Name: cell-free scaled production and adjuvant addition to a recombinant major outer membrane protein from chlamydia muridarum for vaccine development
Uploaded: 2022-03-16T12:30:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Службы общественного здравоохранения R21 AI20925 и AI144184 U19 от Национального института аллергии и инфекционных заболеваний. Работа выполнена под эгидой Министерства энергетики США Ливерморской национальной лабораторией им. Лоуренса по контракту DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525, LLNL-VIDEO-832788].

<ol>
	<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li><li>Coleman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+association+of+the+Yersinia+pestis+translocon+proteins,+YopB+and+YopD,+are+facilitated+by+nanolipoprotein+particles.">Expression and association of the Yersinia pestis translocon proteins, YopB and YopD, are facilitated by nanolipoprotein particles.</a> PLoS One. 11 (3), 0150166 (2016).</li><li>Cappuccio, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-expression+of+functional+membrane+proteins+and+apolipoprotein,+forming+soluble+nanolipoprotein+particles.">Cell-free co-expression of functional membrane proteins and apolipoprotein, forming soluble nanolipoprotein particles.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 7 (11), 2246-2253 (2008).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+diameter,+monodispersity,+and+solubility+of+ApoA1+nanolipoprotein+particles+using+telodendrimer+chemistry.">Controlling the diameter, monodispersity, and solubility of ApoA1 nanolipoprotein particles using telodendrimer chemistry.</a> Protein Science. 22 (8), 1078-1086 (2013).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+production+of+a+functional+oligomeric+form+of+a+Chlamydia+major+outer-membrane+protein+(MOMP)+for+vaccine+development.">Cell-free production of a functional oligomeric form of a Chlamydia major outer-membrane protein (MOMP) for vaccine development.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 15121-15132 (2017).</li><li>Tifrea, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protection+in+mice+against+a+Chlamydia+muridarum+respiratory+challenge+by+a+vaccine+formulated+with+the+major+outer+membrane+protein+in+nanolipoprotein+particles.">Induction of protection in mice against a Chlamydia muridarum respiratory challenge by a vaccine formulated with the major outer membrane protein in nanolipoprotein particles.</a> Vaccines. 9 (7), 755 (2021).</li><li>Cleveland, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+X-ray+and+neutron+scattering+demonstrates+that+cell-free+expression+produces+properly+formed+disc-shaped+nanolipoprotein+particles.">Small-angle X-ray and neutron scattering demonstrates that cell-free expression produces properly formed disc-shaped nanolipoprotein particles.</a> Protein Science. 27 (3), 780-789 (2018).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+to+nickel-chelating+nanolipoprotein+particles+increases+the+potency+and+efficacy+of+subunit+vaccines+to+prevent+West+Nile+encephalitis.">Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (6), 1018-1022 (2010).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalized+delivery+of+adjuvant+and+antigen+using+nanolipoprotein+particles+enhances+the+immune+response+to+recombinant+antigens.">Colocalized delivery of adjuvant and antigen using nanolipoprotein particles enhances the immune response to recombinant antigens.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (6), 2044-2047 (2013).</li><li>Fischer, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanolipoprotein+particles+(NLPs)+as+an+in+vivo+delivery+platform.">Evaluation of nanolipoprotein particles (NLPs) as an in vivo delivery platform.</a> PLoS One. 9 (3), 93342 (2014).</li><li>Pal, S., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+the+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein+can+elicit+an+immune+response+as+protective+as+that+resulting+from+inoculation+with+live+bacteria.">Vaccination with the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein can elicit an immune response as protective as that resulting from inoculation with live bacteria.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8153-8160 (2005).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+major+outer+membrane+protein+of+Chlamydia+trachomatis.">Structural and functional analyses of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 189 (17), 6222-6235 (2007).</li><li>Hafner, L. M., Wilson, D. P., Timms, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+status+and+future+prospects+for+a+vaccine+against+Chlamydia+trachomatis+infection.">Development status and future prospects for a vaccine against Chlamydia trachomatis infection.</a> Vaccine. 32 (14), 1563-1571 (2014).</li><li>Findlay, H. E., McClafferty, H., Ashley, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+expression,+single-channel+analysis+and+membrane+topology+of+recombinant+Chlamydia+trachomatis+Major+Outer+Membrane+Protein.">Surface expression, single-channel analysis and membrane topology of recombinant Chlamydia trachomatis Major Outer Membrane Protein.</a> BMC Microbiology. 5, 5 (2005).</li><li>Sun, G., Pal, S., Weiland, J., Peterson, E. M., de la Maza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+an+intranasal+challenge+by+vaccines+formulated+with+native+and+recombinant+preparations+of+the+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein.">Protection against an intranasal challenge by vaccines formulated with native and recombinant preparations of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein.</a> Vaccine. 27 (36), 5020-5025 (2009).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+of+functional+receptor+tyrosine+kinases.">Cell-free expression of functional receptor tyrosine kinases.</a> Scientific Reports. 5 (1), 12896 (2015).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в этой статье.

