Name: cell-free scaled production and adjuvant addition to a recombinant major outer membrane protein from chlamydia muridarum for vaccine development
Uploaded: 2022-03-16T12:30:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development at JoVE.com

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी एंड इन्फेक्शियस डिजीज से सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा अनुदान आर 21 AI20925 और यू 19 AI144184 द्वारा समर्थित किया गया था। यह काम अमेरिकी ऊर्जा विभाग के तत्वावधान में लॉरेंस लिवरमोर नेशनल लेबोरेटरी द्वारा अनुबंध डीई-एसी 52-07एनए27344 [एलएलएनएल-जेआरएनएल-822525, एलएलएनएल-वीडियो-832788] के तहत किया गया था।

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	<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li><li>Coleman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+association+of+the+Yersinia+pestis+translocon+proteins,+YopB+and+YopD,+are+facilitated+by+nanolipoprotein+particles.">Expression and association of the Yersinia pestis translocon proteins, YopB and YopD, are facilitated by nanolipoprotein particles.</a> PLoS One. 11 (3), 0150166 (2016).</li><li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein,+forming+soluble+nanolipoprotein+particles.">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+diameter,+monodispersity,+and+solubility+of+ApoA1+nanolipoprotein+particles+using+telodendrimer+chemistry.">Controlling the diameter, monodispersity, and solubility of ApoA1 nanolipoprotein particles using telodendrimer chemistry.</a> Protein Science. 22 (8), 1078-1086 (2013).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+production+of+a+functional+oligomeric+form+of+a+Chlamydia+major+outer-membrane+protein+(MOMP)+for+vaccine+development.">Cell-free production of a functional oligomeric form of a Chlamydia major outer-membrane protein (MOMP) for vaccine development.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 15121-15132 (2017).</li><li>Tifrea, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protection+in+mice+against+a+Chlamydia+muridarum+respiratory+challenge+by+a+vaccine+formulated+with+the+major+outer+membrane+protein+in+nanolipoprotein+particles.">Induction of protection in mice against a Chlamydia muridarum respiratory challenge by a vaccine formulated with the major outer membrane protein in nanolipoprotein particles.</a> Vaccines. 9 (7), 755 (2021).</li><li>Cleveland, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+X-ray+and+neutron+scattering+demonstrates+that+cell-free+expression+produces+properly+formed+disc-shaped+nanolipoprotein+particles.">Small-angle X-ray and neutron scattering demonstrates that cell-free expression produces properly formed disc-shaped nanolipoprotein particles.</a> Protein Science. 27 (3), 780-789 (2018).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+to+nickel-chelating+nanolipoprotein+particles+increases+the+potency+and+efficacy+of+subunit+vaccines+to+prevent+West+Nile+encephalitis.">Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (6), 1018-1022 (2010).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalized+delivery+of+adjuvant+and+antigen+using+nanolipoprotein+particles+enhances+the+immune+response+to+recombinant+antigens.">Colocalized delivery of adjuvant and antigen using nanolipoprotein particles enhances the immune response to recombinant antigens.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (6), 2044-2047 (2013).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanolipoprotein+particles+(NLPs)+as+an+in+vivo+delivery+platform.">Evaluation of nanolipoprotein particles (NLPs) as an in vivo delivery platform.</a> PLoS One. 9 (3), 93342 (2014).</li><li>Pal, S., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+the+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein+can+elicit+an+immune+response+as+protective+as+that+resulting+from+inoculation+with+live+bacteria.">Vaccination with the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein can elicit an immune response as protective as that resulting from inoculation with live bacteria.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8153-8160 (2005).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+major+outer+membrane+protein+of+Chlamydia+trachomatis.">Structural and functional analyses of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 189 (17), 6222-6235 (2007).</li><li>Hafner, L. M., Wilson, D. P., Timms, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+status+and+future+prospects+for+a+vaccine+against+Chlamydia+trachomatis+infection.">Development status and future prospects for a vaccine against Chlamydia trachomatis infection.</a> Vaccine. 32 (14), 1563-1571 (2014).</li><li>Findlay, H. E., McClafferty, H., Ashley, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression,+single-channel+analysis+and+membrane+topology+of+recombinant+Chlamydia+trachomatis+Major+Outer+Membrane+Protein.">Surface expression, single-channel analysis and membrane topology of recombinant Chlamydia trachomatis Major Outer Membrane Protein.</a> BMC Microbiology. 5, 5 (2005).</li><li>Sun, G., Pal, S., Weiland, J., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+an+intranasal+challenge+by+vaccines+formulated+with+native+and+recombinant+preparations+of+the+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein.">Protection against an intranasal challenge by vaccines formulated with native and recombinant preparations of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein.</a> Vaccine. 27 (36), 5020-5025 (2009).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+of+functional+receptor+tyrosine+kinases.">Cell-free expression of functional receptor tyrosine kinases.</a> Scientific Reports. 5 (1), 12896 (2015).</li></ol>

