Name: cell-free scaled production and adjuvant addition to a recombinant major outer membrane protein from chlamydia muridarum for vaccine development
Uploaded: 2022-03-16T12:30:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development at JoVE.com

この作業は、国立アレルギー感染症研究所の公衆衛生サービス助成金R21 AI20925およびU19 AI144184によってサポートされました。この作業は、米国エネルギー省の後援の下、ローレンスリバモア国立研究所が契約DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525、LLNL-VIDEO-832788]に基づいて実施しました。

<ol>
	<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li><li>Coleman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+association+of+the+Yersinia+pestis+translocon+proteins,+YopB+and+YopD,+are+facilitated+by+nanolipoprotein+particles.">Expression and association of the Yersinia pestis translocon proteins, YopB and YopD, are facilitated by nanolipoprotein particles.</a> PLoS One. 11 (3), 0150166 (2016).</li><li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein,+forming+soluble+nanolipoprotein+particles.">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+diameter,+monodispersity,+and+solubility+of+ApoA1+nanolipoprotein+particles+using+telodendrimer+chemistry.">Controlling the diameter, monodispersity, and solubility of ApoA1 nanolipoprotein particles using telodendrimer chemistry.</a> Protein Science. 22 (8), 1078-1086 (2013).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+production+of+a+functional+oligomeric+form+of+a+Chlamydia+major+outer-membrane+protein+(MOMP)+for+vaccine+development.">Cell-free production of a functional oligomeric form of a Chlamydia major outer-membrane protein (MOMP) for vaccine development.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 15121-15132 (2017).</li><li>Tifrea, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protection+in+mice+against+a+Chlamydia+muridarum+respiratory+challenge+by+a+vaccine+formulated+with+the+major+outer+membrane+protein+in+nanolipoprotein+particles.">Induction of protection in mice against a Chlamydia muridarum respiratory challenge by a vaccine formulated with the major outer membrane protein in nanolipoprotein particles.</a> Vaccines. 9 (7), 755 (2021).</li><li>Cleveland, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+X-ray+and+neutron+scattering+demonstrates+that+cell-free+expression+produces+properly+formed+disc-shaped+nanolipoprotein+particles.">Small-angle X-ray and neutron scattering demonstrates that cell-free expression produces properly formed disc-shaped nanolipoprotein particles.</a> Protein Science. 27 (3), 780-789 (2018).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+to+nickel-chelating+nanolipoprotein+particles+increases+the+potency+and+efficacy+of+subunit+vaccines+to+prevent+West+Nile+encephalitis.">Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (6), 1018-1022 (2010).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalized+delivery+of+adjuvant+and+antigen+using+nanolipoprotein+particles+enhances+the+immune+response+to+recombinant+antigens.">Colocalized delivery of adjuvant and antigen using nanolipoprotein particles enhances the immune response to recombinant antigens.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (6), 2044-2047 (2013).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanolipoprotein+particles+(NLPs)+as+an+in+vivo+delivery+platform.">Evaluation of nanolipoprotein particles (NLPs) as an in vivo delivery platform.</a> PLoS One. 9 (3), 93342 (2014).</li><li>Pal, S., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+the+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein+can+elicit+an+immune+response+as+protective+as+that+resulting+from+inoculation+with+live+bacteria.">Vaccination with the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein can elicit an immune response as protective as that resulting from inoculation with live bacteria.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8153-8160 (2005).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+major+outer+membrane+protein+of+Chlamydia+trachomatis.">Structural and functional analyses of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 189 (17), 6222-6235 (2007).</li><li>Hafner, L. M., Wilson, D. P., Timms, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+status+and+future+prospects+for+a+vaccine+against+Chlamydia+trachomatis+infection.">Development status and future prospects for a vaccine against Chlamydia trachomatis infection.</a> Vaccine. 32 (14), 1563-1571 (2014).</li><li>Findlay, H. E., McClafferty, H., Ashley, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression,+single-channel+analysis+and+membrane+topology+of+recombinant+Chlamydia+trachomatis+Major+Outer+Membrane+Protein.">Surface expression, single-channel analysis and membrane topology of recombinant Chlamydia trachomatis Major Outer Membrane Protein.</a> BMC Microbiology. 5, 5 (2005).</li><li>Sun, G., Pal, S., Weiland, J., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+an+intranasal+challenge+by+vaccines+formulated+with+native+and+recombinant+preparations+of+the+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein.">Protection against an intranasal challenge by vaccines formulated with native and recombinant preparations of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein.</a> Vaccine. 27 (36), 5020-5025 (2009).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+of+functional+receptor+tyrosine+kinases.">Cell-free expression of functional receptor tyrosine kinases.</a> Scientific Reports. 5 (1), 12896 (2015).</li></ol>

