Name: cell-free scaled production and adjuvant addition to a recombinant major outer membrane protein from chlamydia muridarum for vaccine development
Uploaded: 2022-03-16T12:30:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק שירות בריאות הציבור R21 AI20925 ו- U19 AI144184 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות. עבודה זו בוצעה בחסות משרד האנרגיה של ארה"ב על ידי המעבדה הלאומית לורנס ליברמור תחת חוזה DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525, LLNL-VIDEO-832788].

<ol>
	<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li><li>Coleman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+association+of+the+Yersinia+pestis+translocon+proteins,+YopB+and+YopD,+are+facilitated+by+nanolipoprotein+particles.">Expression and association of the Yersinia pestis translocon proteins, YopB and YopD, are facilitated by nanolipoprotein particles.</a> PLoS One. 11 (3), 0150166 (2016).</li><li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein,+forming+soluble+nanolipoprotein+particles.">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+diameter,+monodispersity,+and+solubility+of+ApoA1+nanolipoprotein+particles+using+telodendrimer+chemistry.">Controlling the diameter, monodispersity, and solubility of ApoA1 nanolipoprotein particles using telodendrimer chemistry.</a> Protein Science. 22 (8), 1078-1086 (2013).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+production+of+a+functional+oligomeric+form+of+a+Chlamydia+major+outer-membrane+protein+(MOMP)+for+vaccine+development.">Cell-free production of a functional oligomeric form of a Chlamydia major outer-membrane protein (MOMP) for vaccine development.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 15121-15132 (2017).</li><li>Tifrea, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protection+in+mice+against+a+Chlamydia+muridarum+respiratory+challenge+by+a+vaccine+formulated+with+the+major+outer+membrane+protein+in+nanolipoprotein+particles.">Induction of protection in mice against a Chlamydia muridarum respiratory challenge by a vaccine formulated with the major outer membrane protein in nanolipoprotein particles.</a> Vaccines. 9 (7), 755 (2021).</li><li>Cleveland, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+X-ray+and+neutron+scattering+demonstrates+that+cell-free+expression+produces+properly+formed+disc-shaped+nanolipoprotein+particles.">Small-angle X-ray and neutron scattering demonstrates that cell-free expression produces properly formed disc-shaped nanolipoprotein particles.</a> Protein Science. 27 (3), 780-789 (2018).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+to+nickel-chelating+nanolipoprotein+particles+increases+the+potency+and+efficacy+of+subunit+vaccines+to+prevent+West+Nile+encephalitis.">Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (6), 1018-1022 (2010).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalized+delivery+of+adjuvant+and+antigen+using+nanolipoprotein+particles+enhances+the+immune+response+to+recombinant+antigens.">Colocalized delivery of adjuvant and antigen using nanolipoprotein particles enhances the immune response to recombinant antigens.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (6), 2044-2047 (2013).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanolipoprotein+particles+(NLPs)+as+an+in+vivo+delivery+platform.">Evaluation of nanolipoprotein particles (NLPs) as an in vivo delivery platform.</a> PLoS One. 9 (3), 93342 (2014).</li><li>Pal, S., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+the+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein+can+elicit+an+immune+response+as+protective+as+that+resulting+from+inoculation+with+live+bacteria.">Vaccination with the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein can elicit an immune response as protective as that resulting from inoculation with live bacteria.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8153-8160 (2005).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+major+outer+membrane+protein+of+Chlamydia+trachomatis.">Structural and functional analyses of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 189 (17), 6222-6235 (2007).</li><li>Hafner, L. M., Wilson, D. P., Timms, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+status+and+future+prospects+for+a+vaccine+against+Chlamydia+trachomatis+infection.">Development status and future prospects for a vaccine against Chlamydia trachomatis infection.</a> Vaccine. 32 (14), 1563-1571 (2014).</li><li>Findlay, H. E., McClafferty, H., Ashley, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression,+single-channel+analysis+and+membrane+topology+of+recombinant+Chlamydia+trachomatis+Major+Outer+Membrane+Protein.">Surface expression, single-channel analysis and membrane topology of recombinant Chlamydia trachomatis Major Outer Membrane Protein.</a> BMC Microbiology. 5, 5 (2005).</li><li>Sun, G., Pal, S., Weiland, J., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+an+intranasal+challenge+by+vaccines+formulated+with+native+and+recombinant+preparations+of+the+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein.">Protection against an intranasal challenge by vaccines formulated with native and recombinant preparations of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein.</a> Vaccine. 27 (36), 5020-5025 (2009).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+of+functional+receptor+tyrosine+kinases.">Cell-free expression of functional receptor tyrosine kinases.</a> Scientific Reports. 5 (1), 12896 (2015).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים ידועים או קשרים אישיים שיכלו להשפיע לכאורה על העבודה המדווחת במאמר זה.

