B-Zellen

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion und Titrierung von rekombinanten Adeno-assoziierte virale Vektoren

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Aufzählung der wichtigsten peripheren Blut Leukozyten Populationen für Multicenter Clinical Trials mit einem Vollblut Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Vorwärts Genetische Ansätze in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In-vitro-Analyse Myd88-vermittelte zelluläre Immunantwort gegen das West-Nil-Virus-Infektion Mutantenstamm

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila der äußeren Membran - Vesikeln: Isolierung und Analyse ihrer Pro-inflammatorische Potential auf Makrophagen

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Einzellige Quantifizierung der mRNA und Oberfläche Protein-Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infizierten CD4+ T Zellen isoliert von Rhesus-Makaken