著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えたと思われる可能性のある既知の競合する金銭的利益や個人的な関係はないと宣言しています。

クラミジアは、男性と女性の両方に影響を与える最も一般的な性感染症です。クラミジアのワクチン研究は何十年にもわたっていますが、大量生産に拡張できる安全で効果的なワクチンはとらえどころのないままです13。クラミジアMOMPは、防御ワクチン抗原としての主要な候補と考えられています。ただし、MOMPは非常に疎水性が高く、誤った折り畳みが発生しやすい14,15。さらなる研究により、MOMPはその免疫原性に不可欠なオリゴマー状態に存在することが明らかになりました11。ここでは、tNLPナノ粒子内で形成されたオリゴマーMOMPをワクチンとして生成し、ライセート3 mLあたり約1.5 mgの精製MOMPを生成する、検証済みの無細胞共発現法について詳しく説明しています。この完全に照合された手順は、工業生産のためにさらに拡張することができ、ワクチンを生成するための有用なアプローチとしての見通しを高めます。
我々は以前、無細胞発現を用いてNLP3,16内に埋め込まれた膜タンパク質を産生すること、およびテロデンドリマー安定化ディスクへの発現について発表しています。しかしながら、この後者の技術は、より大きな不均一性およびより低い溶解性を有する膜タンパク質粒子を生成した。4さらに、MOMPテロデンドリマー粒子の免疫原性は、MOMP-tNLP粒子と比較して不明です6。
この手順は、サブユニットワクチンで使用するための抗原として有望な候補である細菌膜タンパク質の発現を拡大するために適用することができます。この手順は、可溶化された細菌膜タンパク質を生成するだけでなく、コレステロール部分またはFSL-1に結合したCpGを含むがこれらに限定されない様々な親油性ワクチンアジュバントを使用して、ナノ粒子構造全体をさらなる修飾に受け入れることができます。細菌由来の他の候補抗原の発現は可能ですが、最適な収量を達成するためには、発現温度、脂質の選択、発現系の種類などのパラメータを探索する必要があるかもしれません。
さらに、このプロセスではプラスミドの選択と比率が重要です。使用する両方のプラスミドは、同じ骨格から構築する必要があります。インサートの長さがほぼ同じ場合、比率は、ここで説明するように、添加されたプラスミドの質量に基づくことができます。ただし、モルに基づく比率は、特に反応をスケーリングする場合に、より再現性のある結果をもたらします。スクリーンスケール反応(< 0.5 mL)でうまく機能する比率は、より大きな反応には適用できない場合があり、追加の最適化が必要になる場合があります。非膜タンパク質は、無細胞キットを使用して発現させることができますが、可溶性生成物を生成するために脂質ナノ粒子(共発現)を必要としない場合があります。さらに、このプロトコルはCpGおよびFSL-1によるアジュバントについて説明していますが、このシステムは、他の親油性アジュバントとの製剤化または所望により可溶性アジュバントとの混合に適しています。
無細胞発現反応を設定する際には、収率に影響を与える可能性があるため、汚染を避けることが不可欠です。プラスミド自体を含む反応への添加物は、高純度でなければなりません。さらに、発現タンパク質は、エンドトキシン汚染のない材料および溶液とのみ接触する必要があります。候補製剤中のエンドトキシン汚染は、免疫学的アッセイの一貫性のない偽の結果につながる可能性があり、十分な量で有害である可能性があります。ここでは説明しませんが、SDS-PAGEなどの後続の分析ステップで多くの汚染物質が観察される場合は、ニッケルアフィニティークロマトグラフィー後の追加の精製が必要になる場合があります。これはSECで実現できますが、条件によっては定式化ベースでの最適化が必要になる場合があります。