כלמידיה היא הזיהום הנפוץ ביותר המועבר במגע מיני המשפיע על גברים ונשים כאחד. למרות שמחקר החיסונים על כלמידיה משתרע על פני עשרות שנים, חיסון בטוח ויעיל שניתן להרחיב אותו לייצור המוני נותר חמקמק13. ה-MOMP הכלמידיאלי נחשב למועמד המוביל כאנטיגן מגן לחיסון; עם זאת, MOMP הוא הידרופובי מאוד ונוטה לקיפול שגוי14,15. מחקר נוסף גילה כי MOMP קיים במצבים אוליגומריים החיוניים לאימונוגניות שלו11. להלן שיטת ביטוי משותף מאומתת ונטולת תאים המייצרת MOMP אוליגומרי שנוצר בתוך ננו-חלקיק tNLP כחיסון, עם תפוקות של כ-1.5 מ"ג MOMP מטוהר לכל 3 מ"ל ליזט. הליך זה שנאסף במלואו יכול להיות מורחב עוד יותר לייצור תעשייתי, להגדיל את הסיכויים שלה כגישה שימושית לייצור חיסונים.
פרסמנו בעבר על שימוש בביטוי חופשי של תאים כדי לייצר חלבוני ממברנה המשובצים בתוך NLPs 3,16, כמו גם ביטוי לתוך דיסקים מיוצבים טלודנדרימר. עם זאת, טכניקה אחרונה זו ייצרה חלקיקי חלבון קרום עם הטרוגניות גדולה יותר ומסיסות נמוכה יותר. 4 בנוסף, האימונוגניות של חלקיקי MOMP-telodendrimer אינה ברורה בהשוואה לחלקיקי MOMP-tNLP6.
הליך זה יכול להיות מותאם כדי להגדיל את הביטוי של חלבוני קרום חיידקי כי הם מועמדים מבטיחים כמו אנטיגנים לשימוש בחיסונים תת יחידה. לא רק שהליך זה מייצר חלבון קרום חיידקי מסיס, אלא שהמבנה הכולל של ננו-חלקיקים ניתן לשינוי נוסף באמצעות מגוון אדג'ובנטים של חיסון ליפופילי, כולל, אך לא רק, CpG מצומד לכולסטרול moiety או FSL-1. ביטוי של אנטיגנים מועמדים אחרים מחיידקים הוא אפשרי, אם כי ייתכן שיהיה צורך לחקור פרמטרים כגון טמפרטורת ביטוי, בחירת שומנים וסוג מערכת הביטוי כדי להשיג תפוקות אופטימליות.
בנוסף, בחירת פלסמיד ויחס הם קריטיים בתהליך זה. שני הפלסמידים המשמשים צריכים להיות בנויים מאותה עמוד שדרה. אם התוספות הן בערך באותו אורך, היחסים יכולים להתבסס על המסה של פלסמיד הוסיף, כמתואר כאן. עם זאת, יחס המבוסס על שומות ייתן תוצאות ניתנות יותר לשחזור, במיוחד בעת שינוי קנה המידה של התגובות. יחסים שפועלים היטב בתגובות בקנה מידה של מסך (< 0.5 מ"ל) עשויים שלא להיות ישימים לתגובות גדולות יותר ולדרוש מיטוב נוסף. חלבונים שאינם ממברנות עדיין ניתנים לביטוי באמצעות ערכות נטולות תאים, אך ייתכן שלא יזדקקו לננו-חלקיק שומנים (ביטוי משותף) כדי לייצר תוצר מסיס. בנוסף, בעוד פרוטוקול זה מתאר אדג'ובנטים עם CpG ו-FSL-1, מערכת זו ניתנת לניסוח עם אדג'ובנטים ליפופיליים אחרים או לערבוב עם אדג'ובנטים מסיסים לפי הצורך.
חיוני להימנע מזיהום בעת הגדרת תגובת הביטוי החופשי של התא, שכן זה יכול להשפיע על התשואות. כל תוספים לתגובה, כולל פלסמידים עצמם, צריך להיות טהור מאוד. בנוסף, החלבונים המבוטאים צריכים להיות במגע רק עם חומרים ותמיסות שאינם נקיים מזיהום אנדוטוקסין. זיהום אנדוטוקסין בניסוחים מועמדים יכול להוביל לתוצאות לא עקביות ומזויפות של בדיקות אימונולוגיות ויכול להזיק בכמויות מספיקות. אמנם לא מתואר כאן, טיהור נוסף בעקבות כרומטוגרפיית זיקה לניקל עשוי להיות נחוץ אם מזהמים רבים נצפים בשלבי ניתוח הבאים כגון באמצעות SDS-PAGE. ניתן להשיג זאת עם SEC, אם כי התנאים עשויים לדרוש אופטימיזציה על בסיס ניסוח על בסיס ניסוח.