Хламидиоз является наиболее распространенной инфекцией, передающейся половым путем, которая поражает как мужчин, так и женщин. Несмотря на то, что исследования вакцины против хламидиоза длятся десятилетиями, безопасная и эффективная вакцина, которую можно было бы масштабировать до массового производства, остается труднодостижимой13. Хламидийный MOMP считается ведущим кандидатом в качестве защитного вакцинного антигена; однако MOMP обладает высокой гидрофобностью и склонен к неправильному складыванию14,15. Дальнейшие исследования показали, что MOMP существует в олигомерных состояниях, которые необходимы для его иммуногенности11. Здесь подробно описан валидированный метод бесклеточной коэкспрессии, который производит олигомерный MOMP, образующийся в наночастице tNLP в качестве вакцины, с выходом примерно 1,5 мг очищенного MOMP на 3 мл лизата. Эта полностью упорядоченная процедура может быть в дальнейшем масштабирована для промышленного производства, что повысит ее перспективы в качестве полезного подхода к созданию вакцин.
Ранее мы публиковали работы об использовании бесклеточной экспрессии для получения мембранных белков, встроенных в NLP 3,16, а также экспрессии в диски, стабилизированные телодендримерами. Однако этот последний метод позволил получить мембранно-белковые частицы с большей гетерогенностью и меньшей растворимостью. 4 Кроме того, иммуногенность частиц MOMP-телодендримера неясна по сравнению с частицами MOMP-tNLP6.
Эта процедура может быть адаптирована для увеличения экспрессии бактериальных мембранных белков, которые являются перспективными кандидатами в качестве антигенов для использования в субъединичных вакцинах. Эта процедура не только производит солюбилизированный бактериальный мембранный белок, но и общая структура наночастиц поддается дальнейшей модификации с использованием различных липофильных вакцинных адъювантов, включая, помимо прочего, CpG, конъюгированный с фрагментом холестерина или FSL-1. Экспрессия других антигенов-кандидатов из бактерий возможна, хотя для достижения оптимальных выходов может потребоваться изучение таких параметров, как температура экспрессии, выбор липидов и тип системы экспрессии.
Кроме того, выбор и соотношение плазмид имеют решающее значение в этом процессе. Обе используемые плазмиды должны быть построены из одного и того же каркаса. Если вставки имеют примерно одинаковую длину, соотношения могут быть основаны на массе добавленной плазмиды, как описано здесь. Тем не менее, соотнесение на основе кротов даст более воспроизводимые результаты, особенно при масштабировании реакций. Соотношения, которые хорошо работают в реакциях масштаба экрана (< 0,5 мл), могут быть неприменимы к более крупным реакциям и могут потребовать дополнительной оптимизации. Немембранные белки все еще могут быть экспрессированы с помощью бесклеточных наборов, но могут не требовать липидных наночастиц (коэкспрессия) для получения растворимого продукта. Кроме того, несмотря на то, что в этом протоколе описывается адъювантирование с помощью CpG и FSL-1, эта система поддается составлению с другими липофильными адъювантами или смешиванию с растворимыми адъювантами по желанию.
Важно избегать контаминации при постановке реакции бесклеточной экспрессии, так как это может повлиять на выход. Любые добавки к реакции, в том числе и сами плазмиды, должны быть высокой чистоты. Кроме того, экспрессируемые белки должны контактировать только с материалами и растворами, свободными от загрязнения эндотоксинами. Контаминация эндотоксинами в препаратах-кандидатах может привести к противоречивым и ложным результатам иммунологических анализов и может быть вредной в достаточных количествах. Хотя это и не описано здесь, дополнительная очистка после хроматографии сродства никеля может потребоваться, если на последующих этапах анализа, например, с помощью SDS-PAGE, обнаруживается много загрязняющих веществ. Это может быть достигнуто с помощью SEC, хотя условия могут потребовать оптимизации на основе каждой рецептуры.

Прокариотические или эукариотические лизаты для бесклеточной экспрессии белков легко доступны в качестве коммерческих продуктов для синтеза интересующих белков (полный обзор см. в разделе 1). Эти системы экспрессии доступны в различных масштабах и используют лизаты различных организмов, включая кишечную палочку, растения табака и культуры млекопитающих. Бесклеточные лизаты обладают множеством преимуществ по сравнению с традиционными подходами к производству рекомбинантных белков, включая простоту использования и надежное и быстрое производство белка. В то время как эти подходы в основном используются для получения растворимых белков, эта группа стала пионером в их использовании для экспрессии мембранных белков.
Этот новый подход вносит незначительные изменения в существующие системы бесклеточной экспрессии, включая ДНК, кодирующую два белковых продукта для экспрессии: аполипопротеин и мембранный белок, представляющий интерес. Экспрессируемый аполипопротеин (производные ApoA1 или ApoE4) взаимодействует с липидами, добавленными к бесклеточному лизату, для спонтанной сборки (~20 нм) NLP. При совместном переводе с интересующим нас мембранным белком НЛП и мембранный белок образуют растворимый комплекс наночастиц, в котором мембранный белок встроен в липидный бислой НЛП. Таким образом, мембранный белок более доступен для последующих применений, поскольку он содержится в растворимых дискретных частицах. Этот подход позволяет продуцировать функциональные олигомерные белковые комплексы в бислоеNLP 2 и производить антигенный компонент субъединичной вакцины, который впоследствии смешивают с липофильными адъювантами с образованием вакцины на основе наночастиц с совместно локализованным антигеном и адъювантом, пригодным для оценки in vivo .
Этот текущий метод является модификацией ранее опубликованного протокола3. Основные модификации направлены на масштабирование внеклеточной реакции и последующую очистку комплекса белок-НЛП. Дальнейшая модификация включает в себя добавление амфифильного полимера, известного как телодендример, который сначала смешивается с липидами, а затем добавляется к внеклеточной реакции. Котрансляция плазмид в присутствии телодендримера и липидов приводит к образованию телодендримерного НЛП (тНЛП). Добавление телодендримера также помогает модулировать размер и монодисперсность полученных наночастиц tNLP4. Этот протокол специально оптимизирован для крупномасштабных исследований вакцин с целью получения связанного с мембраной белка-субъединичного антигена, хламидийного MOMP 5,6. Метод позволяет получить рекомбинантный MOMP, ассоциированный с tNLP, с образованием высокорастворимого комплекса MOMP-tNLP, который сохраняет олигомеризацию MOMP. Типичное производство объемом 3 мл позволяет получить >1,5 мг очищенного MOMP. Бесклеточный, продуцируемый MOMP-tNLP поддается быстрому добавлению адъюванта для тестирования иммуногенности in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2600028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Trizma hydrochloride solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial, ACS reagent, &#8805;99.7%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer Dam for XCell SureLock</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C24 Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit</td>
			<td>BiotechRabbit</td>
			<td>BR1400201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete His-Tag Purification Resin</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td>5893682001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG-ODN1826</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71508-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7311550EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe PTS cartridge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9594798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endosafe-PTS Testing System</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl and NaOH solutions for pH adjustment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC with UV-vis diode array detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone HyPure culture-grade water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Dry Blotting System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>IB24001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio V2.0 software</td>
			<td>Li-COR Biiosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Fc imager</td>
			<td>Li-COR Biiosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (&#8805;99.9%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP000202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIVEX2.4d vector</td>
			<td>Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonicator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 1000 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 20 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette tips: LTS 200 &#181;L</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipettes</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light)</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride NaCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic NaH2PO4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>&#160;S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200, 5/150 GL column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>GE28-9909-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>&#160;tlrl-fsl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby Protein Gel Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge Bench Top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 15 mL conicals (89039-666)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 50 mL conicals (89039-656)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies )</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free scaled production and adjuvant addition to a recombinant major outer membrane protein from chlamydia muridarum for vaccine development

Субъединичные вакцины имеют преимущества по сравнению с более традиционными инактивированными или аттенуированными вакцинами цельноклеточного происхождения в отношении безопасности, стабильности и стандартного производства. Для получения эффективной субъединичной вакцины на основе белка белковый антиген часто должен принимать нативную конформацию. Это особенно важно для поверхностных антигенов патогена, которые представляют собой мембраносвязанные белки. Бесклеточные методы были успешно использованы для получения правильно свернутого функционального мембранного белка путем котрансляции частиц нанолипопротеинов (NLP), широко известных как нанодиски. 
Эта стратегия может быть использована для производства субъединичных вакцин, состоящих из мембранных белков в липидно-связанной среде. Однако производство бесклеточного белка часто ограничивается небольшими масштабами (<1 мл). Количество белка, производимого в небольших производственных циклах, обычно достаточно для биохимических и биофизических исследований. Тем не менее, бесклеточный процесс должен быть масштабирован, оптимизирован и тщательно протестирован, чтобы получить достаточное количество белка для исследований вакцины на животных моделях. Другие процессы, связанные с производством вакцин, такие как очистка, добавление адъювантов и лиофилизация, должны быть оптимизированы параллельно. В этом документе сообщается о разработке расширенного протокола экспрессии, очистки и составления мембранно-связанной белковой субъединичной вакцины. 
Масштабные внеклеточные реакции требуют оптимизации концентраций и соотношений плазмид при использовании нескольких векторов экспрессии плазмид, селекции липидов и адъювантного добавления для высокоуровневого производства формулированных частиц нанолипопротеинов. Метод демонстрируется здесь с экспрессией основного белка внешней мембраны хламидия (MOMP), но может быть широко применен к другим антигенам мембранных белков. Эффективность антигена может быть оценена in vivo с помощью исследований иммунизации для измерения выработки антител, как показано здесь.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development at JoVE.com

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Этот протокол описывает использование коммерческих наборов для экспрессии внеклеточных белков для производства мембранных белков, поддерживаемых в нанодиске, которые могут быть использованы в качестве антигенов в субъединичных вакцинах.

Бесклеточное масштабное производство и адъювантное добавление к рекомбинантному белку внешней мембраны из Chlamydia muridarum для разработки вакцины

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard ...