タンパク質を無細胞発現させるための原核生物または真核生物ライセートは、目的のタンパク質を合成するための市販製品として容易に入手可能です(完全なレビューについては、 1を参照)。これらの発現系はさまざまなスケールで利用可能であり、 大腸菌、タバコ植物、哺乳類培養物など、さまざまな生物のライセートを利用しています。無細胞ライセートは、使いやすさや堅牢で迅速なタンパク質生産など、従来の組換えタンパク質生産アプローチに比べて複数の利点があります。これらのアプローチは主に可溶性タンパク質の生産に使用されますが、このグループは膜タンパク質を発現するためのアプローチを開拓しました。
この新しいアプローチは、発現のための2つのタンパク質産物、アポリポタンパク質および目的の膜タンパク質をコードするDNAを含むことにより、既存の無細胞発現系にわずかな変更を加える。発現したアポリポタンパク質(ApoA1またはApoE4の誘導体)は、無細胞ライセートに添加された脂質と相互作用して、自発的に(~20 nm)NLPを組み立てます。目的の膜タンパク質と共翻訳すると、NLPと膜タンパク質は可溶性ナノ粒子複合体を形成し、膜タンパク質はNLP脂質二重層内に埋め込まれます。したがって、膜タンパク質は可溶性の離散粒子内に含まれるため、ダウンストリームアプリケーションによりアクセスしやすくなります。このアプローチは、NLP二重層2 内で機能的なオリゴマータンパク質複合体を生成することができ、サブユニットワクチンの抗原成分を生成することができ、その後、親油性アジュバントと混合して、 in vivo 評価に適した共局在抗原およびアジュバントを特徴とするナノ粒子ワクチンを形成することができる。
この現在の方法は、以前に公開されたプロトコル3から変更されています。重要な修飾は、無細胞反応のスケールアップとそれに続くタンパク質-NLP複合体の精製に焦点を当てています。さらなる修飾は、テロデンドリマーとして知られる両親媒性ポリマーの添加を含み、これは、無細胞反応への添加の前に最初に脂質と混合される。テロデンドリマーおよび脂質の存在下でのプラスミドの共翻訳は、テロデンドリマーNLP(tNLP)を生じる。テロデンドリマーの添加はまた、得られるtNLPナノ粒子のサイズおよび単分散性を調節するのを助けます4。このプロトコルは、膜結合サブユニット抗原タンパク質であるクラミジアMOMP5,6を産生するための大規模なワクチン研究に特に最適化されています。この方法は、tNLPに関連する組換えMOMPを生成して、MOMPオリゴマー化を保持する溶解性の高いMOMP-tNLP複合体を形成します。典型的な3 mLのスケールアップ生産では、>1.5 mgの精製MOMPが得られます。無細胞で産生されたMOMP-tNLPは、in vivo免疫原性試験のための迅速なアジュバント添加に適しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2600028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Trizma hydrochloride solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial, ACS reagent, &#8805;99.7%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer Dam for XCell SureLock</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C24 Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit</td>
			<td>BiotechRabbit</td>
			<td>BR1400201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete His-Tag Purification Resin</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td>5893682001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG-ODN1826</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71508-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe PTS cartridge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9594798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe-PTS Testing System</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl and NaOH solutions for pH adjustment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC with UV-vis diode array detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure culture-grade water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Dry Blotting System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>IB24001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio V2.0 software</td>
			<td>Li-COR Biiosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Fc imager</td>
			<td>Li-COR Biiosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (&#8805;99.9%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP000202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIVEX2.4d vector</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 1000 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 20 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 200 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipettes</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic NaH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200, 5/150 GL column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>GE28-9909-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>&#160;tlrl-fsl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby Protein Gel Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Bench Top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 15 mL conicals (89039-666)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 50 mL conicals (89039-656)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies )</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free scaled production and adjuvant addition to a recombinant major outer membrane protein from chlamydia muridarum for vaccine development

サブユニットワクチンは、安全性、安定性、および標準製造において、従来の不活化または弱毒化全細胞由来ワクチンよりも優れています。効果的なタンパク質ベースのサブユニットワクチンを達成するために、タンパク質抗原はしばしば天然のような立体構造を採用する必要があります。これは、膜結合タンパク質である病原体表面抗原にとって特に重要です。一般にナノディスクとして知られているナノリポタンパク質粒子(NLP)の共翻訳を通じて、正しく折り畳まれた機能的な膜タンパク質を製造するために、無細胞法が首尾よく使用されています。 
この戦略は、脂質結合環境で膜タンパク質からなるサブユニットワクチンを製造するために使用できます。ただし、無細胞タンパク質の生産は、多くの場合、小規模(<1 mL)に限定されます。小規模生産工程で生産されるタンパク質の量は、通常、生化学的および生物物理学的研究に十分です。ただし、動物モデルでのワクチン研究に十分なタンパク質を得るために、無細胞プロセスをスケールアップ、最適化、および慎重にテストする必要があります。精製、アジュバント添加、凍結乾燥など、ワクチン製造に関連する他のプロセスは、並行して最適化する必要があります。この論文では、膜結合タンパク質サブユニットワクチンを発現、精製、および製剤化するためのスケールアッププロトコルの開発を報告します。 
スケールアップした無細胞反応では、複数のプラスミド発現ベクターを使用する場合のプラスミド濃度と比率の最適化、脂質の選択、およびアジュバント添加により、製剤化されたナノリポタンパク質粒子を高レベルで生産する必要があります。この方法は、クラミジア主要外膜タンパク質(MOMP)の発現でここで実証されていますが、他の膜タンパク質抗原にも広く適用できます。抗原の有効性は、ここで示されているように、抗体産生を測定するための免疫研究を通じて in vivo で評価できます。

1 mL無細胞反応からのMOMP-tNLPのNiアフィニティー精製のSDS-PAGEプロファイルを 図1Bに示します。この反応により、MOMPとΔ49ApoA1タンパク質の両方で高レベルの発現が得られました。以前の結果は、DMPCおよびテロデンドリムの存在下でのΔ49ApoA1の無細胞発現がテロデンドリムナノリポタンパク質粒子(tNLP)の形成をもたらすことを示しました4。MOMPとΔ49ApoA1の同時溶出は、HisタグがtNLP足場Δ49ApoA1にのみ存在し、MOMPには存在しないため、MOMPがtNLPに関連していることを示しました。MOMPは非常に不溶性の高いタンパク質であり、膜タンパク質の可溶化を促進することが示されているtNLPとの複合体形成によってのみ溶出できます。
MOMP-tNLPを含む溶出画分をプールし、タンパク質定量に関する製造元の指示に従って、蛍光ベースの定量装置、または280 nmの吸光度で濃度を測定する装置を使用して総タンパク質濃度を測定しました。MOMPワクチンの正確な投与を可能にするために、精製複合体中のMOMPの濃度を決定することも重要です。我々は、既知濃度の精製組換えMOMPを標準物質としたゲル密度測定法(図2)を用いてMOMPを定量する方法を開発した。検量線を確立し、MOMP-tNLPサンプルと比較することにより、MOMP濃度を正確に定量することができます。精製サンプル中のMOMP濃度を測定することで、さまざまなスケールでの無細胞反応におけるMOMPの収率を推定することができ、これは下流の研究に適した反応セットアップを計画するために重要です(表3)。
MOMPは、強力な免疫応答を誘発するためにオリゴマーを形成する必要があります11。MOMPのオリゴマー状態を試験するために、MOMP-tNLPを、熱および還元剤ジチオスレイトール(DTT、50mM、 図3A)の両方の存在下および非存在下で分析した。MOMPの高次オリゴマーは、サンプルを熱およびDTTで処理しない場合にSDS-PAGEによって同定されました。比較すると、DTTの存在下で熱で処理されたサンプルは、主にMOMPおよびΔ49ApoA1に対応する2つの異なるバンドをゲル上に示しました(それぞれ約40 kDaおよび22 kDa)。これらの結果は、MOMPのオリゴマー形成に起因するゲルバンディングパターンによく似ており、その有効性に重要です。
さらにMOMPタンパク質の可変ドメイン上の線状エピトープに対する抗体であるMAb40を用いたウェスタンブロット解析は、同様のバンディングパターンを示し、非変性状態でのMOMPタンパク質によるオリゴマー形成を確認した(図3B)。MOMPオリゴマー形成に影響を与える重要な因子は、無細胞反応セットアップ中のMOMPプラスミドとΔ49ApoA1プラスミドの比率です。 表4 は、プラスミドの比率と結果として生じるtNLPへのMOMPの挿入率を示しています。以前の研究では、クラミジアMOMPおよび他の外膜タンパク質が主に三量体として存在する可能性があることが示されました12。無細胞反応における三量体形成を最大化するには、挿入速度をNLPあたり3つのMOMPタンパク質に近く、これは~25:1のMOMP対Δ49ApoA1プラスミド比に相当します。
ドットブロットアッセイは、MOMPおよびtNLPの存在を検出するためのより合理化された方法として使用されました。MAb40抗体を用いて、総MOMPを検出した。tNLPのΔ49ApoA1足場上のHisタグを標的としたMAbHIS抗体を用いて、tNLPの存在を評価した。MAb40抗体とMAbHIS抗体の共シグナル伝達は、MOMP-tNLPの形成を示しました。対照反応は空のtNLPを生成し、MAbHISからの陽性シグナルのみを示しました(図3C)。無細胞反応で産生されたMOMP-tNLPの免疫原性を試験するために、MOMP-tNLPをCpG+FSL-1でアジュバントし、上記のプライムブーストレメンでマウスに筋肉内注射(i.m.)しました。免疫したマウスから血清を採取し、ウェスタンブロットアッセイを用いてMOMP特異的IgG抗体を測定した(図4)。アジュバント投与されたMOMP-tNLPを注射したマウスの血清は、強いMOMP結合を示し、MOMP-tNLPが in vivoで免疫応答を誘発できることを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig01.jpg"> 図1:MOMP-tNLPの発現と精製。 (A)GFPプラスミドを含まないライセート(左)と比較して、UV光源下で発光するGFPコントロールを正常に発現させた無細胞反応の少量のアリコートを含むチューブの画像(左)。(B)SDS-PAGE後にSYPROルビーで染色したプロテインゲルの、MOMP-tNLPの精製プロファイルを示す。MOMP は 40 kDa で移行し、49ApoA1 は 22 kDaで移行します。略語:MOMP =クラミジア主要外膜タンパク質;tNLP = テロデンドリマーナノリポタンパク質粒子;MOMP-tNLP = MOMP-tNLP complex;GFP = 緑色蛍光タンパク質コードプラスミド;MW = 分子量マーカー;T =全無細胞ライセート;FT =フロースルー;R1-R3 = 無細胞反応アリコート;W1、W6 =洗浄1および6。E1-E7 = 溶出 1 から 7;Δ49ApoA1 = Hisタグ付きマウスApoA1誘導体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig02.jpg"> 図2:MOMP-tNLPサンプルにおける MOMPの定量。 (A)MOMPの定量のためにSYPROルビーで染色したSDS-PAGEゲル。既知濃度の組換えMOMPをゲル上に負荷し、標準曲線を得た。各レーンには、0.1 μg、0.5 μg、1.0 μg、2.0 μg、および4.0 μgのMOMPが含まれていました。定量されていたMOMP-tNLPサンプルを同じゲルにロードしました。(B)MOMP濃度標準曲線をデンシトメトリーを用いて作成した。正規化されたバンド密度とMOMPの量に関する式が確立された。この式を使用して、未知のサンプルのMOMP含有量を計算しました。略語:MOMP =クラミジア主要外膜タンパク質;tNLP = テロデンドリマーナノリポタンパク質粒子;MOMP-tNLP = MOMP-tNLP complex;SDS-PAGE = ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig03.jpg"> 図3:無細胞産生MOMP-tNLPにより、MOMPは高次構造を形成できます。 (a)DTTおよび還元剤の熱処理の有無にかかわらずMOMP-tNLPのSDS-PAGEゲルを、SYPRO Rubyで染色した。熱とDTTでは、熱と還元剤が高次MOMP構造の大部分を分解するため、MOMPは主に~40 kDaでモノマーバンドとして現れました。熱とDTTがない場合、高次バンドが存在し、MOMPオリゴマー立体配座を示しています。(B)MOMP-tNLPおよびMOMP単独のウェスタンブロットを、未処理、熱およびDTTで処理した。転写後、メンブレンをMAb40(1:1,000希釈)でプローブしました。SYPRO Ruby染色ゲルと同様のバンディングパターンが観察され、より分子量の高いバンドが実際にMOMPオリゴマーであることが確認されました。(C)MAb40およびMAbHISでプローブしたMOMP-tNLPおよび空のtNLPサンプル(重複)のドットブロット。略語:MOMP =クラミジア主要外膜タンパク質;tNLP = テロデンドリマーナノリポタンパク質粒子;MOMP-tNLP = MOMP-tNLP complex;SDS-PAGE = ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動;DTT = ジチオスレイトール。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig04.jpg"> 図4:無細胞産生MOMP-tNLPは免疫原性が高い。 免疫マウス由来の血清は、強い抗MOMPシグナルを示した。CpG+FSL-1でアジュバントしたMOMP-tNLPを用いてマウスを免疫した。6匹の免疫マウスからの血清を回収し、プールし、MOMP-tNLPのプローブに使用した。血清はウェスタンブロッティングアッセイでMOMPに結合することができ、強いIgGシグナルを示しました(左)。MAb40を一次抗体として用いたウェスタンブロット(右)でも同様のバンドが見られ、血清にMOMP特異的IgGが含まれていることが分かりました。略語:MOMP =クラミジア主要外膜タンパク質;tNLP = テロデンドリマーナノリポタンパク質粒子;MOMP-tNLP = MOMP-tNLP complex;CpG = コレステロール修飾CpGアジュバント;FSL-1 = 親油性アジュバント。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>バッファー名</td>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>ナクル</td>
			<td>イミダゾール</td>
			<td>pH:</td>
		</tr><tr><td>バインド バッファー</td>
			<td>50ミリリットル</td>
			<td>300ミリリットル</td>
			<td>10ミリリットル</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>ウォッシュバッファー</td>
			<td>50ミリリットル</td>
			<td>300ミリリットル</td>
			<td>20ミリリットル</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>溶出バッファー 1</td>
			<td>50ミリリットル</td>
			<td>300ミリリットル</td>
			<td>250ミリリットル</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>溶出バッファー 2</td>
			<td>50ミリリットル</td>
			<td>300ミリリットル</td>
			<td>500ミリリットル</td>
			<td>8.0</td>
		</tr></tbody></table>表 1: ニッケルアフィニティー精製に必要なバッファーのリストで、各成分の濃度とpHを詳述しています。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>実行中</td>
			<td>50分</td>
		</tr><tr><td>流量</td>
			<td>6.0ミリリットル/分</td>
		</tr><tr><td>グラデーションの種類</td>
			<td>バイナリ</td>
		</tr><tr><td>バッファ A</td>
			<td>H20中の10 mM TEAA</td>
		</tr><tr><td>バッファ B</td>
			<td>メック</td>
		</tr><tr><td>勾配</td>
			<td>% バッファ B</td>
		</tr><tr><td>0 ミン</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>30分</td>
			<td>60%</td>
		</tr><tr><td>30.5分</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>40分</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>40.5分</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>50分</td>
			<td>25%</td>
		</tr></tbody></table>表 2: コレステロール修飾CpGの逆相HPLC精製の条件。 略語:TEAA =酢酸トリエチルアンモニウム;MeCN = アセトニトリル。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>無細胞ライセート(mL)</td>
			<td>DMPC脂質(ミリグラム)</td>
			<td>テロデンドリマー(mg)</td>
			<td>モンププラスミド(μg)</td>
			<td>精製MOMP収率(ミリグラム)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>0.4</td>
			<td>15</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>8</td>
			<td>0.8</td>
			<td>30</td>
			<td>1.1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>12</td>
			<td>1.2</td>
			<td>45</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>75</td>
			<td>2.7</td>
		</tr></tbody></table>表 3: 異なるスケールの無細胞反応に使用される脂質、テロデンドリマー、プラスミドの量と、対応する収率。略語:MOMP =クラミジア主要外膜タンパク質;DMPC = 1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">プラスミドインプット比 MOMP : Δ49ApoA1</td>
			<td>1:1</td>
			<td>5:1</td>
			<td>10:1</td>
			<td>25:1</td>
			<td>50:1</td>
			<td>100:1</td>
		</tr><tr><td colspan="2">産生タンパク質量の比率、MOMP : Δ49ApoA1</td>
			<td>0.02</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.64</td>
			<td>3.46</td>
			<td>6.55</td>
			<td>20.04</td>
		</tr><tr><td colspan="2">tNLP あたりの MOMP 挿入の推定回数</td>
			<td>0.03</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.75</td>
			<td>4.04</td>
			<td>7.65</td>
			<td>23.39</td>
		</tr></tbody></table>表 4: 無細胞反応におけるプラスミド比率を、得られたMOMP挿入率とした。略語:MOMP =クラミジア主要外膜タンパク質;tNLP = テロデンドリマーナノリポタンパク質粒子;Δ49ApoA1 = Hisタグ付きマウスApoA1誘導体。

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Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

このプロトコルでは、市販の無細胞タンパク質発現キットを使用して、サブユニットワクチンの抗原として使用できるナノディスクに支持された膜タンパク質を産生することを説明しています。

ワクチン開発のためのクラ ミジア・ムリダルム 由来の組換え主要外膜タンパク質への無細胞スケール生産とアジュバント添加

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard ...

多くの候補サブユニットワクチン抗原は膜タンパク質です。歴史的に、これらは十分な量で製造および精製することが困難でした。この技術により、脂質膜内に埋め込まれた目的の抗原を作成し、ネイティブ様の確認を確実にすることができます。このプロセスはまた、目的のアジュバントとの製剤化を容易にする。無細胞発現により、天然のタグレス構造で目的のタンパク質を迅速に生産することができます。この手法もスケーラブルであり、このプロセスを使用してワクチン製剤を開発するためにすでに営利企業と協力しています。ここではクラミジア抗原のプロセスを示しますが、このプロセスは、膜タンパク質であるかどうかに関係なく、目的の抗原を生成するように簡単に適応できます。このプロセスは、病原体と癌の両方のワクチン開発に適用できる可能性があります。まず、無細胞法を用いてMOMP-tNLPを調製します。反応をセットする2時間前に無細胞タンパク質発現キットから再構成バッファーを解凍し、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤をバッファーに添加します。1ミリリットルの反応を5回実行するように設計されたキットを使用してください。1ミリリットルの反応ごとに、525マイクロリットルの再構成バッファーを大腸菌ライセートボトルに加え、転がして溶解します。添加剤を入れた反応瓶に250マイクロリットルの再構成バッファーを加え、転動により溶解する。次に、反応供給ボトルに8.1ミリリットルの再構成バッファーを加え、転がして溶解します。アミノ酸混合物のボトルに、それを溶解するために3ミリリットルの再構成緩衝液を加える。メチオニンの別のボトルに、1.8ミリリットルの再構成バッファーを加えて溶解し、氷上で保管します。225マイクロリットルの再構成混合物、270マイクロリットルのメチオニンを含まない再構成アミノ酸混合物、および30マイクロリットルの再構成メチオニンを大腸菌ライセートボトルに追加します。さらに、400マイクロリットルのDMPC/テロデンドリマー混合物15マイクログラムのMOMPプラスミド、および0.6マイクログラムのデルタ-49ApoA1を混合物に加えて混合します。全溶液の20マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに分注 GFP発現制御反応用。メチオニンを含まない2.65ミリリットルの再構成アミノ酸混合物および300マイクロリットルの再構成メチオニンを添加して飼料溶液を調製する。1ミリリットルの反応液を無細胞反応キット内の反応室に移し、密封します。反応容器の外側のチャンバーに10ミリリットルの供給溶液を満たして閉じます。0.5マイクロリットルのGFPコントロールプラスミドを反応混合物の20マイクロリットルのアリコートに加えます。反応物をシェーカーに毎分300回転で30°Cで18時間入れる。GFP合成による蛍光について15分後にUV光下で反応をモニターします。デルタ-49ApoA1タンパク質にHISタグを固定化したニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより、無細胞反応混合物からMOMP-tNLPナノ粒子複合体を精製します。HISタグ精製樹脂の50%スラリー1ミリリットルを10ミリリットルの使い捨てクロマトグラフィーカラムに移し、3ミリリットルの結合バッファーを加えて平衡化します。その後、バッファーを排出し、250マイクロリットルの結合バッファーを樹脂に追加します。SDS-PAGE分析のために20マイクロリットルの無細胞反応混合物を抽出します。残りの無細胞反応混合物を平衡化樹脂とともに加え、実験室のロッカーで摂氏4度で1時間インキュベートします。カラムキャップを取り外し、500マイクロリットルの結合バッファーで洗浄します。洗浄液をカラムに加え、SDS-PAGE分析用のフロースルーを回収します。カラムを1ミリリットルの洗浄バッファーで20ミリモルのイミダゾールで6回洗浄し、画分を収集します。2回目の洗浄では、1ミリリットルのピペットを使用して樹脂を攪拌します。250ミリモルのイミダゾールを含む6つの300マイクロリットル画分の溶出バッファーIでMOMP-tNLPを溶出し、500ミリモルのイミダゾールを含む300マイクロリットルの溶出バッファーIIで最終溶出します。2回目の溶出では、1ミリリットルのピペットを用いて上下にピペッティングして樹脂を激しく撹拌する。ゲルイメージャーを使用して、600ナノメートルの画像をキャプチャします。次に、タンパク質標準を用いたSDS-PAGE分析により、ナノ粒子中の異なるタンパク質の量を定量します。MOMP バンドの密度を使用して標準曲線を描画します。次に、標準物質を用いてナノ粒子のMOMP成分を決定する。SDS-PAGEでサンプルを分離し、ウェスタンブロット分析用の市販のドライブロッティングシステムを使用してゲルスタックを転写します。ブロットをスタックから取り出し、デルタ-49ApoA1タンパク質由来のHISタグに対する0.2%TWEEN 20および0.5マイクログラム/ミリリットルのMAb40、または0.2マイクログラム/ミリリットルのMAbHIS抗HISタグ抗体を含むブロッキングバッファー中で、摂氏4度で一晩インキュベートします。各ブロットをPBSTで3回、1回の洗浄につき5分間洗浄します。1:10, 000の希釈液で蛍光色素に結合した二次抗体を含むブロッキングバッファー中で、ブロットを1時間インキュベートします。PBSTで洗浄を繰り返し、最終洗浄後に蛍光イメージャーを使用して画像をキャプチャします。ドットブロット装置を用いて、3マイクログラムのMOMP-tNLPおよび空のtNLPをブロッピングする。ウェスタンブロッティングと同じ方法を使用してブロットを開発およびブロックします。混合溶液をドライアイス上で凍結し、凍結乾燥機を使用して一晩凍結乾燥します。乾燥した製剤をマイナス20°Cで保管してください。必要に応じて、凍結乾燥したtNLPをエンドトキシンを含まない水で再構成し、転がして溶解し、再水和します。溶液をPBSで透析し、3.5キロダルトンカットオフ透析膜でトレハロースを除去します。.アジュバントを添加する前に、真空濃縮器でナノ粒子溶液を遠心分離します。完全に乾燥しないように、20〜30分後にサンプル量を監視してください。バイオセーフティキャビネットに、無菌条件下でアジュバントを追加します。分析サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、製剤を分析して組み込みに成功させます。アジュバントしたMOMP-tNLPと空のtNLPを摂氏4度で最大14日間保管します。サイズ排除クロマトグラフィーでtNLP製剤の安定性を分析します。MOMP-tNLPのSDS-PAGE分析はニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって行われ、無細胞反応混合物がMOMPタンパク質とデルタ-49ApoA1タンパク質の両方に対して高レベルの発現を有することを実証した。ゲルデンシトメトリーを用いて、既知濃度の精製組換えMOMPを標準物質として用いてMOMP濃度を定量した。オリゴマー形成を決定するために、SDS-PAGE MOMPおよびMOMP-tNLPを熱およびDTTで処理したところ、MOMPおよびdelta-49ApoA1に異なるバンドが示された。MOMPタンパク質に対する抗体MAb40を用いたウェスタンブロット解析により、MOMPタンパク質による非変性状態のオリゴマー形成を確認するバンディングパターンが明らかになりました。MAb40およびMAbHIS抗体の存在下でドットブロットアッセイを実施し、MOMP-tNLPの形成を示しました。しかし、空のtNLPはMAbHISに対して陽性のシグナルを示した。アジュバント投与されたMOMP-tNLPを注射した免疫マウスの血清は、強いMOMP結合を示し、MOMP-tNLPが免疫応答を誘発できることを示しました。このプロトコルはDNAからタンパク質を生成するため、DNase、RNase、および無関係なDNAやRNAとの反応を汚染しないようにすることが不可欠です。反応に使用される材料または試薬には、これらのタイプの分子が含まれていない必要があります。アジュバントの発現、精製、および添加後、これらのワクチン候補を目的の病原体に適した動物モデルで評価して、免疫活性化マーカーを評価したり、チャレンジ中の防御を評価したりすることができます。クラミジアの場合、主要な外膜タンパク質(MOMP)は、長年にわたってサブユニットワクチンの主要な候補抗原と見なされてきましたが、ワクチンの適用に必要な規模で生産することは困難でした。この膜タンパク質の無細胞共発現は、このタンパク質をマウスなどの動物モデルでの評価に向けて動かし始め、最終的にはヒト試験に移行するための実行可能な方法です。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

B細胞の組換えレトロウイルスの生産と感染症

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの産生と力価測定

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

全血の表現型アッセイを用いて多施設臨床試験のための主要な末梢血白血球集団の列挙

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

フォワード遺伝的アプローチで<em&gt;クラミジアトラコマチス</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

FDAの承認を受けたVero細胞におけるワクチン開発のための組換えアレナウイルスの生成

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

宿主細胞のRNA合成でウイルス感染の効果を測定するためにクリックケミストリーを用いた

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

西ナイルウイルス変異株の感染に対するMyD88非介在細胞性免疫応答のインビトロ分析

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

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レジオネラ・ニューモ外膜小胞：マクロファージ上における炎症誘発ポテンシャルの単離と解析

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

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生体外でマウスのナチュラル キラー細胞の大量生産のため新規無料の送り装置システム

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

ワクチン開発のためのクラ ミジア・ムリダルム 由来の組換え主要外膜タンパク質への無細胞スケール生産とアジュバント添加

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