ליזטים פרוקריוטים או אאוקריוטים לביטוי ללא תאים של חלבונים זמינים בקלות כמוצרים מסחריים לסינתזה של חלבונים מעניינים (לסקירה מלאה, ראה 1). מערכות ביטוי אלה זמינות בקני מידה שונים ומשתמשות בליזטים מאורגניזמים שונים, כולל E. coli, צמחי טבק ותרביות יונקים. ליזטים נטולי תאים מציעים יתרונות רבים על פני גישות מסורתיות לייצור חלבון רקומביננטי, כולל קלות שימוש וייצור חלבון חזק ומהיר. בעוד גישות אלה משמשות בעיקר לייצור חלבונים מסיסים, קבוצה זו הייתה חלוצה בגישה לשימוש בהם כדי לבטא חלבונים ממברנה.
גישה חדשנית זו מבצעת שינויים קלים במערכות ביטוי חופשיות תאים קיימות על ידי הכללת DNA המקודד שני תוצרי חלבון לביטוי, אפוליפופרוטאין וחלבון הממברנה המעניין. אפוליפופרוטאין מבוטא (נגזרות של ApoA1 או ApoE4) אינטראקציה עם שומנים שנוספו לליזט ללא תאים כדי להרכיב באופן ספונטני (~ 20 ננומטר) NLPs. בתרגום משותף עם חלבון ממברנה מעניין, חלבון ה-NLP והממברנה יוצרים קומפלקס ננו-חלקיקים מסיס שבו חלבון הממברנה מוטמע בתוך דו-שכבת השומנים של NLP. לפיכך, חלבון הממברנה נגיש יותר ליישומים במורד הזרם, מכיוון שהוא כלול בתוך חלקיקים מסיסים ובדידים. גישה זו יכולה לייצר קומפלקסים פונקציונליים של חלבונים אוליגומריים בתוך NLP bilayer2 ויכולה לייצר את מרכיב האנטיגן של חיסון תת-יחידה, אשר לאחר מכן מעורבב עם אדג'ובנטים ליפופיליים ליצירת חיסון ננו-חלקיקים הכולל אנטיגן מקומי ואדג'ובנט המתאים להערכת in vivo .
שיטה נוכחית זו שונה מפרוטוקול3 שפורסם בעבר. שינויים עיקריים מתמקדים בקנה מידה של התגובה ללא תאים וטיהור לאחר מכן של קומפלקס חלבון NLP. שינוי נוסף כולל תוספת של פולימר אמפיפילי המכונה טלודנדרימר, אשר מעורבב תחילה עם השומנים לפני הוספה לתגובה ללא תאים. תרגום משותף של הפלסמידים בנוכחות הטלודנדרימר והשומנים מייצר NLP של טלודנדרימר (tNLP). תוספת הטלודנדרימר מסייעת גם לווסת את הגודל והחד-פיזור של חלקיקי tNLP4 המתקבלים. פרוטוקול זה מותאם במיוחד למחקרי חיסון בקנה מידה גדול לייצור חלבון אנטיגן תת-יחידה הקשור לממברנה, כלמידיאלי MOMP 5,6. השיטה מייצרת MOMP רקומביננטי הקשור ל-tNLP ליצירת קומפלקס MOMP-tNLP מסיס ביותר השומר על אוליגומריזציה של MOMP. ייצור מורחב טיפוסי של 3 מ"ל מניב >1.5 מ"ג של MOMP מטוהר. MOMP-tNLP המיוצר ללא תאים מקובל על תוספת אדג'ובנטית מהירה לבדיקת אימונוגניות in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2600028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Trizma hydrochloride solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial, ACS reagent, &#8805;99.7%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer Dam for XCell SureLock</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C24 Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit</td>
			<td>BiotechRabbit</td>
			<td>BR1400201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete His-Tag Purification Resin</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td>5893682001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG-ODN1826</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71508-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe PTS cartridge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9594798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe-PTS Testing System</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl and NaOH solutions for pH adjustment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC with UV-vis diode array detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure culture-grade water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Dry Blotting System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>IB24001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio V2.0 software</td>
			<td>Li-COR Biiosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Fc imager</td>
			<td>Li-COR Biiosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (&#8805;99.9%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP000202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIVEX2.4d vector</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 1000 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 20 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 200 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipettes</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic NaH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200, 5/150 GL column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>GE28-9909-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>&#160;tlrl-fsl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby Protein Gel Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Bench Top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 15 mL conicals (89039-666)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 50 mL conicals (89039-656)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies )</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free scaled production and adjuvant addition to a recombinant major outer membrane protein from chlamydia muridarum for vaccine development

חיסונים תת-יחידתיים מציעים יתרונות על פני חיסונים מסורתיים יותר מומתים או מוחלשים שמקורם בתאים שלמים בבטיחות, יציבות וייצור סטנדרטי. כדי להשיג חיסון יעיל מבוסס חלבון תת-יחידה, האנטיגן החלבוני צריך לעתים קרובות לאמץ קונפורמציה דמוית יליד. זה חשוב במיוחד עבור אנטיגנים פני השטח של פתוגן שהם חלבונים הקשורים לקרום. שיטות נטולות תאים שימשו בהצלחה לייצור חלבון ממברנה פונקציונלי מקופל כראוי באמצעות תרגום משותף של חלקיקי ננוליפופרוטאין (NLPs), הידוע בכינויו ננודיסקים. 
אסטרטגיה זו יכולה לשמש לייצור חיסונים תת-יחידתיים המורכבים מחלבוני ממברנה בסביבה קשורה לשומנים. עם זאת, ייצור חלבון ללא תאים מוגבל לעתים קרובות בקנה מידה קטן (<1 מ"ל). כמות החלבון המיוצרת בריצות ייצור בקנה מידה קטן מספיקה בדרך כלל למחקרים ביוכימיים וביופיזיקליים. עם זאת, התהליך נטול התאים צריך להיות מורחב, אופטימלי ונבדק בקפידה כדי להשיג מספיק חלבון למחקרי חיסונים במודלים של בעלי חיים. תהליכים אחרים המעורבים בייצור חיסונים, כגון טיהור, תוספת אדג'ובנטית וליופיליזציה, צריכים להיות אופטימליים במקביל. מאמר זה מדווח על פיתוח פרוטוקול מורחב לביטוי, טיהור וניסוח חיסון תת-יחידה חלבוני הקשור לקרום. 
תגובות מוגדלות ללא תאים דורשות אופטימיזציה של ריכוזים ויחסים של פלסמיד בעת שימוש במספר וקטורים של ביטוי פלסמיד, בחירת שומנים ותוספת אדג'ובנטית לייצור ברמה גבוהה של חלקיקי ננו-ליפופרוטאין מנוסחים. השיטה מודגמת כאן עם ביטוי של חלבון קרום חיצוני גדול כלמידיאלי (MOMP), אך ניתן ליישם אותה באופן נרחב על אנטיגנים אחרים של חלבון הממברנה. ניתן להעריך את יעילות האנטיגן in vivo באמצעות מחקרי חיסון למדידת ייצור נוגדנים, כפי שהוכח כאן.

