Name: characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy
Uploaded: 2021-12-08T13:00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

نشكر "المرفق الأساسي للتصوير وقياس الخلايا" في Genethon ، بالإضافة إلى خدمة الأنسجة ، والتي يتم دعمها جزئيا من خلال أموال المعدات من منطقة إيل دو فرانس ، والمجلس العام للإيسون ، وأبحاث Genopole في Evry ، وجامعة Evry Val d'Essonne و INSERM ، فرنسا. نحن ممتنون أيضا للدكتور راشمي كوثاري لتوفير خط الماوس Smn 2B / 2B (جامعة أوتاوا ، كندا) والدكتور إريك كريجسي لخط الماوس ColQDex2 / + (غير منشور ، جامعة باريس ، فرنسا). ونشكر غيوم كوري على دعمه في التحليل الإحصائي. تم الحصول على الأجسام المضادة أحادية النسيلة 2H3 (التي طورها Jessel، T.M. و Dodd، J.) و SV2 (التي طورها Buckley، K.M.) من بنك الدراسات التنموية الهجين (DSHB) ، الذي أنشأه NICHD التابع للمعاهد الوطنية للصحة وتم الحفاظ عليه في جامعة أيوا ، قسم علم الأحياء ، مدينة أيوا ، IA 52242. تم دعم هذا العمل من قبل الرابطة الفرنسية لمكافحة الاعتلالات العضلية (AFM-Telethon) و INSERM وجامعة إيفري فال ديسون.