Многие субъединичные вакцинные антигены-кандидаты являются мембранными белками. Исторически сложилось так, что их было трудно производить и очищать в достаточных количествах. С помощью этого метода мы можем создавать интересующие нас антигены, встроенные в липидную мембрану, чтобы помочь обеспечить подтверждение, подобное нативному.Этот процесс также облегчает составление рецептуры с интересующими адъювантами. Бесклеточная экспрессия позволяет быстро производить интересующие белки в их нативной структуре без меток. Этот метод также является масштабируемым, и мы уже работаем с коммерческими компаниями над разработкой составов вакцин с использованием этого процесса.Мы демонстрируем этот процесс для антигена хламидиоза, но этот процесс может быть легко адаптирован для получения интересующих нас антигенов, независимо от того, являются ли они мембранными белками или нет. Этот процесс может быть применим как к разработке вакцин против патогенов, так и против рака. Для начала подготовьте MOMP-tNLP, используя бесклеточный метод.Разморозьте восстановительный буфер из набора для экспрессии бесклеточного белка за два часа до начала реакции и добавьте в буфер ингибитор протеазы, не содержащий ЭДТА. Используйте набор, предназначенный для запуска пяти реакций объемом один миллилитр. Для каждой реакции объемом один миллилитр добавьте 525 микролитров восстановительного буфера во флакон с лизатом E.coli и сверните его до растворения.Добавьте 250 микролитров восстановительного буфера в реакционную бутылку, содержащую добавку, и растворите путем прокатки. Затем добавьте 8,1 миллилитра буфера для восстановления в бутылку для реакционного корма и сверните ее до растворения. Во флакон с аминокислотной смесью добавьте три миллилитра восстановительного буфера, чтобы растворить его.В другой флакон метионина добавьте 1,8 миллилитра восстановительного буфера, растворите его и храните на льду. Добавьте 225 микролитров восстановленной смеси, 270 микролитров восстановленной аминокислотной смеси без метионина и 30 микролитров восстановленного метионина во флакон с лизатом E.coli. Далее добавьте в смесь 400 микролитров смеси DMPC/телодендримера, 15 мкг плазмиды MOMP и 0,6 мкг дельта-49ApoA1 и перемешайте.Аликвота 20 микролитров общего раствора в пробирке объемом 1,5 миллилитра Для контрольной реакции, экспрессирующей GFP. Приготовьте кормовой раствор, добавив 2,65 миллилитра восстановленной аминокислотной смеси без метионина и 300 микролитров восстановленного метионина. Перелейте один миллилитр реакционного раствора во внутреннюю реакционную камеру в бесклеточном реакционном наборе и запечатайте его.Наполните внешнюю камеру реакционного сосуда 10 миллилитрами питательного раствора и закройте ее. К 20-микролитровым аликвотам реакционной смеси добавляют 0,5 мкл контрольной плазмиды GFP. Поместите реакцию в шейкер со скоростью 300 оборотов в минуту на 18 часов при температуре 30 градусов по Цельсию.Следите за реакцией под ультрафиолетовым светом через 15 минут на предмет флуоресценции из-за синтеза GFP. Очистите комплекс наночастиц MOMP-tNLP от внеклеточной реакционной смеси методом иммобилизованной никелевой аффинной хроматографии с использованием HIS-метки на белке дельта-49ApoA1. Перелейте один миллилитр 50%-ной суспензии очищающей смолы HIS-tag в одноразовую хроматографическую колонку объемом 10 миллилитров и добавьте три миллилитра связующего буфера для уравновешивания.После этого слейте воду из буфера и добавьте в смолу 250 микролитров связующего буфера. Извлеките 20 микролитров бесклеточной реакционной смеси для анализа SDS-PAGE. Добавьте оставшуюся бесклеточную реакционную смесь с уравновешенной смолой и инкубируйте в лабораторном коромысле в течение одного часа при температуре четыре градуса Цельсия.Снимите крышку колонки и промойте ее 500 микролитрами связующего буфера. Добавьте промывочную жидкость в колонку и соберите проточную жидкость для анализа SDS-PAGE. Промойте колонку одним миллилитром промывочного буфера с 20-миллимолярным имидазолом шесть раз и соберите фракции.Во время второй промывки используйте пипетку объемом один миллилитр, чтобы перемешать смолу. Элюируют MOMP-tNLP в шесть 300-микролитровых фракций элюирующего буфера I, содержащего 250-миллимолярный имидазол, и окончательного элюирования с 300 микролитрами элюирующего буфера II, содержащего 500-миллимолярный имидазол. Во время второго элюирования энергично перемешайте смолу, пипетируя вверх и вниз с помощью пипетки объемом один миллилитр.Используйте гелевый имидж-сканер для съемки изображений с длиной волны 600 нанометров. Затем количественно определите количество различных белков в наночастицах с помощью анализа SDS-PAGE с использованием белкового стандарта. Нарисуйте стандартную кривую, используя плотности каналов MOMP.Затем определяют MOMP-составляющую наночастиц с помощью стандарта. Растворите образцы с помощью SDS-PAGE и перенесите стопки гелей с помощью коммерческой системы сухого блоттинга для анализа методом вестерн-блоттинга. Извлеките кляксы из стопки и инкубируйте их в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия в блокирующем буфере, содержащем 0,2%TWEEN 20 и 0,5 микрограмма на миллилитр MAb40 или 0,2 микрограмма на миллилитр антитела MAbHIS antiHIS-tag, направленные против HIS-tag из белка delta-49ApoA1.Промойте каждую кляксу PBST три раза в течение пяти минут за одну стирку. Инкубируют блоты в течение одного часа в блокирующем буфере, содержащем вторичные антитела, конъюгированные с флуорофором, в разведении 1:10 000. Повторите промывку с PBST и сделайте снимок с помощью флуоресцентного тепловизора после окончательной стирки.С помощью аппарата для дот-блоттинга промокните три микрограмма MOMP-tNLP и опорожните tNLP. Разработайте и заблокируйте кляксы, используя тот же метод для вестерн-блоттинга. Заморозьте смешанный раствор на сухом льду и лиофилизируйте его на ночь с помощью лиофилизатора.Храните высушенные составы при температуре минус 20 градусов по Цельсию. При необходимости восстановите лиофилизированные tNLP водой, не содержащей эндотоксинов, и прокатите ее для растворения и регидратации. Диализируйте раствор PBS и удалите трегалозу с помощью диализной мембраны с отсечкой на 3,5 килодальтона.Центрифугируйте раствор наночастиц в вакуумном концентраторе перед добавлением адъюванта. Контролируйте объем образца через 20–30 минут, чтобы предотвратить полное высыхание. В шкафу биобезопасности добавьте адъювант в стерильных условиях.Используя аналитическую эксклюзионную хроматографию, проанализируйте рецептуру для успешного внедрения. Храните адъювантные MOMP-tNLP и пустые tNLP при температуре четыре градуса Цельсия до 14 дней. Анализ стабильности рецептуры tNLP с помощью размерно-эксклюзионной хроматографии.Анализ SDS-PAGE MOMP-TLP был проведен с помощью сродственной хроматографии никеля, которая продемонстрировала, что бесклеточная реакционная смесь имеет высокие уровни экспрессии как для MOMP, так и для белков дельта-49ApoA1. С помощью гель-денситометрии концентрацию MOMP количественно определяли с помощью очищенного рекомбинантного MOMP с известной концентрацией в качестве стандарта. Для определения образования олигомеров SDS-PAGE MOMP и MOMP-tNLP обрабатывали теплом и DTT, которые показали отчетливые полосы для MOMP и дельта-49ApoA1.Против белка MOMP был использован вестерн-блоттинг-анализ с использованием антитела MAb40, который выявил полосчатый рисунок, подтверждающий образование олигомеров белком MOMP в его неденатурированном состоянии. Дот-блоттинг-анализ проводили в присутствии антител MAb40 и MAbHIS, что свидетельствовало об образовании MOMP-tNLP. Тем не менее, пустой tNLP показал положительный сигнал для MAbHIS.Сыворотки от иммунизированных мышей, которым вводили адъювантный MOMP-tNLP, продемонстрировали сильное связывание MOMP и указывали на то, что MOMP-tNLP может вызывать иммунный ответ. Поскольку этот протокол генерирует белок из ДНК, важно избегать загрязнения реакции ДНКазой, РНКазой, а также посторонними ДНК и РНК. Любые материалы или реагенты, используемые в реакциях, не должны содержать молекул такого типа.После экспрессии, очистки и добавления адъювантов эти вакцины-кандидаты могут быть оценены на соответствующих животных моделях для интересующих патогенов для оценки маркеров иммунной активации или оценки защиты во время испытания. Что касается хламидиоза, то основной белок внешней мембраны, или MOMP, в течение многих лет считался ведущим антигеном-кандидатом для субъединичных вакцин, но его было трудно производить в масштабах, необходимых для применения вакцины. Внеклеточная коэкспрессия этого мембранного белка является жизнеспособным способом начать продвигать этот белок к оценке на животных моделях, таких как мыши, и, в конечном итоге, к тестированию на людях.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Рекомбинантный Ретровирусные Производство и Заражение В-клетки

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Производство и Titering рекомбинантных адено-ассоциированные вирусные векторы

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Перечень основных периферической крови популяции лейкоцитов для многоцентровых клинических испытаний с использованием полного анализа крови Фенотипирование

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Вперед генетические подходы в<em&gt; Хламидиоза</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Генерация рекомбинантного ареновирус для разработки вакцины в FDA-Approved клетках Веро

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Использование химии Нажмите для оценки влияния вирусной инфекции на клетки-хозяина синтеза РНК

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro анализ MyD88-опосредованной клеточного иммунного ответа на вирус Западного Нила мутантный штамм инфекции

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Легионелл везикул наружной мембраны: Выделение и анализ их провоспалительного потенциала на макрофагах

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Роман фидер бесплатная система для массового производства мышиных естественных клеток-киллеров в пробирке

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Одноклеточных Quantitation мРНК и поверхности белков в инфицированных Обезьяний вирус иммунодефицита CD4+ T клетки изолированы от макак резус