פרופיל SDS-PAGE של טיהור זיקה Ni של MOMP-tNLP מתגובה נטולת תאים של 1 מ"ל מוצג באיור 1B. התגובה הביאה לרמות ביטוי גבוהות הן עבור MOMP והן עבור חלבון Δ49ApoA1. תוצאות קודמות הראו כי הביטוי החופשי של Δ49ApoA1 בנוכחות DMPC וטלודנדרימר הביא להיווצרות חלקיקי ננו-ליפופרוטאין של טלודנדרימר (tNLPs)4. שיתוף הפעולה של MOMP עם Δ49ApoA1 הצביע על כך ש-MOMP משויך ל-tNLPs, מכיוון שהתג His-tag קיים רק על פיגום ה-tNLP Δ49ApoA1 ולא על MOMP. MOMP הוא חלבון בלתי מסיס מאוד שניתן לדלל רק באמצעות קומפלקס עם tNLPs, אשר הוכחו כמסייעים למסיסות של חלבוני ממברנה.
שברי האלוציה המכילים MOMP-tNLPs אוגמו וריכוז החלבון הכולל נקבע באמצעות מכשיר כימות מבוסס פלואורסצנטיות, או מכשיר המודד ריכוז באמצעות ספיגה ב-280 ננומטר, בהתאם להוראות היצרן לכימות חלבונים. כדי לאפשר מינון מדויק של חיסון MOMP, חשוב גם לקבוע את ריכוז MOMP בקומפלקסים מטוהרים. פיתחנו שיטה לכימות MOMP המבוססת על דנסיטומטריית ג'ל (איור 2), שבה MOMP רקומביננטי מטוהר עם ריכוז ידוע שימש כסטנדרט. על ידי קביעת העקומה הסטנדרטית והשוואתה למדגם MOMP-tNLP, ניתן לכמת את ריכוז MOMP במדויק. קביעת ריכוז MOMP במדגם המטוהר אפשרה להעריך את תפוקת MOMP בתגובות נטולות תאים בקני מידה שונים, דבר חשוב לתכנון מערך התגובה המתאים למחקרים במורד הזרם (טבלה 3).
MOMP צריך ליצור אוליגומרים כדי לעורר תגובה חיסונית חזקה11. כדי לבחון את המצב האוליגומרי של MOMP, MOMP-tNLP נותח בנוכחות ובהיעדר חום וחומר מחזר dithiothreitol (DTT, 50 mM, איור 3A). אוליגומרים מסדר גבוה יותר של MOMP זוהו באמצעות SDS-PAGE כאשר הדגימות לא טופלו בחום וב-DTT. לשם השוואה, דגימות שטופלו בחום בנוכחות DTT הראו בעיקר שני פסים נפרדים על הג'ל, המתאימים ל-MOMP ול-Δ49ApoA1 (כ-40 kDa ו-22 kDa, בהתאמה). תוצאות אלה דומות מאוד לדפוס פסי הג'ל המיוחס להיווצרות אוליגומרים של MOMP, שהוא קריטי ליעילותו.
ניתוח כתמים מערבי נוסף באמצעות MAb40, נוגדן כנגד האפיטופ הליניארי בתחום המשתנה של חלבון MOMP, הראה דפוס פסים דומה, המאשר את היווצרות האוליגומרים על-ידי חלבון MOMP במצבו הלא-מפורק (איור 3B). גורם חשוב המשפיע על היווצרות אוליגומרים של MOMP הוא היחס בין פלסמיד MOMP לבין פלסמיד Δ49ApoA1 במהלך מערך התגובה נטולת התא. טבלה 4 מפרטת את היחס בין פלסמידים לבין קצב ההחדרה של MOMP ל-tNLPs. מחקרים קודמים הצביעו על כך ש-MOMP כלמידיאלי וחלבוני ממברנה חיצוניים אחרים עשויים להתקיים בעיקר כטרימרים12. כדי למקסם את היווצרות הטרימר בתגובה נטולת תאים, רצוי שקצב ההחדרה יהיה קרוב לשלושה חלבוני MOMP לכל NLP, המתאים ליחס פלסמיד ~25:1 MOMP-to-Δ49ApoA1.
בדיקת כתם נקודה שימשה כשיטה יעילה יותר לזיהוי נוכחות של MOMP ו- tNLP. הנוגדן MAb40 שימש לזיהוי MOMP כולל. נוגדן MAbHIS הממוקד לתג His-tag על פיגום Δ49ApoA1 של tNLP שימש להערכת נוכחות tNLP. האיתות המשותף של נוגדני MAb40 ו-MAbHIS הצביע על היווצרות MOMP-tNLP. תגובת הבקרה יצרה tNLP ריק, שהראה רק אות חיובי מ-MAbHIS (איור 3C). כדי לבדוק את האימונוגניות של MOMP-tNLPs המיוצרים בתגובה נטולת תאים, אספנו MOMP-tNLP עם CpG + FSL-1 והזרקנו תוך שרירית (i.m.) לעכברים במשטר דחיפה ראשוני כמתואר לעיל. סרה נאסף מהעכברים המחוסנים, ונוגדן IgG ספציפי ל-MOMP נמדד באמצעות בדיקת כתם מערבי (איור 4). הסרה מעכברים שהוזרקו להם MOMP-tNLP אדג'ובנטי הראתה קשירת MOMP חזקה, מה שמצביע על כך ש-MOMP-tNLP יכול לעורר תגובה חיסונית in vivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig01.jpg"> איור 1: ביטוי וטיהור של MOMP-tNLP. (A) תמונה