<ol>
	<li>Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+nerve-muscle+junctions+in+hindlimb+muscles+of+the+mouse.">Postnatal maturation of nerve-muscle junctions in hindlimb muscles of the mouse.</a> Developmental Biology. 94 (1), 11-22 (1982).</li><li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMJ-morph+reveals+principal+components+of+synaptic+morphology+influencing+structure-function+relationships+at+the+neuromuscular+junction.">NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction.</a> Open Biology. 6 (12), (2016).</li><li>Willadt, S., Nash, M., Slater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+the+structure+and+function+of+mammalian+neuromuscular+junctions.">Age-related changes in the structure and function of mammalian neuromuscular junctions.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1412, 41-53 (2018).</li><li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li><li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease.">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li><li>Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+as+a+distal+axonopathy:+molecular+mechanisms+affecting+neuromuscular+junction+stability+in+the+presymptomatic+stages+of+the+disease.">ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, (2014).</li><li>Lovering, R. M., Iyer, S. R., Edwards, B., Davies, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+neuromuscular+junctions+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Alterations of neuromuscular junctions in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuroscience Letters. 737, 135304 (2020).</li><li>Koneczny, I., Herbst, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+Gravis:+Pathogenic+effects+of+autoantibodies+on+neuromuscular+architecture.">Myasthenia Gravis: Pathogenic effects of autoantibodies on neuromuscular architecture.</a> Cells. 8 (7), 671 (2019).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubular+myopathy+and+the+neuromuscular+junction:+a+novel+therapeutic+approach+from+mouse+models.">Myotubular myopathy and the neuromuscular junction: a novel therapeutic approach from mouse models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 5 (6), 852-859 (2012).</li><li>Gibbs, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+abnormalities+in+DNM2-related+centronuclear+myopathy.">Neuromuscular junction abnormalities in DNM2-related centronuclear myopathy.</a> Journal of Molecular Medicine. 91 (6), 727-737 (2013).</li><li>Swoboda, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+denervation+in+SMA:+Relation+to+age,+SMN2+copy+number,+and+function.">Natural history of denervation in SMA: Relation to age, SMN2 copy number, and function.</a> Annals of Neurology. 57 (5), 704-712 (2005).</li><li>Rodr&#237;guez Cruz, P. M., Palace, J., Beeson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction+and+wide+heterogeneity+of+congenital+myasthenic+syndromes.">The neuromuscular junction and wide heterogeneity of congenital myasthenic syndromes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1677 (2018).</li><li>Tse, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction:+Measuring+synapse+size,+fragmentation+and+changes+in+synaptic+protein+density+using+confocal+fluorescence+microscopy.">The neuromuscular junction: Measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52220 (2014).</li><li>Mejia Maza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMJ-Analyser+identifies+subtle+early+changes+in+mouse+models+of+neuromuscular+disease.">NMJ-Analyser identifies subtle early changes in mouse models of neuromuscular disease.</a> Scientific Reports. 11 (1), 12251 (2021).</li><li>Minty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aNMJ-morph:+a+simple+macro+for+rapid+analysis+of+neuromuscular+junction+morphology.">aNMJ-morph: a simple macro for rapid analysis of neuromuscular junction morphology.</a> Royal Society Open Science. 7 (4), 200128 (2020).</li><li>Modla, S., Mendonca, J., Czymmek, K. J., Akins, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neuromuscular+junctions+by+correlative+confocal+and+transmission+electron+microscopy.">Identification of neuromuscular junctions by correlative confocal and transmission electron microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 191 (2), 158-165 (2010).</li><li>Kittel, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+promotes+active+zone+assembly,+Ca2++channel+clustering,+and+vesicle+release.">Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release.</a> Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).</li><li>York, A. L., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+a+nanoscale+organization+of+acetylcholine+receptors+for+trans-synaptic+alignment+at+neuromuscular+synapses.">Super-resolution microscopy reveals a nanoscale organization of acetylcholine receptors for trans-synaptic alignment at neuromuscular synapses.</a> eNeuro. 4 (4), (2017).</li><li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology.">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (3), 263-276 (2012).</li><li>Feng, G., Krejci, E., Molgo, J., Cunningham, J. M., Massouli&#233;, J., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+collagen+Q:+Roles+in+acetylcholinesterase+and+butyrylcholinesterase+assembly+and+in+synaptic+structure+and+function.">Genetic analysis of collagen Q: Roles in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase assembly and in synaptic structure and function.</a> Journal of Cell Biology. 144 (6), 1349-1360 (1999).</li><li>Sigoillot, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+immaturity+and+muscle+atrophy+are+hallmarks+of+the+ColQ-deficient+mouse,+a+model+of+congenital+myasthenic+syndrome+with+acetylcholinesterase+deficiency.">Neuromuscular junction immaturity and muscle atrophy are hallmarks of the ColQ-deficient mouse, a model of congenital myasthenic syndrome with acetylcholinesterase deficiency.</a> The FASEB Journal. 30 (6), 2382-2399 (2016).</li><li>Vanhaesebrouck, A. E., Beeson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+congenital+myasthenic+syndromes:+expanding+genetic+and+phenotypic+spectrums+and+refining+treatment+strategies.">The congenital myasthenic syndromes: expanding genetic and phenotypic spectrums and refining treatment strategies.</a> Current Opinion in Neurology. 32 (5), 696-703 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Legland, D., Beaugrand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+clustering+of+lignocellulosic+fibres+based+on+morphometric+features+and+using+clustering+of+variables.">Automated clustering of lignocellulosic fibres based on morphometric features and using clustering of variables.</a> Industrial Crops and Products. 45, 253-261 (2013).</li><li>. GitHUb Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/Genethon/ImCy">https://github.com/Genethon/ImCy</a> (2021)</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">A Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction,+assembly,+maturation+and+maintenance+of+a+postsynaptic+apparatus.">Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus.</a> Nature Reviews Neuroscience. 2 (11), 791-805 (2001).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+synaptic+vesicle+release+and+immaturity+of+neuromuscular+junctions+in+spinal+muscular+atrophy+mice.">Impaired synaptic vesicle release and immaturity of neuromuscular junctions in spinal muscular atrophy mice.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (3), 842-851 (2009).</li><li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Human Molecular Genetics. 11 (12), 1439-1447 (2002).</li><li>Murray, L. M., Comley, L. H., Thomson, D., Parkinson, N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 17 (7), 949-962 (2008).</li><li>Boyer, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+program+dysregulation+is+contributory+to+disease+pathogenesis+in+spinal+muscular+atrophy.">Myogenic program dysregulation is contributory to disease pathogenesis in spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 23 (16), 4249-4259 (2014).</li><li>Ling, K. K. Y., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 21 (1), 185-195 (2012).</li><li>Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+transversus+abdominis+muscle+for+whole-mount+neuromuscular+junction+analysis.">Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51162 (2014).</li><li>Baker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , (1958).</li><li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+Nanoscopy+with+time-gated+detection:+Theoretical+and+experimental+aspects.">STED Nanoscopy with time-gated detection: Theoretical and experimental aspects.</a> PLoS ONE. 8 (1), 054421 (2013).</li><li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses.">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).</li><li>Thomson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characteristics+of+motor+neurons+do+not+determine+their+relative+susceptibility+to+degeneration+in+a+mouse+model+of+severe+spinal+muscular+atrophy.">Morphological characteristics of motor neurons do not determine their relative susceptibility to degeneration in a mouse model of severe spinal muscular atrophy.</a> PLoS ONE. 7 (12), 052605 (2012).</li><li>McMacken, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salbutamol+modifies+the+neuromuscular+junction+in+a+mouse+model+of+ColQ+myasthenic+syndrome.">Salbutamol modifies the neuromuscular junction in a mouse model of ColQ myasthenic syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 28 (14), 2339-2351 (2019).</li></ol>

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذا العمل.