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई ज्ञात प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या व्यक्तिगत संबंध नहीं हैं जो इस पेपर में रिपोर्ट किए गए काम को प्रभावित कर सकते थे।

क्लैमाइडिया सबसे आम यौन संचारित संक्रमण है जो पुरुषों और महिलाओं दोनों को प्रभावित करता है। हालांकि क्लैमाइडिया पर वैक्सीन अनुसंधान दशकों तक फैला हुआ है, लेकिन एक सुरक्षित और प्रभावी टीका जिसे बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए बढ़ाया जा सकताहै, अभी भी अज्ञात है। क्लैमाइडिया एमओएमपी को सुरक्षात्मक वैक्सीन एंटीजन के रूप में प्रमुख उम्मीदवार माना जाता है; हालांकि, एमओएमपी अत्यधिक हाइड्रोफोबिक है और गलत फोल्डिंग14,15 के लिए प्रवण है। आगे के अध्ययन से पता चला है कि एमओएमपी ओलिगोमेरिक राज्यों में मौजूद है जो इसकी इम्युनोजेनेसिटी11 के लिए आवश्यक हैं। यहां विस्तृत एक मान्य, सेल-मुक्त सह-अभिव्यक्ति विधि है जो टीएनएलपी नैनोपार्टिकल के भीतर एक वैक्सीन के रूप में गठित ऑलिगोमेरिक एमओएमपी का उत्पादन करती है, जिसमें प्रति 3 एमएल लाइसेट में लगभग 1.5 मिलीग्राम शुद्ध एमओएमपी की पैदावार होती है। इस पूरी तरह से संगठित प्रक्रिया को औद्योगिक उत्पादन के लिए और बढ़ाया जा सकता है, जिससे टीकों के उत्पादन के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण के रूप में इसकी संभावनाएं बढ़ सकती हैं।
हमने पहले एनएलपी 3,16 के भीतर एम्बेडेड झिल्ली प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए सेल-मुक्त अभिव्यक्ति का उपयोग करने के साथ-साथ टेलोडेंड्रिमर-स्थिर डिस्क में अभिव्यक्ति पर प्रकाशित किया है। हालांकि, इस बाद की तकनीक ने अधिक विषमता और कम घुलनशीलता के साथ झिल्ली-प्रोटीन कणों का उत्पादन किया। इसके अतिरिक्त, एमओएमपी-टेलोडेंड्रिमर कणों की इम्युनोजेनेसिटी एमओएमपी-टीएनएलपीकणों की तुलना में स्पष्ट नहीं है।
इस प्रक्रिया को बैक्टीरियल मेम्ब्रेन प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो सबयूनिट टीकों में उपयोग के लिए एंटीजन के रूप में आशाजनक उम्मीदवार हैं। न केवल यह प्रक्रिया घुलनशील जीवाणु झिल्ली प्रोटीन का उत्पादन करती है, बल्कि समग्र नैनोपार्टिकल संरचना विभिन्न प्रकार के लिपोफिलिक वैक्सीन सहायक दवाओं का उपयोग करके आगे संशोधन के लिए उत्तरदायी है, जिसमें कोलेस्ट्रॉल मोइटी या एफएसएल -1 के लिए संयुग्मित सीपीजी शामिल है, लेकिन सीमित नहीं है। बैक्टीरिया से अन्य उम्मीदवार एंटीजन की अभिव्यक्ति संभव है, हालांकि इष्टतम पैदावार प्राप्त करने के लिए अभिव्यक्ति तापमान, लिपिड पसंद और अभिव्यक्ति प्रणाली के प्रकार जैसे मापदंडों का पता लगाने की आवश्यकता हो सकती है।
इसके अतिरिक्त, इस प्रक्रिया में प्लास्मिड विकल्प और अनुपात महत्वपूर्ण हैं। उपयोग किए जाने वाले दोनों प्लास्मिड का निर्माण एक ही रीढ़ की हड्डी से किया जाना चाहिए। यदि आवेषण लगभग समान लंबाई के हैं, तो अनुपात प्लास्मिड के द्रव्यमान पर आधारित हो सकते हैं, जैसा कि यहां वर्णित है। हालांकि, मोल्स पर आधारित अनुपात अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देगा, खासकर जब प्रतिक्रियाओं को स्केल किया जाता है। स्क्रीन-स्केल प्रतिक्रियाओं (< 0.5 एमएल) में अच्छी तरह से काम करने वाले अनुपात बड़ी प्रतिक्रियाओं पर लागू नहीं हो सकते हैं और अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। गैर-झिल्ली प्रोटीन को अभी भी सेल-मुक्त किट का उपयोग करके व्यक्त किया जा सकता है, लेकिन घुलनशील उत्पाद का उत्पादन करने के लिए लिपिड नैनोपार्टिकल (सह-अभिव्यक्ति) की आवश्यकता नहीं हो सकती है। इसके अतिरिक्त, जबकि यह प्रोटोकॉल सीपीजी और एफएसएल -1 के साथ सहायक होने का वर्णन करता है, यह प्रणाली अन्य लिपोफिलिक सहायक दवाओं के साथ निर्माण या इच्छानुसार घुलनशील सहायक दवाओं के साथ मिश्रण करने के लिए उपयुक्त है।
सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया स्थापित करते समय संदूषण से बचना आवश्यक है क्योंकि यह पैदावार को प्रभावित कर सकता है। प्रतिक्रिया के लिए कोई भी योजक, जिसमें प्लास्मिड भी शामिल हैं, अत्यधिक शुद्ध होना चाहिए। इसके अतिरिक्त, व्यक्त प्रोटीन केवल उन सामग्रियों और समाधानों के संपर्क में होना चाहिए जो एंडोटॉक्सिन संदूषण से मुक्त हैं। उम्मीदवार फॉर्मूलेशन में एंडोटॉक्सिन संदूषण इम्यूनोलॉजिकल परख के असंगत और नकली परिणाम पैदा कर सकता है और पर्याप्त मात्रा में हानिकारक हो सकता है। जबकि यहां वर्णित नहीं है, निकल आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के बाद अतिरिक्त शुद्धिकरण आवश्यक हो सकता है यदि एसडीएस-पेज के माध्यम से बाद के विश्लेषण चरणों में कई दूषित पदार्थ देखे जाते हैं। यह एसईसी के साथ पूरा किया जा सकता है, हालांकि शर्तों को सूत्रीकरण के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।

प्रोटीन की कोशिका-मुक्त अभिव्यक्ति के लिए प्रोकैरियोटिक या यूकेरियोटिक लाइसेट रुचि के प्रोटीन को संश्लेषित करने के लिए वाणिज्यिक उत्पादों के रूप में आसानी से उपलब्ध हैं (पूर्ण समीक्षा के लिए, देखें 1)। ये अभिव्यक्ति प्रणालियां विभिन्न पैमानों पर उपलब्ध हैं और ई कोलाई, तंबाकू पौधों और स्तनधारी संस्कृतियों सहित विभिन्न जीवों से लाइसेट का उपयोग करती हैं। सेल-मुक्त लाइसेट पारंपरिक पुनः संयोजक प्रोटीन उत्पादन दृष्टिकोण पर कई लाभ प्रदान करते हैं, जिसमें उपयोग में आसानी और मजबूत, तेजी से प्रोटीन उत्पादन शामिल है। जबकि इन दृष्टिकोणों का उपयोग मुख्य रूप से घुलनशील प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए किया जाता है, इस समूह ने झिल्ली प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए उनके उपयोग के लिए एक दृष्टिकोण का बीड़ा उठाया है।
यह नया दृष्टिकोण अभिव्यक्ति के लिए दो प्रोटीन उत्पादों, एक एपोलिपोप्रोटीन और रुचि के झिल्ली प्रोटीन को डीएनए एन्कोडिंग को शामिल करके मौजूदा सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणालियों में मामूली संशोधन करता है। व्यक्त एपोलिपोप्रोटीन (या तो एपोए 1 या एपोई 4 के डेरिवेटिव) सेल-फ्री लाइसेट में जोड़े गए लिपिड के साथ सहज रूप से (~ 20 एनएम) एनएलपी को इकट्ठा करने के लिए बातचीत करता है। जब रुचि के झिल्ली प्रोटीन के साथ सह-अनुवाद किया जाता है, तो एनएलपी और झिल्ली प्रोटीन एक घुलनशील नैनोपार्टिकल कॉम्प्लेक्स बनाते हैं जिसमें झिल्ली प्रोटीन एनएलपी लिपिड बाइलेयर के भीतर एम्बेडेड होता है। इस प्रकार, झिल्ली प्रोटीन डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए अधिक सुलभ है, क्योंकि यह घुलनशील, असतत कणों के भीतर निहित है। यह दृष्टिकोण एनएलपी बाइलेयर2 के भीतर कार्यात्मक ओलिगोमेरिक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का उत्पादन कर सकता है और एक सबयूनिट वैक्सीन के एंटीजन घटक का उत्पादन कर सकता है, जिसे बाद में लिपोफिलिक एडजुवेंट के साथ मिलाकर एक नैनोपार्टिकल वैक्सीन बनाई जाती है जिसमें सह-स्थानीयकृत एंटीजन और विवो मूल्यांकन के लिए उपयुक्त सहायक होता है।
यह वर्तमान विधि पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल3 से संशोधित किया गया है। प्रमुख संशोधन सेल-मुक्त प्रतिक्रिया के स्केल-अप और प्रोटीन-एनएलपी कॉम्प्लेक्स के बाद के शुद्धिकरण पर केंद्रित हैं। एक और संशोधन में टेलोडेंड्रिमर के रूप में जाना जाने वाला एक एम्फीफिलिक बहुलक शामिल है, जिसे पहले सेल-मुक्त प्रतिक्रिया के अलावा लिपिड के साथ मिलाया जाता है। टेलोडेंड्रिमर और लिपिड की उपस्थिति में प्लास्मिड का सह-अनुवाद एक टेलोडेंड्रिमर एनएलपी (टीएनएलपी) का उत्पादन करता है। टेलोडेंड्रिमर के अलावा परिणामी टीएनएलपीनैनोकणों के आकार और मोनोडिस्प्रेरेबिलिटी को संशोधित करने में भी मदद करता है। यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से एक झिल्ली-बाध्य सबयूनिट एंटीजन प्रोटीन, क्लैमाइडिया एमओएमपी 5,6 का उत्पादन करने के लिए बड़े पैमाने पर वैक्सीन अध्ययन के लिए अनुकूलित है। विधि टीएनएलपी से जुड़े पुनः संयोजक एमओएमपी का उत्पादन करती है ताकि एक अत्यधिक घुलनशील एमओएमपी-टीएनएलपी कॉम्प्लेक्स बनाया जा सके जो एमओएमपी ऑलिगोमेराइजेशन को बरकरार रखता है। एक विशिष्ट 3 एमएल स्केल-अप उत्पादन > 1.5 मिलीग्राम शुद्ध एमओएमपी का उत्पादन करता है। सेल-मुक्त उत्पादित एमओएमपी-टीएनएलपी विवो इम्युनोजेनेसिटी परीक्षण में तेजी से सहायक जोड़ने के लिए उत्तरदायी है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2600028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Trizma hydrochloride solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial, ACS reagent, &#8805;99.7%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer Dam for XCell SureLock</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C24 Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit</td>
			<td>BiotechRabbit</td>
			<td>BR1400201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete His-Tag Purification Resin</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td>5893682001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG-ODN1826</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71508-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe PTS cartridge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9594798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe-PTS Testing System</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl and NaOH solutions for pH adjustment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC with UV-vis diode array detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure culture-grade water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Dry Blotting System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>IB24001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio V2.0 software</td>
			<td>Li-COR Biiosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Fc imager</td>
			<td>Li-COR Biiosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (&#8805;99.9%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP000202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIVEX2.4d vector</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 1000 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 20 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 200 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipettes</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic NaH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200, 5/150 GL column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>GE28-9909-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>&#160;tlrl-fsl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby Protein Gel Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Bench Top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 15 mL conicals (89039-666)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 50 mL conicals (89039-656)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies )</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free scaled production and adjuvant addition to a recombinant major outer membrane protein from chlamydia muridarum for vaccine development

सबयूनिट टीके सुरक्षा, स्थिरता और मानक विनिर्माण में अधिक पारंपरिक निष्क्रिय या क्षीण होल-सेल-व्युत्पन्न टीकों पर लाभ प्रदान करते हैं। एक प्रभावी प्रोटीन-आधारित सबयूनिट वैक्सीन प्राप्त करने के लिए, प्रोटीन एंटीजन को अक्सर देशी जैसी रचना को अपनाने की आवश्यकता होती है। यह रोगज़नक़-सतह एंटीजन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जो झिल्ली-बाध्य प्रोटीन हैं। नैनोलिपोप्रोटीन कणों (एनएलपी) के सह-अनुवाद के माध्यम से सही ढंग से मुड़े हुए कार्यात्मक झिल्ली प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए सेल-मुक्त विधियों का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, जिसे आमतौर पर नैनोडिस्क के रूप में जाना जाता है। 
इस रणनीति का उपयोग लिपिड-बाध्य वातावरण में झिल्ली प्रोटीन से युक्त सबयूनिट टीकों का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, सेल-मुक्त प्रोटीन उत्पादन अक्सर छोटे पैमाने (<1 एमएल) तक सीमित होता है। छोटे पैमाने पर उत्पादन में उत्पादित प्रोटीन की मात्रा आमतौर पर जैव रासायनिक और बायोफिज़िकल अध्ययन के लिए पर्याप्त होती है। हालांकि, पशु मॉडल में वैक्सीन अध्ययन के लिए पर्याप्त प्रोटीन प्राप्त करने के लिए सेल-मुक्त प्रक्रिया को स्केल, अनुकूलित और सावधानीपूर्वक परीक्षण करने की आवश्यकता है। वैक्सीन उत्पादन में शामिल अन्य प्रक्रियाओं, जैसे शुद्धिकरण, सहायक जोड़, और लियोफिलाइजेशन, को समानांतर में अनुकूलित करने की आवश्यकता है। यह पेपर एक झिल्ली-बाध्य प्रोटीन सबयूनिट वैक्सीन को व्यक्त, शुद्ध और तैयार करने के लिए स्केल-अप प्रोटोकॉल के विकास की रिपोर्ट करता है। 
स्केल-अप सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं को तैयार नैनोलिपोप्रोटीन कणों के उच्च-स्तरीय उत्पादन के लिए कई प्लास्मिड अभिव्यक्ति वैक्टर, लिपिड चयन और सहायक जोड़ का उपयोग करते समय प्लास्मिड सांद्रता और अनुपात के अनुकूलन की आवश्यकता होती है। विधि को यहां क्लैमाइडिया प्रमुख बाहरी झिल्ली प्रोटीन (एमओएमपी) की अभिव्यक्ति के साथ प्रदर्शित किया गया है, लेकिन अन्य झिल्ली प्रोटीन एंटीजन पर व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है। एंटीबॉडी उत्पादन को मापने के लिए टीकाकरण अध्ययन के माध्यम से विवो में एंटीजन प्रभावशीलता का मूल्यांकन किया जा सकता है, जैसा कि यहां दिखाया गया है।

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Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

यह प्रोटोकॉल नैनोडिस्क में समर्थित झिल्ली प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए वाणिज्यिक, सेल-मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति किट का उपयोग करने का वर्णन करता है जिसे सबयूनिट टीकों में एंटीजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

वैक्सीन विकास के लिए क्लैमाइडिया मुरिडेरम से एक पुनः संयोजक प्रमुख बाहरी झिल्ली प्रोटीन के लिए सेल-फ्री स्केल्ड उत्पादन और सहायक जोड़

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

पुनः संयोजक रेट्रोवायरल बी कोशिकाओं का उत्पादन और संक्रमण

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

उत्पादन और पुनः संयोजक एडिनो जुड़े वायरल वैक्टर Titering

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

मेजर multicenter चिकित्सीय परीक्षण के लिए परिधीय रक्त ल्युकोसैट आबादी एक पूरे रक्त phenotyping परख का उपयोग कर की गणना

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

में फॉरवर्ड जेनेटिक प्रयास<em&gt; क्लैमाइडिया ट्रैकोमैटिस</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

एफडीए को मंजूरी दी वेरो कोशिकाओं में टीके के विकास के लिए संयोजक arenavirus की पीढ़ी

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

मेजबान सेल शाही सेना संश्लेषण पर वायरल संक्रमण के प्रभाव को मापने के लिए क्लिक करें रसायन विज्ञान का प्रयोग

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

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वेस्ट नील वायरस उत्परिवर्ती तनाव संक्रमण को Myd88 की मध्यस्थता सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के इन विट्रो विश्लेषण में

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

लीजोनेला pneumophila बाहरी झिल्ली Vesicles: अलगाव और मैक्रोफेज पर उनके समर्थक भड़काऊ संभावित का विश्लेषण

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

एक उपंयास फीडर इन विट्रो में Murine प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए मुफ्त प्रणाली

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Simian इम्यूनो वायरस में mRNA और सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति की एकल-कोशिका Quantitation-संक्रमित CD4+ टी कोशिकाओं को रीसस मकाक से पृथक कर

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...