של צינורות המכילים אליציטוטים קטנים של תגובה נטולת תאים שביטאה בהצלחה פקדי GFP המוארים תחת מקור אור UV (מימין) בהשוואה לליזטים ללא פלסמיד GFP (משמאל). (B) ג'ל חלבון המוכתם ב-SYPRO Ruby לאחר SDS-PAGE מציג את פרופיל הטיהור של MOMP-tNLP. MOMP נודד ב- 40 kDa ו- 49ApoA1 נודד ב- 22 kDa. קיצורים: MOMP = חלבון קרום חיצוני גדול chlamydial; tNLP = חלקיק ננוליפופרוטאין טלודנדרימר; MOMP-tNLP = קומפלקס MOMP-tNLP; GFP = פלסמיד מקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק; MW = סמן משקל מולקולרי; T = סך הכל ליזט ללא תאים; FT = זרימה; R1-R3 = aliquots תגובה ללא תאים; W1, W6 = כביסה 1 ו 6; E1-E7 = אלוציות 1 עד 7; Δ49ApoA1 = נגזרת ApoA1 של העכבר המתויג שלו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig02.jpg"> איור 2: כימות MOMP בדגימות MOMP-tNLP . (A) ג'ל SDS-PAGE מוכתם ברובי SYPRO לכימות MOMP. MOMP רקומביננטי עם ריכוז ידוע הועמס על הג'ל כדי לקבל את העקומה הסטנדרטית. כל נתיב הכיל 0.1 מיקרוגרם, 0.5 מיקרוגרם, 1.0 מיקרוגרם, 2.0 מיקרוגרם ו-4.0 מיקרוגרם MOMP. דגימות MOMP-tNLP שכומתו הועמסו על אותו ג'ל. (B) עקומת תקן ריכוז MOMP נוצרה באמצעות צפיפות. נקבעה משוואה המתייחסת לצפיפות הפסים המנורמלת ולכמות MOMP. המשוואה שימשה לחישוב תוכן MOMP בדגימות הלא ידועות. קיצורים: MOMP = חלבון קרום חיצוני גדול chlamydial; tNLP = חלקיק ננוליפופרוטאין טלודנדרימר; MOMP-tNLP = קומפלקס MOMP-tNLP; SDS-PAGE = נתרן דודצילסולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig03.jpg"> איור 3: MOMP-tNLP המיוצר ללא תאים מאפשר ל-MOMP ליצור מבנים מסדר גבוה יותר. (A) ג'ל SDS-PAGE של MOMP-tNLP עם וללא טיפול בחום ובחומר מחזר DTT, מוכתם ב-SYPRO Ruby. עם חום ו-DTT, MOMP הופיע בעיקר כרצועת מונומרים ב~40 kDa, מכיוון שהחום והחומר המחזר שברו את רוב מבנה ה-MOMP מסדר גבוה יותר. בהיעדר חום ו-DTT, היו להקות מסדר גבוה יותר, מה שמצביע על קונפורמציה של אוליגומרים MOMP. (B) כתם מערבי של MOMP-tNLP ו-MOMP בלבד, ללא טיפול וטיפול בחום וב-DTT. לאחר ההעברה, הממברנה נבדקה עם MAb40 (דילול 1:1,000). נצפתה תבנית פסים הדומה לג'ל המוכתם SYPRO Ruby, שאישרה כי הפסים בעלי המשקל המולקולרי הגבוה יותר היו אכן אוליגומרים מסוג MOMP. (C) כתם נקודה של MOMP-tNLP ודגימות tNLP ריקות (כפולות) שנבדקו עם MAb40 ו-MAbHIS. קיצורים: MOMP = חלבון קרום חיצוני גדול chlamydial; tNLP = חלקיק ננוליפופרוטאין טלודנדרימר; MOMP-tNLP = קומפלקס MOMP-tNLP; SDS-PAGE = נתרן דודצילסולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה; DTT = dithiothreitol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig04.jpg"> איור 4: MOMP-tNLP המיוצר ללא תאים הוא אימונוגני מאוד. סרום מעכברים מחוסנים הראה אות נוגד MOMP IgG חזק. MOMP-tNLP אדג'ובנט עם CpG + FSL-1 שימש לחיסון עכברים. סרה משישה עכברים מחוסנים נאספו, אוגמו ושימשו לבדיקת MOMP-tNLP. הסרום הצליח להיקשר ל-MOMP בבדיקת כתם מערבית והראה אות IgG חזק (משמאל). הכתם המערבי שהשתמש ב-MAb40 כנוגדן ראשוני (מימין) הראה פסים דומים, מה שמצביע על כך שהסרום הכיל IgG ספציפי ל-MOMP. קיצורים: MOMP = חלבון קרום חיצוני גדול chlamydial; tNLP = חלקיק ננוליפופרוטאין טלודנדרימר; MOMP-tNLP = קומפלקס MOMP-tNLP; CpG = אדג'ובנט CpG מהונדס כולסטרול; FSL-1 = אדג'ובנט ליפופילי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>שם מאגר</td>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>אימידזול</td>
			<td>pH</td>