يوفر بروتوكول الفيديو الموصوف طريقة مفصلة لتحديد بنية 3D للتقاطعات العصبية العضلية من خلال الجمع بين الفحص المجهري البؤري و STED الذي يمكن استخدامه لتوصيف التغيرات المرضية على مستويات ما قبل وبعد المشبكي. تسمح الدقة العالية للفحص المجهري STED بالتصور والتحليل المورفومتري للهياكل النانوية التي لا يمكن التعرف عليها عن طريق التصوير البؤري التقليدي. مكننا هذا الإجراء من قياس التغيرات الهيكلية ل NMJs في عضلتين زائديتين ، الظنبوب الأمامي والساقي ، من SMA وفئران CMS المرتبطة ب ColQ.
للحصول على نتائج موثوقة مع هذه التقنية ، من الأهمية بمكان تشريح العضلات وإغاظتها بشكل صحيح ، مع إيلاء اهتمام خاص للفافة المحيطة بالعضلات والقوة المطبقة لفصل حزم العضلات. خلاف ذلك ، يمكن أن يتعطل نمط التعصيب مما يعوق تقييم NMJ المناسب قبل المشبكي. على الرغم من توفير معلومات مفصلة لتحليل NMJs من TA و GA ، من حيث المبدأ ، يمكن تكييف هذا البروتوكول مع العضلات الأخرى ، بما في ذلك العضلات المسطحة ، مثل الحجاب الحاجز أو البطنالمستعرض 37 ، والتي لا تتطلب خطوة الإغاظة. تثبيت الأنسجة أمر بالغ الأهمية أيضا لضمان تلطيخ ذات نوعية جيدة. لذلك ، يوصى باستخدام PFA عالي الجودة بحجم مناسب (15-20 مرة من العضلات). بالإضافة إلى ذلك ، يعد وقت التعرض للمثبت خطوة مهمة لأن القطع الأثرية ، مثل الانكماش والتكتل ، قد تظهر بسبب التثبيت الزائد والتأثير على ميزات NMJ. بالنظر إلى حجم العينات ومعدل تغلغل محلول بارافورمالدهيد في الأنسجة38 ، يوصى بوقت تثبيت 18-24 ساعة لهذا النوع من العضلات. في حالة التخطيط لخطوة التلوين بعد أكثر من أسبوع من حصاد الأنسجة ، يقترح الحفاظ على عضلات PFA الثابتة في PBS مكملة بأزيد الصوديوم عند 4 درجات مئوية لمنع انتشار البكتيريا.
يقدم هذا البروتوكول نهجا يستخدم α-BTX-F488 للبؤر و α-BTX-F633 للتصوير STED. تم اختيار هذه الفلوروفورات لتتناسب مع التصميم التجريبي الموصوف ولكن يمكن تعديلها وفقا للمعدات والمواد المتاحة. على سبيل المثال ، يمكن تحديد ملصق α-BTX F488 عند استخدام ليزر STED CW 592 nm للحصول على الصور وقياسها. ومع ذلك ، يبدو أن التكوين الذي تم تطبيقه في الدراسة الحالية (STED ذو بوابات الإثارة النبضية ، استنفاد 775 نانومتر) يظهر أداء أعلى ودقة أفضل من الأساليب الأخرى ، مثل الموجة المستمرة STED39 ، مما يجعلها أكثر ملاءمة للتطبيق الحالي. من المهم أيضا تحديد إعدادات طاقة الليزر بعناية ، خاصة بالنسبة ل STED (كل من الإثارة والنضوب) ، حيث لا يمكن قياس خصائص ملف تعريف الشدة في حالة التشبع ، وبالتالي فإن أي إشارة مشبعة في صورة NMJ يمكن أن تعرض التحليل بأكمله للخطر.
تم تطوير سير العمل التفصيلي هذا ، بما في ذلك الحصول على الصور وتحليلها باستخدام برنامج المجهر ووحدات ماكرو ImageJ ، لتسهيل التحليل المورفومتري NMJ المستقل عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر و STED من عضلة واحدة. مهدت تدفقات العمل الموصوفة سابقا للتحليل البؤري NMJ ، مثل NMJ-morph2 أو NMJ-Analyzer14 ، الطريق لتصميم طرق شبه آلية تسهل التحليل المورفولوجي ل NMJs والدراسات المقارنة. NMJ-morph (ونسخته المحدثة aNMJ-morph15) عبارة عن منصة مجانية قائمة على ImageJ تستخدم إسقاط الكثافة القصوى لقياس 21 ميزة مورفولوجية ، ويستخدم NMJ-Analyzer نصا تم تطويره في Python يولد 29 معلمة ذات صلة من بنية 3D NMJ بأكملها. العتبة اليدوية هي الخطوة الوحيدة أثناء معالجة الصور في هاتين الطريقتين اللتين تتطلبان تحليل المستخدم. يفصل هذا البروتوكول المتكامل خطوات تحضير الأنسجة ، واكتساب الصور متحدة البؤر 3D ، والمعالجة القائمة على ImageJ ل NMJs من عضلات الهيكل العظمي بأكملها ويوفر نظرة عامة مبسطة على خمسة معلمات مهمة لما بعد المشبكي (الحجم ، منطقة الإسقاط القصوى ، والالتواء) و presynaptic (الإشغال المحوري الطرفي وتراكم الخيوط العصبية) الصفائح النهائية. تم دمج معلمة إضافية ذات أهمية بيولوجية ، وهي نمط تنظيم AChR للطيات الموصلية بعد المشبكية ، للتحليل المورفومتري على المستوى النانوي بواسطة الفحص المجهري STED فائق الدقة (الدقة 20-30 نانومتر)40. ومن المثير للاهتمام ، أن تحضير الأنسجة لتصوير STED أبسط من الطرق الأخرى المستخدمة في دراسات البنية التحتية NMJ ، مثل المجهر الإلكتروني التقليدي (TEM)9 ، وهو إجراء معقد إلى حد ما ويستغرق وقتا طويلا ويتطلب مناورا ماهرا من أجل الحصول على أقسام فائقة النحافة من منطقة العضلات المناسبة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الحصول على البيانات الكمية من طيات وصلات متعددة تلقائيا باستخدام البرنامج المرتبط ب STED.
تم تطبيق هذا البروتوكول لتوضيح عيوب NMJs المعروفة سابقا في العضلات الناقصة SMN و ColQ20،36،41،42. تم العثور على تغييرات شائعة في نموذجي الفئران عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر ، مثل انخفاض حجم الصفيحة الطرفية بعد المشبكي ، ومنطقة MIP ، والالتواء النسبي ، وزيادة تراكم الخيوط العصبية ، في حين أن بعض النتائج الأكثر تحديدا (انخفاض إشغال NMJ) ، لوحظت فقط في الفئران SMA ، كمؤشر على ضعف الاتجار بالحويصلات36. أخيرا ، تم الكشف عن زيادة في مسافة وعرض شريط AChR في ColQ-KO بواسطة تحليل STED ، وهي علامات على وجود عيوب هيكلية فائقة في طيات الوصلات بعد المشبكية ، كما لوحظ سابقا بواسطة TEM20. الأهم من ذلك ، قد يساعد هذا البروتوكول في توصيف مورفولوجي أكثر تعمقا للتقاطعات العصبية العضلية أثناء التطوير والصيانة وتحت ظروف مرضية مختلفة.

الوصلة العصبية العضلية (NMJ) عبارة عن بنية معقدة تتكون من طرف محوري حركي ، وخلية شوان حول المشبكي ، وجزء من الألياف العضلية الهيكلية يشارك في نقل المعلومات الكيميائية واقتران نشاط الخلايا العصبية الحركية السفلية بتقلص العضلات. في الثدييات ، يتغير مورفولوجيا الوصلة العصبية العضلية أثناء التطور ، ويتخذ شكلا نموذجيا يشبه البسكويت المملح بعد النضج ، مع وجود اختلافات في الشكل والتعقيد بين الأنواع ، ويظهر درجة معينة من اللدونة استجابة للعمليات الفسيولوجية مثل التمرين أو الشيخوخة1،2،3،4 . تشكل الصفيحة الطرفية الحركية بعد المشبكية غزوات غشائية تسمى الطيات الموصلية ، حيث يكون الجزء العلوي الذي يحتوي على مستقبلات الأسيتيل كولين (AChR) على اتصال وثيق بفرع المحور المحوري الطرفي قبل المشبكي5.
تساهم التغيرات المورفولوجية والوظيفية في الوصلات العصبية العضلية في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من الاضطرابات التنكسية العصبية مثل ضمور العضلات الشوكي (SMA) والتصلب الجانبي الضموري (ALS) ، والاعتلالات العضلية مثل الحثل العضلي الدوشيني (DMD) ، ومتلازمات الوهن العضلي الخلقي (CMS) ، والوهن العضلي الوبيل (MG) والاعتلالات العضلية المركزية (CNM) ، والساركوبينيا المرتبطة بالشيخوخة3،6،7،8،9 ، 10،11،12. في هذه الأمراض ، لوحظت تغيرات هيكلية NMJ مثل تجزئة الصفيحة الطرفية ، وانخفاض حجم طية الوصلة بعد المشبكية و / أو إزالة التعصيب. يمكن أن يكون علم أمراض NMJs حدثا أوليا أو مبكرا أثناء تطور المرض أو يظهر مؤخرا كحدث ثانوي يساهم في المظاهر السريرية. على أي حال ، فإن مراقبة مورفولوجيا NMJs في النماذج الحيوانية لهذه الأمراض تمثل معلمة قيمة لدراسة التغيرات المرضية وتقييم فعالية العلاجات المحتملة.
عادة ما يتم تحليل مورفولوجيا الوصلات العصبية العضلية من خلال التقنيات التي تستخدم المجهر متحد البؤر2،13،14،15 أو المجهر الإلكتروني5،16 ، مع قيودها المتأصلة مثل الدقة أو الصعوبات التقنية ، على التوالي. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام الفحص المجهري فائق الدقة أيضا لتصور مناطق معينة من NMJ ، مثل المناطق النشطة قبل المشبكية أو توزيع AChR على الغشاء بعد المشبكي16،17،18 ، كنهج بديل أو تكميلي للتحليل البنيوي الفائق بواسطة المجهر الإلكتروني.
يهدف هذا البروتوكول إلى توفير طريقة مفصلة وقابلة للتكرار لتقييم المعلمات المورفولوجية NMJ من خلال الجمع بين الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر ومستنفد الانبعاثات المحفز (STED). تم تحديد السمات المهمة للصفائح الطرفية قبل المشبكية وما بعد المشبكية ، مثل الحجم والمساحة والتعرج النسبي وعرض شريط AChR والتوزيع الطرفي المحوري في ألياف العضلات المعصبة من الساق الساقي و tibialis الأمامي في سياق الظروف الطبيعية والمريضة. على وجه الخصوص ، تم تجسيد عيوب NMJ في نموذج Smn 2B / - للفأر لضمور العضلات الشوكي ، وهو مرض عصبي عضلي مع تنكس الخلايا العصبية الحركية الناجم عن طفرات في جين SMN1 11,19 ، وفي وحدة فرعية من ذيل يشبه الكولاجين من فئران أستيل كولينستراز غير المتماثلة (ColQ Dex2 / Dex2 أو ColQ-KO) ، كنموذج لمتلازمة الوهن العضلي الخلقي 20 ، 21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Buffers and Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 &#945;-bungarotoxin (F488-a-BTX)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>B13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATTO-633 &#945;-bungarotoxin (F633-a-BTX)</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-100-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS</td>
			<td>Gibco, Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol Absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion Oil, n = 1.518</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>MOIL-10LF&#160;</td>
			<td>Low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurofilament (NF-M) antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_531793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.04005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_2315387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alnico Button cylindrical magnets</td>
			<td>Farnell France</td>
			<td>E822</td>
			<td>diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >63x 1.4 NA magnitude oil immersion&#160; HCX Plan Apo CS objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Curved thin forceps-Moria iris forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra thin scissors - Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15-003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel loading tip round 1-200 &#181;L</td>
			<td>COSTAR</td>
			<td>4853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue&#160;</td>
			<td>Whatman (GE Healthcare)</td>
			<td>2105-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170&#177;5 &#181;m</td>
			<td>Marienfield</td>
			<td>107222</td>
			<td>High precision</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (12-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (24-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safeshield scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.40.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost plus slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GraphPad&#160;</td>
			<td>Prism, San Diego (US)</td>
			<td>Release N&#176;6.07</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Release N&#176; 1.53f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Release N&#176;3.7.2.2283</td>
			<td >Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy

الوصلات العصبية العضلية (NMJs) هي نقاط اشتباك عصبي عالية التخصص بين الخلايا العصبية الحركية السفلية وألياف العضلات الهيكلية التي تلعب دورا أساسيا في نقل الجزيئات من الجهاز العصبي إلى العضلات الإرادية ، مما يؤدي إلى الانقباض. تتأثر بالعديد من الأمراض البشرية ، بما في ذلك الاضطرابات العصبية العضلية الموروثة مثل ضمور العضلات دوشين (DMD) ، ومتلازمات الوهن العضلي الخلقي (CMS) ، وضمور العضلات الشوكي (SMA) ، والتصلب الجانبي الضموري (ALS). لذلك ، فإن مراقبة مورفولوجيا الوصلات العصبية العضلية وتغييراتها في نماذج الفئران المرضية تمثل أداة قيمة للدراسات المرضية والتقييم قبل السريري للنهج العلاجية. هنا ، يتم وصف طرق وضع العلامات وتحليل التشكل ثلاثي الأبعاد (3D) للأجزاء قبل وبعد المشبكي من الألواح الطرفية الحركية من ألياف العضلات المثارة بالفئران. تم تفصيل إجراءات تحضير العينات وقياس حجم NMJ والمساحة والتعرج ومورفولوجيا / إشغال المحطة المحورية عن طريق التصوير متحد البؤر ، والمسافة بين طيات الوصلة بعد المشبكية وعرض شريط مستقبلات الأسيتيل كولين (AChR) بواسطة الفحص المجهري لاستنفاد الانبعاثات المحفزة فائقة الدقة (STED). يتم توضيح التعديلات في معلمات NMJ هذه في الفئران الطافرة المتأثرة ب SMA و CMS.

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

يصف هذا البروتوكول طريقة للتحليل المورفومتري للوصلات العصبية العضلية عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر و STED المشترك الذي يستخدم لتحديد التغيرات المرضية في نماذج الفئران من SMA و ColQ-related CMS.

توصيف الوصلات العصبية العضلية في الفئران عن طريق الفحص المجهري المتحدي البؤري والفائق الدقة

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

يساعد هذا البروتوكول على التحليل الكمي لبنية 3D للوصلات العصبية العضلية بدقة قريبة من المجهر الإلكتروني باستخدام إجراء بسيط. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أن عينات العضلات تتم معالجتها بشكل مشابه وموسومة مناعيا للفحص المجهري متحد البؤر و STED ، مما يقلل من الوقت اللازم لتقييم بنية الوصلة العصبية العضلية الدقيقة في النماذج الحيوانية. يمكن تكييف القياس الكمي المورفولوجي الذي طورناه بسهولة لتحليل الهياكل تحت الخلوية الأخرى.إنه لمن دواعي سروري أن أقدم الدكتورة مارتينا مارينيلو ، عالمة من فريقي ستوضح كيفية إجراء إغاظة العضلات وتلطيخ المناعة وتقديم بعض التوصيات للتطبيق الناجح لهذا البروتوكول. يسعدني أن أقدم الدكتور جيريمي كوزيت من منصة التصوير في Genethon الذي سيعرض الحصول على الصور وتحليلها باستخدام المجاهر متحدة البؤر و STED. بعد القتل الرحيم ، ابدأ في إغاظة عضلات الظنبوب الأمامية في حزم ألياف صغيرة يبلغ عرضها حوالي ملليمتر واحد باستخدام ملقطين مسنين دقيقين.بعد ذلك ، انقل حزم العضلات هذه إلى صفيحة مكونة من 24 بئرا تحتوي على 1٪ Triton X-100 محضرة في PBS واتركها تهيج بلطف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو خمس ساعات عند أربع درجات مئوية. بعد غسل العينات ثلاث مرات لمدة خمس دقائق باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة ، قم باحتضان العينات بمحلول مانع يتكون من 4٪ BSA محضر في PBS مع 1٪ Triton X-100 لمدة أربع ساعات عند أربع درجات مئوية تحت تحريض لطيف. بعد ذلك ، احتضان العينات طوال الليل بنفس محلول الحجب الذي يحتوي على أجسام مضادة أولية وحيدة النسيلة ضد الخيوط العصبية M أو البروتين السكري الحويصلي المشبكي 2 لتسمية نهايات المحور العصبي قبل المشبكي أو المناطق النشطة ، على التوالي.في اليوم التالي ، اغسل حزم العضلات المصنفة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق باستخدام PBS تحت التحريض اللطيف. بعد ذلك ، احتضنها بأجسام مضادة ثانوية مناسبة عن طريق وضعها على شاكر لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل حزم العضلات مرة أخرى ، ضعها على شريحة مع وسيط التركيب.بعد ذلك ، ضع غطاء زجاجي بدرجة 1.5 درجة على الجزء العلوي ، متبوعا بمغناطيس أسطواني على جانبي الشريحة للضغط وتسطيح العضلات. للحصول على الصور باستخدام المجهر متحد البؤر ، قم بتشغيل برنامج المجهر واختر الجهاز كوضع تكوين وجمع أكوام الصور للتقاطعات العصبية العضلية في كل مجموعة تجريبية وفقا للإعدادات المذكورة في مخطوطة النص. في نهاية الجلسة ، انقر فوق فتح في عارض ثلاثي الأبعاد واختر ممثل تقاطع عصبي عضلي لمجموعة تجريبية لتصور وضع العلامات ثلاثية الأبعاد.لحساب الوصلة العصبية العضلية بعد المشبكي وحجم اللوحة ، ومنطقة إسقاط الكثافة القصوى ، والتعرج النسبي ، اسحب الماكرو وأفلته لتحديد حجم الوصلة العصبية العضلية إلى نافذة Image J ، وعندما يفتح الماكرو في نافذة ثانية ، انقر فوق وحدات الماكرو وتشغيل الماكرو. حدد المجلد الأصلي الذي يحتوي على المجلدات الفرعية للتقاطع المراد تحليلها وانقر فوق تحديد. ثم ، في القائمة المنبثقة لمجلد الحفظ ، حدد مجلد التخزين وانقر فوق تحديد.في القائمة المنبثقة الجديدة المسماة نوع الصورة، حدد تنسيق عمليات الاستحواذ على مكدس Z. حدد قناة RGB المقابلة لتلطيخ الاهتمام وحدد حجم X و Y بكسل وخطوة Z. إذا تم تحديد تنسيقات ملفات خاصة ، فإن الماكرو يقرأ مباشرة حجم البكسل والخطوة Z.لتحديد تراكم الخيوط العصبية قبل المشبكي ، اسحب الماكرو وأفلته لتحديد كمية تراكم الوصلة العصبية العضلية إلى نافذة Image J ، وانقر فوق وحدات الماكرو وتشغيل الماكرو. حدد المجلدات الفرعية للوصلة ومجلد التخزين وتنسيق عمليات الاستحواذ على مكدس Z كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، في النافذة المنبثقة Staining Infos ، أشر إلى التسمية واللون قبل المشبكي وما بعد المشبكي وانقر فوق OK.In النافذة المنبثقة Pixel Size ، وحدد حجم البكسل X ، Y على أنه 0.072 ميكرومتر ، والخطوة Z على أنها 0.5 ميكرومتر ، وانقر فوق موافق. إذا تم تحديد تنسيقات ملفات خاصة ، فإن الماكرو يقرأ مباشرة حجم البكسل والخطوة Z.لحساب المسافة بين خطوط مستقبلات الأسيتيل كولين ، حدد قائمة Quantify أعلى النافذة المركزية. انقر فوق علامة التبويب أدوات ، وحدد الكثافة ، وانقر على أيقونة ملف تعريف الخط. اضبط أخذ العينات الزائدة على واحدة وحدد فرز القنوات.انقر فوق علامة التبويب Open Projects وحدد الصورة التي تمت تصفيتها ليتم تحليلها. ثم ، انقر فوق رمز خط الرسم وتتبع خطا يتقاطع بشكل عمودي عدة خطوط أو طيات وصلة. انقر فوق الجزء العلوي من القمة الأولى وحرك مؤشر الماوس أثناء الضغط على زر الماوس الأيسر حتى يتم الوصول إلى القمة القصوى التالية.لاحظ قيمة DX ، والتي تتوافق مع المسافة بين القمتين. انقر بزر الماوس الأيمن على الماوس أثناء وجودك في صورة النافذة اليمنى وحدد حفظ عائد الاستثمار. بعد النقر على أيقونة السهم ، انقر فوق عائد الاستثمار واحذفه بالنقر فوق رمز bin.لحساب عرض شريط مستقبلات الأسيتيل كولين ، حدد الكثافة في اللوحة العلوية اليسرى ضمن علامة التبويب الأدوات ، وانقر فوق رمز تحديد FWHM ، وحدد قنوات الفرز. ثم انقر فوق علامة التبويب فتح المشاريع وحدد الصورة التي تمت تصفيتها ليتم تحليلها. بعد ذلك ، انقر فوق رمز رسم المستطيل في القائمة العلوية للنافذة اليمنى.حدد شريطا أفقيا أو رأسيا وارسم مستطيلا بشكل عمودي على الشريط. يظهر ملف تعريف في النافذة المركزية. انقر فوق رأسي أو أفقي من قائمة متوسط العرض الموجودة في اللوحة اليمنى ، اعتمادا على ما إذا كان اتجاه الشريط رأسيا أو أفقيا.انقر فوق الإحصائيات في النافذة المركزية لقراءة قيمة FWHM ثم احفظ وحذف عائد الاستثمار كما هو موضح سابقا. بدت لوحة نهاية المحرك بعد المشبكي ، الموسومة ب alpha-Bungarotoxin الفلورية ، أصغر حجما ومجزأة في طفرات خطين من الفئران. كشف القياس الكمي لمداخن الوصلة العصبية العضلية Z باستخدام وحدات ماكرو Image J المخصصة عن انخفاض ملحوظ في حجم اللوحة الطرفية ، وإسقاط الكثافة القصوى ، والتعرج النسبي في كلا نموذجي فأر المرض مقارنة بعناصر التحكم ، مما يشير إلى عيوب نضج الوصلة العصبية العضلية.كشف القياس الكمي لتوزيع فرع المحور المحوري قبل المشبكي باستخدام الماكرو المخصص Image J عن نمط متغير في توزيع الخيوط العصبية M في النموذجين الحيوانيين مع زيادة وضع العلامات المناعية. من خلال تلطيخ البروتين السكري الحويصلي المشبكي 2 ، لوحظ انخفاض بنسبة 43٪ في نسبة إشغال المناطق المحتوية على مستقبلات الأسيتيل كولين مع المناطق النشطة الطرفية العصبية المجاورة في Smn 2B / الفئران. تم تصور جانب لوحات نهاية ما بعد المشبكي للوصلة العصبية العضلية بوضوح من خلال وضع العلامات على السموم الفلورية ألفا بونجاروتوكسين وتحليل ملف تعريف الشدة.كشف تقييم معلمات الوصلة العصبية العضلية عن زيادة في مسافة الطيات الموصلة وعرض خطوط مستقبلات الأسيتيل كولين في عضلة الساق للمتحولات. للحصول على نتائج موثوقة ، من الضروري ندف العضلات بشكل صحيح ، مع إيلاء اهتمام خاص للقوة المطبقة لفصل حزم العضلات. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في الحصول على توصيف مورفولوجي أكثر تعمقا للوصلة العصبية العضلية ، والتي كانت تحسب في السابق فقط من خلال إجراءات معقدة وتستغرق وقتا طويلا ، مثل المجهر الإلكتروني النافذ.مهد إجراء التصوير STED الطريق للتحقيق في رؤى جديدة تتعلق بعلامات ما قبل وبعد المشبكي ، والتي تساهم في الفيزيولوجيا المرضية للأمراض التي تؤثر على الموصل العصبي العضلي.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

متحد البؤر التصوير الطيفي من المستقبلات النيكوتينية الموسومة Fluorescently في نوك في الفئران مع الإدارة النيكوتين المزمن

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

فائقة الدقة التصوير من الخلايا العصبية الحويصلات كثيفة الأساسية

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

على الموصل العصبي العضلي: قياس المشبك الحجم، التغييرات تجزئة ومتشابك الكثافة البروتين عن طريق متحد البؤر مضان المجهر

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

بروتوكول للثلاثي الأبعاد متحد البؤر تحليل المظهرية من النجمية

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

لماذا الكمي المسائل: توصيف الظواهر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات عصبي عضلي مفرق

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

خارج الخلية تسجيل النشاط العصبية جنبا إلى جنب مع Microiontophoretic تطبيق المواد Neuroactive في الفئران مستيقظا

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

العصب الشظية الإصابات الطريقة: مقايسة موثوقة لتحديد واختبار العوامل التي إصلاح العضلية المفارق

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

أثار الإجهاد خلية والموت عن طريق التقليدية للأشعة فوق البنفسجية ليزر متحد البؤر المجهر

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

والتصور وتصوير مباشر من العضيات أوليجوديندروسيتي في المخ أورجانوتيبيك الشرائح باستخدام الفيروسات المرتبطة بالغدد والفحص المجهري [كنفوكل]

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

التصوير فائق الدقة لدراسة التعريب المشترك للبروتينات وعلامات متشابك في الخلايا العصبية الأولية

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...