		</tr><tr><td>מאגר מחייב</td>
			<td>50 מ"מ</td>
			<td>300 מ"מ</td>
			<td>10 מ"מ</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>חיץ כביסה</td>
			<td>50 מ"מ</td>
			<td>300 מ"מ</td>
			<td>20 מ"מ</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Elution Buffer 1</td>
			<td>50 מ"מ</td>
			<td>300 מ"מ</td>
			<td>250 מ"מ</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Elution Buffer 2</td>
			<td>50 מ"מ</td>
			<td>300 מ"מ</td>
			<td>500 מ"מ</td>
			<td>8.0</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: רשימת מאגרים הדרושים לטיהור זיקה לניקל המפרטת ריכוזים של כל רכיב ו- pH.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>זמן ריצה</td>
			<td>50 דק'</td>
		</tr><tr><td>קצב זרימה</td>
			<td>6.0 מ"ל/דקה</td>
		</tr><tr><td>סוג מעבר צבע</td>
			<td>בינארי</td>
		</tr><tr><td>חיץ א'</td>
			<td>10 מ"מ TEAA ב H20</td>
		</tr><tr><td>חיץ B</td>
			<td>MeCN</td>
		</tr><tr><td>הדרגתי</td>
			<td>% חיץ B</td>
		</tr><tr><td>0 דקות</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>30 דק'</td>
			<td>60%</td>
		</tr><tr><td>30.5 דק'</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>40 דק'</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>40.5 דק'</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>50 דק'</td>
			<td>25%</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: תנאים לטיהור HPLC שלב הפוך של CpG מהונדס כולסטרול. קיצורים: TEAA = triethylammonium אצטט; MeCN = אצטוניטריל.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ליזט ללא תאים (מ"ל)</td>
			<td>DMPC שומנים (מ"ג)</td>
			<td>טלודנדרימר (מ"ג)</td>
			<td>פלסמיד MOMP (מיקרוגרם)</td>
			<td>תפוקת MOMP מטוהרת (מ"ג)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>0.4</td>
			<td>15</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>8</td>
			<td>0.8</td>
			<td>30</td>
			<td>1.1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>12</td>
			<td>1.2</td>
			<td>45</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>75</td>
			<td>2.7</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 3: כמות השומנים, הטלודנדרימרים והפלסמידים המשמשים לתגובות נטולות תאים בקנה מידה שונה והתשואות המתאימות. קיצורים: MOMP = חלבון קרום חיצוני גדול chlamydial; DMPC = 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">יחסים של קלט פלסמיד, MOMP : Δ49ApoA1</td>
			<td>1:1</td>
			<td>5:1</td>
			<td>10:1</td>
			<td>25:1</td>
			<td>50:1</td>
			<td>100:1</td>
		</tr><tr><td colspan="2">יחסי כמות החלבון המיוצר, MOMP : Δ49ApoA1</td>
			<td>0.02</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.64</td>
			<td>3.46</td>
			<td>6.55</td>
			<td>20.04</td>
		</tr><tr><td colspan="2">מספר משוער של הכנסת MOMP לכל tNLP</td>
			<td>0.03</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.75</td>
			<td>4.04</td>
			<td>7.65</td>
			<td>23.39</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 4: יחסי הפלסמיד בתגובה נטולת תאים וקצבי החדרת MOMP כתוצאה מכך. קיצורים: MOMP = חלבון קרום חיצוני גדול chlamydial; tNLP = חלקיק ננוליפופרוטאין טלודנדרימר; Δ49ApoA1 = נגזרת ApoA1 של העכבר המתויג שלו.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development at JoVE.com

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

פרוטוקול זה מתאר שימוש בערכות ביטוי מסחריות של חלבונים נטולי תאים כדי לייצר חלבוני ממברנה הנתמכים בננו-דיסק שיכולים לשמש כאנטיגנים בחיסונים תת-יחידתיים.

ייצור בקנה מידה ללא תאים ותוספת אדג'ובנטית לחלבון קרום חיצוני עיקרי רקומביננטי מכלמידיה מורידרום לפיתוח חיסונים

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard ...

אנטיגנים רבים של תת-יחידות חיסון מועמדים הם חלבוני ממברנה. מבחינה היסטורית, היה קשה לייצר ולטהר אותם בכמויות מספיקות. בעזרת טכניקה זו, אנו מסוגלים ליצור אנטיגנים בעלי עניין המוטמעים בתוך קרום השומנים כדי להבטיח אישור דמוי יליד.תהליך זה גם מקל על ניסוח עם adjuvants של עניין. ביטוי ללא תאים מאפשר ייצור מהיר של חלבונים בעלי עניין במבנה חסר התגים הטבעי שלהם. טכניקה זו ניתנת להרחבה ואנו כבר עובדים עם חברות מסחריות לפיתוח פורמולציות חיסונים באמצעות תהליך זה.אנו מדגימים כאן את התהליך עבור אנטיגן כלמידיה, אך ניתן להתאים את התהליך בקלות לייצור אנטיגנים מעניינים ללא קשר אם הם חלבוני ממברנה או לא. תהליך זה עשוי להיות ישים הן לפיתוח פתוגן והן לפיתוח חיסון לסרטן. כדי להתחיל, הכינו MOMP-tNLPs על ידי שימוש בשיטה ללא תאים.הפשיר את מאגר ההרכבה מחדש של ערכת ביטוי החלבון ללא תאים שעתיים לפני הגדרת התגובה והוסף מעכב פרוטאז ללא EDTA לחיץ. השתמש בערכה המיועדת להריץ חמש תגובות של מיליליטר. עבור כל תגובה של מיליליטר אחד, הוסף 525 מיקרוליטר של חיץ הרכבה מחדש לבקבוק E.coli lysate וגלגל אותו להתמוססות.יש להוסיף 250 מיקרוליטר של חיץ ההרכבה מחדש לבקבוק התגובה המכיל את התוסף ולהמיס על ידי גלגול. לאחר מכן, הוסף 8.1 מיליליטר של חיץ reconstitution לבקבוק הזנת התגובה וגלגל אותו להתמוססות. לבקבוק של תערובת חומצות אמינו, הוסיפו שלושה מיליליטר של חיץ להרכבה מחדש כדי להמיס אותו.לבקבוק נוסף של מתיונין, הוסיפו 1.8 מיליליטר של חיץ הרכבה מחדש, המסו אותו ואחסנו אותו על קרח. הוסף 225 מיקרוליטר של תערובת משוחזרת, 270 מיקרוליטר של תערובת חומצות אמינו משוחזרת ללא מתיונין, ו -30 מיקרוליטר של מתיונין משוחזר לבקבוק E.coli lysate. יתר על כן, להוסיף 400 מיקרוליטר של תערובת DMPC / telodendrimer 15 מיקרוגרם של פלסמיד MOMP, ו 0.6 מיקרוגרם של delta-49ApoA1 לתערובת ולערבב אותו.Aliquot 20 מיקרוליטר של הפתרון הכולל בצינור 1.5 מיליליטר עבור תגובת בקרה המבטאת GFP. הכינו תמיסת הזנה על ידי הוספת 2.65 מיליליטר של תערובת חומצות אמינו משוחזרת ללא מתיונין ו -300 מיקרוליטר של מתיונין משוחזר. מעבירים מיליליטר אחד מתמיסת התגובה לתא התגובה הפנימי בערכת התגובה ללא תאים ואוטמים אותו.מלא את החדר החיצוני של כלי התגובה עם 10 מיליליטר של פתרון הזנה ולסגור אותו. הוסף 0.5 מיקרוליטר של פלסמיד בקרת GFP לאליציטוטים של 20 מיקרוליטר של תערובת התגובה. שים את התגובה בשייקר ב 300 סיבובים לדקה במשך 18 שעות ב 30 מעלות צלזיוס.עקוב אחר התגובה תחת אור UV לאחר 15 דקות עבור פלואורסצנטיות עקב סינתזת GFP. לטהר את קומפלקס הננו-חלקיקים MOMP-tNLP מתערובת התגובה נטולת התאים על ידי כרומטוגרפיית זיקה לניקל משותק באמצעות תג HIS-על חלבון delta-49ApoA1. העבירו מיליליטר אחד מה-50% של שרף הטיהור HIS-tag לעמודת כרומטוגרפיה חד-פעמית של 10 מיליליטר, והוסיפו שלושה מיליליטר של חיץ קשירה לאיזון.לאחר מכן, נקזו את החיץ והוסיפו 250 מיקרוליטר של חיץ קשירה לשרף. חלץ 20 מיקרוליטר של תערובת התגובה ללא תאים לניתוח SDS-PAGE. מוסיפים את תערובת התגובה נטולת התאים הנותרת עם השרף המאוזן ודגרים על נדנדה במעבדה למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.הסר את מכסה העמוד ושטוף אותו עם 500 מיקרוליטר של חיץ קשירה. הוסף את נוזל הכביסה לעמודה ואסוף את הזרימה לצורך ניתוח SDS-PAGE. לשטוף את העמוד עם מיליליטר אחד של חיץ לשטוף עם imidazole 20 מילימולרי שש פעמים ולאסוף את השברים.בזמן הכביסה בפעם השנייה, להשתמש פיפטה של מיליליטר אחד כדי לעורר את השרף. הצדיעו ל-MOMP-tNLPs בשישה שברים של 300 מיקרוליטר של חיץ אלוציה I המכיל אימידזול של 250 מילימולר ואלוטיון סופי עם 300 מיקרוליטר של חיץ אלוציה II המכיל אימידזול של 500 מילימולרי. על ההדבקה השנייה, להתסיס במרץ את השרף על ידי pipeting למעלה ולמטה באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד.השתמש במצלמת ג'ל כדי לצלם את התמונות במהירות של 600 ננומטר. לאחר מכן, כמת את כמות החלבונים השונים בננו-חלקיקים באמצעות ניתוח SDS-PAGE באמצעות תקן חלבון. צייר עקומה סטנדרטית באמצעות הצפיפויות של רצועות MOMP.לאחר מכן, קבע את רכיב MOMP של ננו-חלקיקים עם התקן. פתרו את הדגימות באמצעות SDS-PAGE והעבירו את ערימות הג'ל באמצעות מערכת מסחרית לניקוי יבש לניתוח כתמים מערביים. הסר את הכתמים מהערימה ודגר עליהם למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס במאגר חוסם המכיל 0.2% TWEEN 20 ו- 0.5 מיקרוגרם למיליליטר MAb40, או 0.2 מיקרוגרם למיליליטר MAbHIS נוגדן antiHIS-tag המכוון נגד תג HIS מחלבון delta-49ApoA1.שטפו כל כתם עם PBST שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל כביסה. לדגור את הכתמים במשך שעה אחת במאגר חוסם המכיל נוגדן משני מצומד לפלואורופור בדילול של 1:10, 000. חזור על השטיפות עם PBST וצלם את התמונה באמצעות מכונת צילום פלואורסצנטית לאחר השטיפה הסופית.באמצעות מנגנון כתם נקודה, כתם שלושה מיקרוגרם של MOMP-tNLP ו tNLP ריק. לפתח ולחסום את הכתמים באותה שיטה עבור כתמים מערביים. מקפיאים את התמיסה המעורבת על קרח יבש והופכים אותה למשך הלילה לליופיליזר.אחסנו את הפורמולות המיובשות בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס. בעת הצורך, הרכיבו מחדש את ה-tNLPs שעברו ליופיליזציה במים נטולי אנדוטוקסין וגלגלו אותם כדי להתמוסס ולהתייבש. דיאליזה את התמיסה עם PBS ולהסיר את הטרהלוז עם קרום דיאליזה בחיתוך 3.5 קילודלטון.צנטריפוגה את תמיסת הננו-חלקיקים ברכז ואקום לפני הוספת האדג'ובנט. נטרו את נפח הדגימה לאחר 20 עד 30 דקות כדי למנוע ייבוש מלא. בארון בטיחות ביולוגית, הוסיפו את האדג'ובנט בתנאים סטריליים.באמצעות כרומטוגרפיה אנליטית של אי הכללת גודל, לנתח את הניסוח לשילוב מוצלח. אחסנו את MOMP-tNLPs האדג'ובנטיים ורוקנו tNLP בארבע מעלות צלזיוס למשך עד 14 יום. לנתח את היציבות של ניסוח tNLP עם כרומטוגרפיה אי הכללת גודל.ניתוח SDS-PAGE של MOMP-tNLP בוצע באמצעות כרומטוגרפיית זיקה לניקל, אשר הראתה כי לתערובת התגובה ללא תאים יש רמות גבוהות של ביטוי הן עבור MOMP והן עבור חלבוני delta-49ApoA1. על ידי שימוש בצפיפות ג'ל, ריכוז MOMP כומת באמצעות MOMP רקומביננטי מטוהר עם ריכוז ידוע כסטנדרט. כדי לקבוע את היווצרות האוליגומרים, SDS-PAGE MOMP ו-MOMP-tNLP טופלו בחום וב-DTT, שהראו רצועות נפרדות עבור MOMP ו-delta-49ApoA1.ניתוח כתמים מערביים באמצעות נוגדן MAb40 הופעל כנגד חלבון MOMP, אשר חשף דפוס פסים המאשר את היווצרות האוליגומרים על ידי חלבון MOMP במצבו הלא מפורק . בדיקת כתם נקודה בוצעה בנוכחות נוגדנים MAb40 ו- MAbHIS, שהצביעו על היווצרות MOMP-tNLP. עם זאת, tNLP ריק הראה איתות חיובי עבור MAbHIS.Sera מהעכברים המחוסנים שקיבלו הזרקת MOMP-tNLP אדג'ובנטי הדגימה קשירת MOMP חזקה והצביעה על כך ש-MOMP-tNLP יכול לעורר תגובה חיסונית. מכיוון שפרוטוקול זה מייצר חלבון מ- DNA, חיוני להימנע מזיהום התגובה עם DNase, RNase, כמו גם את ה- DNA וה- RNA החיצוניים. כל החומרים או הריאגנטים המשמשים בתגובות צריכים להיות חופשיים מסוג זה של מולקולות.לאחר ביטוי, טיהור והוספה של אדג'ובנטים, מועמדים אלה לחיסון יכולים להיות מוערכים במודלים מתאימים של בעלי חיים עבור הפתוגנים המעניינים כדי להעריך סמני הפעלה חיסונית או להעריך הגנה במהלך אתגר. עבור כלמידיה, חלבון הממברנה החיצונית העיקרי, או MOMP, נחשב לאנטיגן מועמד מוביל לחיסונים תת-יחידות במשך שנים רבות, אך היה קשה לייצר אותו בהיקפים הדרושים ליישום החיסון. ביטוי משותף ללא תאים של חלבון ממברנה זה הוא דרך מעשית להתחיל להניע חלבון זה לקראת הערכה במודלים של בעלי חיים כגון עכברים, ובסופו של דבר לעבור לניסויים בבני אדם.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

רקומביננטי הפקה זיהום retroviral של תאים B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

ייצור Titering של Adeno הקשורים ווקטורים רקומביננטי ויראלי

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

ספירה של אוכלוסיות גדולות דם היקפיות יקוציט לניסויי multicenter קליניים באמצעות Assay phenotyping דם מלא

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

גישות גנטיות בקדימה<em&gt; כלמידיה trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

דור של Arenavirus רקומביננטי לפיתוח חיסון בתאי Vero-FDA

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques