Name: characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy
Uploaded: 2021-12-08T13:00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Vi takker Genethons "Imaging and Cytometry Core Facility" samt histologitjenesten, som delvist støttes af udstyrsmidler fra Region Ile-de-France, Conseil General de l'Essonne, Genopole Recherche of Evry, University of Evry Val d'Essonne og INSERM, Frankrig. Vi er også taknemmelige for Dr. Rashmi Kothary for at levere Smn 2B / 2B muselinjen (University of Ottawa, Canada) og Dr. Eric Krejci til ColQDex2 / + muselinjen (ikke offentliggjort, University of Paris, Frankrig). Vi takker Guillaume Corre for hans støtte til statistisk analyse. 2H3 (udviklet af Jessel, T.M. og Dodd, J.) og SV2 (udviklet af Buckley, K.M.) monoklonale antistoffer blev opnået fra Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), oprettet af NICHD i NIH og vedligeholdt ved University of Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242. Dette arbejde blev støttet af Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon), INSERM og University of Evry Val d'Essonne.

<ol>
	<li>Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+nerve-muscle+junctions+in+hindlimb+muscles+of+the+mouse.">Postnatal maturation of nerve-muscle junctions in hindlimb muscles of the mouse.</a> Developmental Biology. 94 (1), 11-22 (1982).</li><li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMJ-morph+reveals+principal+components+of+synaptic+morphology+influencing+structure-function+relationships+at+the+neuromuscular+junction.">NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction.</a> Open Biology. 6 (12), (2016).</li><li>Willadt, S., Nash, M., Slater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+the+structure+and+function+of+mammalian+neuromuscular+junctions.">Age-related changes in the structure and function of mammalian neuromuscular junctions.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1412, 41-53 (2018).</li><li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li><li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease.">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li><li>Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+as+a+distal+axonopathy:+molecular+mechanisms+affecting+neuromuscular+junction+stability+in+the+presymptomatic+stages+of+the+disease.">ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, (2014).</li><li>Lovering, R. M., Iyer, S. R., Edwards, B., Davies, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+neuromuscular+junctions+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Alterations of neuromuscular junctions in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuroscience Letters. 737, 135304 (2020).</li><li>Koneczny, I., Herbst, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+Gravis:+Pathogenic+effects+of+autoantibodies+on+neuromuscular+architecture.">Myasthenia Gravis: Pathogenic effects of autoantibodies on neuromuscular architecture.</a> Cells. 8 (7), 671 (2019).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubular+myopathy+and+the+neuromuscular+junction:+a+novel+therapeutic+approach+from+mouse+models.">Myotubular myopathy and the neuromuscular junction: a novel therapeutic approach from mouse models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 5 (6), 852-859 (2012).</li><li>Gibbs, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+abnormalities+in+DNM2-related+centronuclear+myopathy.">Neuromuscular junction abnormalities in DNM2-related centronuclear myopathy.</a> Journal of Molecular Medicine. 91 (6), 727-737 (2013).</li><li>Swoboda, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+denervation+in+SMA:+Relation+to+age,+SMN2+copy+number,+and+function.">Natural history of denervation in SMA: Relation to age, SMN2 copy number, and function.</a> Annals of Neurology. 57 (5), 704-712 (2005).</li><li>Rodr&#237;guez Cruz, P. M., Palace, J., Beeson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction+and+wide+heterogeneity+of+congenital+myasthenic+syndromes.">The neuromuscular junction and wide heterogeneity of congenital myasthenic syndromes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1677 (2018).</li><li>Tse, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction:+Measuring+synapse+size,+fragmentation+and+changes+in+synaptic+protein+density+using+confocal+fluorescence+microscopy.">The neuromuscular junction: Measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52220 (2014).</li><li>Mejia Maza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMJ-Analyser+identifies+subtle+early+changes+in+mouse+models+of+neuromuscular+disease.">NMJ-Analyser identifies subtle early changes in mouse models of neuromuscular disease.</a> Scientific Reports. 11 (1), 12251 (2021).</li><li>Minty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aNMJ-morph:+a+simple+macro+for+rapid+analysis+of+neuromuscular+junction+morphology.">aNMJ-morph: a simple macro for rapid analysis of neuromuscular junction morphology.</a> Royal Society Open Science. 7 (4), 200128 (2020).</li><li>Modla, S., Mendonca, J., Czymmek, K. J., Akins, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neuromuscular+junctions+by+correlative+confocal+and+transmission+electron+microscopy.">Identification of neuromuscular junctions by correlative confocal and transmission electron microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 191 (2), 158-165 (2010).</li><li>Kittel, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+promotes+active+zone+assembly,+Ca2++channel+clustering,+and+vesicle+release.">Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release.</a> Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).</li><li>York, A. L., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+a+nanoscale+organization+of+acetylcholine+receptors+for+trans-synaptic+alignment+at+neuromuscular+synapses.">Super-resolution microscopy reveals a nanoscale organization of acetylcholine receptors for trans-synaptic alignment at neuromuscular synapses.</a> eNeuro. 4 (4), (2017).</li><li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology.">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (3), 263-276 (2012).</li><li>Feng, G., Krejci, E., Molgo, J., Cunningham, J. M., Massouli&#233;, J., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+collagen+Q:+Roles+in+acetylcholinesterase+and+butyrylcholinesterase+assembly+and+in+synaptic+structure+and+function.">Genetic analysis of collagen Q: Roles in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase assembly and in synaptic structure and function.</a> Journal of Cell Biology. 144 (6), 1349-1360 (1999).</li><li>Sigoillot, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+immaturity+and+muscle+atrophy+are+hallmarks+of+the+ColQ-deficient+mouse,+a+model+of+congenital+myasthenic+syndrome+with+acetylcholinesterase+deficiency.">Neuromuscular junction immaturity and muscle atrophy are hallmarks of the ColQ-deficient mouse, a model of congenital myasthenic syndrome with acetylcholinesterase deficiency.</a> The FASEB Journal. 30 (6), 2382-2399 (2016).</li><li>Vanhaesebrouck, A. E., Beeson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+congenital+myasthenic+syndromes:+expanding+genetic+and+phenotypic+spectrums+and+refining+treatment+strategies.">The congenital myasthenic syndromes: expanding genetic and phenotypic spectrums and refining treatment strategies.</a> Current Opinion in Neurology. 32 (5), 696-703 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Legland, D., Beaugrand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+clustering+of+lignocellulosic+fibres+based+on+morphometric+features+and+using+clustering+of+variables.">Automated clustering of lignocellulosic fibres based on morphometric features and using clustering of variables.</a> Industrial Crops and Products. 45, 253-261 (2013).</li><li>. GitHUb Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/Genethon/ImCy">https://github.com/Genethon/ImCy</a> (2021)</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">A Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction,+assembly,+maturation+and+maintenance+of+a+postsynaptic+apparatus.">Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus.</a> Nature Reviews Neuroscience. 2 (11), 791-805 (2001).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+synaptic+vesicle+release+and+immaturity+of+neuromuscular+junctions+in+spinal+muscular+atrophy+mice.">Impaired synaptic vesicle release and immaturity of neuromuscular junctions in spinal muscular atrophy mice.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (3), 842-851 (2009).</li><li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Human Molecular Genetics. 11 (12), 1439-1447 (2002).</li><li>Murray, L. M., Comley, L. H., Thomson, D., Parkinson, N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 17 (7), 949-962 (2008).</li><li>Boyer, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+program+dysregulation+is+contributory+to+disease+pathogenesis+in+spinal+muscular+atrophy.">Myogenic program dysregulation is contributory to disease pathogenesis in spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 23 (16), 4249-4259 (2014).</li><li>Ling, K. K. Y., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 21 (1), 185-195 (2012).</li><li>Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+transversus+abdominis+muscle+for+whole-mount+neuromuscular+junction+analysis.">Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51162 (2014).</li><li>Baker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , (1958).</li><li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+Nanoscopy+with+time-gated+detection:+Theoretical+and+experimental+aspects.">STED Nanoscopy with time-gated detection: Theoretical and experimental aspects.</a> PLoS ONE. 8 (1), 054421 (2013).</li><li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses.">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).</li><li>Thomson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characteristics+of+motor+neurons+do+not+determine+their+relative+susceptibility+to+degeneration+in+a+mouse+model+of+severe+spinal+muscular+atrophy.">Morphological characteristics of motor neurons do not determine their relative susceptibility to degeneration in a mouse model of severe spinal muscular atrophy.</a> PLoS ONE. 7 (12), 052605 (2012).</li><li>McMacken, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salbutamol+modifies+the+neuromuscular+junction+in+a+mouse+model+of+ColQ+myasthenic+syndrome.">Salbutamol modifies the neuromuscular junction in a mouse model of ColQ myasthenic syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 28 (14), 2339-2351 (2019).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter i forbindelse med dette arbejde.

Den beskrevne videoprotokol giver en detaljeret metode til at kvantificere 3D-strukturen af neuromuskulære kryds ved at kombinere konfokal og STED-mikroskopi, der kan bruges til at karakterisere patologiske ændringer på præ- og postsynaptiske niveauer. Den høje opløsning af STED-mikroskopi muliggør visualisering og morfometrisk analyse af nanostrukturer, der ikke kan identificeres ved konventionel konfokal billeddannelse. Denne procedure gjorde det muligt for os at måle strukturelle ændringer af NMJ'er i to appendikulære muskler, tibialis anterior og gastrocnemius, af SMA og ColQ-relaterede CMS-mus.
For at opnå pålidelige resultater med denne teknik er det vigtigt at dissekere og drille musklerne ordentligt og være særlig opmærksom på fasciaen omkring musklen og den anvendte styrke til at adskille muskelbundter; Ellers kan innerveringsmønsteret forstyrres, hvilket hindrer korrekt præsynaptisk NMJ-vurdering. Selvom der gives detaljerede oplysninger til at analysere NMJ'er fra TA og GA, kan denne protokol i princippet tilpasses andre muskler, herunder flade muskler, såsom membranen eller tværgående abdominis37, som ikke kræver drilletrinnet. Vævsfiksering er også afgørende for at sikre farvning af god kvalitet; derfor anbefales det at anvende PFA af høj kvalitet i et passende volumen (15-20 gange musklens). Derudover er eksponeringstiden for fikseringsmidlet et vigtigt skridt, fordi artefakter, såsom krympning og klumpning, kan forekomme på grund af overfiksering og indflydelse på NMJ-funktioner. I betragtning af prøvernes størrelse og penetrationshastigheden for paraformaldehydopløsningen i væv38 anbefales en fikseringstid på 18-24 timer til denne type muskel. Hvis farvningstrinnet planlægges mere end en uge efter vævshøst, foreslås det at holde PFA-faste muskler i PBS suppleret med natriumazid ved 4 °C for at forhindre bakteriel spredning.
Denne protokol præsenterer en tilgang, der bruger α-BTX-F488 til konfokal og α-BTX-F633 til STED-billeddannelse. Disse fluorophorer blev valgt til at passe til det beskrevne eksperimentelle design, men kan ændres i henhold til det tilgængelige udstyr og materialer. For eksempel kan α-BTX F488-mærkning vælges, når du bruger en STED CW 592 nm laser til billedoptagelse og kvantificering. Det ser imidlertid ud til, at den konfiguration, der blev anvendt i denne undersøgelse (pulserende excitation gated STED, 775 nm udtømning) udviser højere ydeevne og bedre opløsning end andre tilgange, såsom kontinuerlig bølge STED39, hvilket gør den mere egnet til den aktuelle anvendelse. Det er også vigtigt omhyggeligt at vælge lasereffektindstillingerne, især for STED (både excitation og udtømning), da egenskaberne ved en intensitetsprofil ikke kan måles i tilfælde af mætning, og derfor kan ethvert mættet signal i et NMJ-billede bringe hele analysen i fare.
Denne detaljerede arbejdsgang, herunder billedanskaffelser og analyse ved hjælp af mikroskopsoftware og ImageJ-makroer, blev udviklet til at lette autonom NMJ-morfometrisk analyse ved konfokal og STED-mikroskopi fra en enkelt muskel. Tidligere beskrevne arbejdsgange for NMJ konfokal analyse, såsom NMJ-morph2 eller NMJ-Analyser14, banede vejen for design af halvautomatiske metoder, der letter morfologisk analyse af NMJ'er og komparative undersøgelser. NMJ-morph (og dens opdaterede version aNMJ-morph15) er en gratis ImageJ-baseret platform, der bruger den maksimale intensitetsprojektion til at måle 21 morfologiske funktioner, og NMJ-Analyser bruger et script udviklet i Python, der genererer 29 relevante parametre fra hele 3D NMJ-strukturen. Manuel tærskel er det eneste trin under billedbehandling i disse to metoder, der kræver brugeranalyse. Denne integrerede protokol beskriver trin til vævsforberedelse, 3D-konfokale billedopkøb og ImageJ-baseret behandling af NMJ'er fra hele skeletmuskler og giver et forenklet overblik over fem vigtige parametre for de postsynaptiske (volumen, maksimalt projektionsområde og tortuositet) og præsynaptiske (axonterminal belægning og neurofilamentakkumulering) endeplader. En yderligere parameter af biologisk relevans, AChR-organisationsmønsteret for de postsynaptiske junctional folds, blev indarbejdet til morfometrisk analyse på nanoskalaniveau ved superopløsning STED-mikroskopi (opløsning 20-30 nm)40. Interessant nok er vævsforberedelse til STED-billeddannelse enklere end andre metoder, der anvendes til NMJ-ultrastrukturelle undersøgelser, såsom konventionel transmissionselektronmikroskopi (TEM)9, hvilket er en ret kompleks og tidskrævende procedure, der kræver en dygtig manipulator for at opnå ultratynde sektioner af den passende muskelregion. Derudover kan kvantitative data fra flere krydsningsfolder opnås automatisk ved hjælp af den STED-tilknyttede software.
Denne protokol blev anvendt til at illustrere tidligere kendte NMJs defekter i SMN og ColQ mangelfulde muskler 20,36,41,42. Almindelige ændringer blev fundet i de to musemodeller ved konfokal mikroskopi, såsom nedsat postsynaptisk endepladevolumen, MIP-område og relativ tortuositet og øget neurofilamentakkumulering, mens nogle mere specifikke fund (nedsat NMJ-belægning) kun blev observeret hos SMA-mus som en indikator for nedsat vesiklerhandel36. Endelig blev en stigning i AChR-stribeafstand og bredde detekteret i ColQ-KO ved STED-analyse, som er tegn på ultrastrukturelle defekter i de postsynaptiske forbindelsesfolder, som tidligere observeret af TEM20. Det er vigtigt, at denne protokol kan hjælpe med en mere dybtgående morfologisk karakterisering af neuromuskulære kryds under udvikling, vedligeholdelse og under forskellige patologiske forhold.

Det neuromuskulære kryds (NMJ) er en kompleks struktur sammensat af en motoraxonterminal, en perisynaptisk Schwann-celle og en skeletmyofiberdel involveret i transmission af kemisk information og kobling af lavere motorneuronaktivitet til muskelkontraktion. Hos pattedyr ændres morfologien af det neuromuskulære kryds under udviklingen og vedtager en typisk kringlelignende form efter modning med forskelle i form og kompleksitet mellem arter og viser en vis grad af plasticitet som reaktion på fysiologiske processer såsom motion eller aldring 1,2,3,4 . Den postsynaptiske motoriske endeplade danner membraninvaginationer kaldet junctional folder, hvor den øverste del indeholdende acetylcholinreceptorer (AChR) er i tæt kontakt med den presynaptiske terminale axongren5.
Morfologiske og funktionelle ændringer i neuromuskulære kryds bidrager til patofysiologien af flere neurodegenerative lidelser såsom spinal muskelatrofi (SMA) og amyotrofisk lateral sklerose (ALS), myopatier som Duchenne muskeldystrofi (DMD), medfødte myastheniske syndromer (CMS), myasthenia gravis (MG) og centronukleære myopatier (CNM) og aldringsassocieret sarkopeni 3,6,7,8,9, 10,11,12. I disse sygdomme observeres NMJ strukturelle ændringer såsom endepladefragmentering, reduceret postsynaptisk junctional foldstørrelse og / eller denervation. NMJ'ernes patologi kan være en primær eller tidlig begivenhed under sygdomsprogression eller forekomme mere for nylig som en sekundær begivenhed, der bidrager til de kliniske manifestationer. Under alle omstændigheder udgør overvågning af morfologien af NMJ'er i dyremodeller af disse sygdomme en værdifuld parameter til at studere patologiske ændringer og vurdere effekten af potentielle behandlinger.
Morfologien af neuromuskulære kryds analyseres normalt ved hjælp af teknikker ved hjælp af konfokal mikroskopi 2,13,14,15 eller elektronmikroskopi 5,16 med deres iboende begrænsninger såsom henholdsvis opløsning eller tekniske vanskeligheder. For nylig blev superopløsningsmikroskopi også brugt til at visualisere bestemte regioner i NMJ, såsom præsynaptiske aktive zoner eller AChR-distribution på den postsynaptiske membran16,17,18, som en alternativ eller komplementær tilgang til ultrastrukturel analyse ved elektronmikroskopi.
Denne protokol har til formål at tilvejebringe en detaljeret og reproducerbar metode til vurdering af NMJ morfologiske parametre ved at kombinere fluorescens konfokal og stimuleret emissionsudtømning (STED) mikroskopi. Vigtige træk ved de præsynaptiske og postsynaptiske endeplader, såsom volumen, areal, relativ tortuositet, AChR-stribebredde og axonterminalfordeling i innerverede drillede muskelfibre af musegastrocnemius og tibialis anterior blev kvantificeret i forbindelse med normale og syge tilstande. NMJ-defekter blev især eksemplificeret i Smn2B/- musemodellen af spinal muskelatrofi, en neuromuskulær sygdom med motorneurondegeneration forårsaget af mutationer i SMN1-genet11,19 og i en kollagenlignende haleunderenhed af asymmetriske acetylcholinesterase knockout (ColQ Dex2/Dex2 eller ColQ-KO) mus, som en model af det medfødte myastheniske syndrom20, 21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Buffers and Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 &#945;-bungarotoxin (F488-a-BTX)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>B13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATTO-633 &#945;-bungarotoxin (F633-a-BTX)</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-100-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS</td>
			<td>Gibco, Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol Absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion Oil, n = 1.518</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>MOIL-10LF&#160;</td>
			<td>Low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurofilament (NF-M) antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_531793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.04005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_2315387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alnico Button cylindrical magnets</td>
			<td>Farnell France</td>
			<td>E822</td>
			<td>diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >63x 1.4 NA magnitude oil immersion&#160; HCX Plan Apo CS objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Curved thin forceps-Moria iris forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra thin scissors - Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15-003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel loading tip round 1-200 &#181;L</td>
			<td>COSTAR</td>
			<td>4853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue&#160;</td>
			<td>Whatman (GE Healthcare)</td>
			<td>2105-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170&#177;5 &#181;m</td>
			<td>Marienfield</td>
			<td>107222</td>
			<td>High precision</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (12-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (24-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safeshield scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.40.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost plus slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GraphPad&#160;</td>
			<td>Prism, San Diego (US)</td>
			<td>Release N&#176;6.07</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Release N&#176; 1.53f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Release N&#176;3.7.2.2283</td>
			<td >Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy

Neuromuskulære kryds (NMJ'er) er højt specialiserede synapser mellem lavere motorneuroner og skeletmuskelfibre, der spiller en væsentlig rolle i transmissionen af molekyler fra nervesystemet til frivillige muskler, hvilket fører til sammentrækning. De er påvirket i mange menneskelige sygdomme, herunder arvelige neuromuskulære lidelser såsom Duchenne muskeldystrofi (DMD), medfødte myastheniske syndromer (CMS), spinal muskelatrofi (SMA) og amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Derfor er overvågning af morfologien af neuromuskulære kryds og deres ændringer i sygdomsmusemodeller et værdifuldt værktøj til patologiske undersøgelser og præklinisk vurdering af terapeutiske tilgange. Her beskrives metoder til mærkning og analyse af den tredimensionelle (3D) morfologi af de præ- og postsynaptiske dele af motoriske endeplader fra murine drillede muskelfibre. Procedurerne til fremstilling af prøver og måling af NMJ-volumen, areal, tortuositet og axonterminal morfologi / belægning ved konfokal billeddannelse og afstanden mellem postsynaptiske junctional folder og acetylcholinreceptor (AChR) stribebredde ved superopløsningsstimuleret emissionsudtømning (STED) mikroskopi er detaljerede. Ændringer i disse NMJ-parametre er illustreret i mutante mus, der er påvirket af SMA og CMS.

For at lette den morfologiske analyse af neuromuskulære kryds på præ- og postsynaptisk niveau på en reproducerbar måde blev der udviklet en arbejdsgang fra muskelhøst til billeddannelse og kvantificering ved hjælp af mikroskopsoftwaren og ImageJ brugerdefinerede makroer (figur 1). For at eksemplificere nytten af denne protokol blev morfologien af NMJ'er i to musemodeller af genetiske lidelser, Smn2B / - og ColQDex2 mus påvirket af henholdsvis spinal muskelatrofi (SMA) og en medfødt myasthenisk syndrom (CMS) form, evalueret, og data blev sammenlignet med aldersmatchede kontrolkuldkammerater.
NMJ-strukturen blev vurderet ud fra tibialis anterior- og gastrocnemius-muskler i henholdsvis 3- og 6 uger gamle Smn2B/- (C57Bl/6-baggrund) og ColQ Dex2/Dex2 (B6D2F1/J-baggrund), når der allerede er tegn på sygdommen hos disse dyr. Ved 3 ugers alderen viser Smn2B/- mus tegn på forsinket skeletmuskeludvikling og denervation, såsom NMJ-atrofi og tab35,36. CMS-mus har en primær patologi i NMJ'er og manifesterer en reduktion i kropsvægt fra den første uge af livet og markant muskelsvaghed20 (data ikke vist). Som vist i figur 2A syntes den postsynaptiske motorendeplade mærket med fluorescerende α-bungarotoxin mindre og/eller fragmenteret i mutanter af de to muselinjer ved konfokal mikroskopi. Kvantificering af NMJ Z-stakke ved hjælp af denne tilpassede ImageJ-makro afslørede markante fald i endepladevolumen, maksimal intensitetsprojektion (MIP) og relativ tortuositet hos både SMA- og CMS-mus sammenlignet med kontroller, som tegn på NMJ-modningsfejl32 (figur 2B-D). Postsynaptisk slutpladevolumen og MIP blev nedsat hos syge dyr (foldændring på 2,7 og 2,0 for volumen og 2,5 og 2,0 for MIP i henholdsvis Smn2B/- og ColQ Dex2/Dex2 mus). Den relative tortuositet var også mindre i SMN- og ColQ-mangelfulde muskler end WT (16,97% ± 1,33% i SMA versus 48,84% ± 5,90% WT-mus og 13,29% ± 2,79% i CMS versus 30,20% ± 4,44% kontrolmus). Derudover afslørede kvantificeringen af fordelingen af præsynaptiske axonterminalgrene ved hjælp af ImageJ brugerdefinerede makro et ændret mønster i neurofilament M-fordeling i de to dyremodeller med øget immunmærkning (84,65% ± 0,32% versus 16,57% ± 2,03% og 23,64% ± 2,78% versus 18,77% ± 1,73% i henholdsvis Smn2B/- og ColQ Dex2/Dex2 mus sammenlignet med kontroller) (figur 3A-D ). Ved SV2-farvning blev der også observeret en 43% reduktion i belægningsforholdet, dvs. procent af AChR-holdige regioner med tilstødende nerveterminale aktive zoner, i Smn2B / - mus (49,36% ± 3,76% i SMA versus 85,69% ± 2,34% WT-mus) (figur 3E, F). Denne NMJ-parameter blev også beregnet i GA for ColQ Dex2/Dex2-mutanter, men der blev ikke fundet nogen statistisk signifikant forskel sammenlignet med kontrolkuldkammerater (data ikke vist).
Vi analyserede yderligere postsynaptiske membranegenskaber ved at kvantificere afstanden mellem krydsningsfolder og bredden af AChR-striber, som er placeret ved toppen af disse folder, i ColQ-mangelfuld muskel ved hjælp af superopløsningsstimuleret emissionsudtømning (STED) mikroskopi. Som vist i figur 4 kan aspektet af disse strukturer tydeligt visualiseres ved fluorescerende α-bungarotoxin mærkning og intensitetsprofilanalyse. Vi evaluerede disse NMJ-parametre og fandt en stigning i krydsningsfoldafstanden (d) og bredden (w) af AChR-striber i gastrocnemiusmusklen hos mutanter (358,3 nm ± 11,97 nm og 320,8 nm ± 10,90 nm for afstanden og 216,9 nm ± 10,51 nm og 186,3 nm ± 7,015 nm for bredden i ColQ Dex2/Dex2 sammenlignet med vildtypemus, henholdsvis p < 0,05) (figur 4C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig01.jpg"> Figur 1: Flowchart af videoprotokollen til 3D multiscale NMJ-karakterisering ved konfokal og STED-mikroskopi. Tibialis anterior (TA) og gastrocnemius (GA) muskler blev indsamlet fra mus, og muskelfibre blev drillet før mærkning med α-bungarotoxin-F488 eller α-bungarotoxin-F633, DAPI, primære antistoffer rettet mod neurofilament M (NF-M) og synaptisk vesikel glycoprotein 2 (SV2) og fluorophore (F488 eller F594) -konjugerede sekundære antistoffer. Billedstakke blev erhvervet ved konfokal mikroskopi og behandlet til måling af postsynaptisk NMJ-volumen, præsynaptisk NF-M-akkumulering, NMJ-axonterminalbelægning, postsynaptisk maksimal intensitetsprojektion (MIP) endepladeområde og tortuositet (d Obj (AB) er afstanden mellem A og B langs objektets omkreds (rød linje), mens dEuc (AB) er den euklidiske afstand mellem A og B (grøn linje)). Til STED-mikroskopianalyse blev bredden af acetylcholinreceptor (AChR) striber og afstanden mellem krydsningsfolder kvantificeret fra intensitetsprofiler af α-BTX-F633-farvning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig02.jpg"> Figur 2: Multi-parameter postsynaptisk NMJ-karakterisering i musemodeller af spinal muskelatrofi (SMA) og ColQ-relateret medfødt myasthenisk syndrom (CMS). (A) Repræsentative billeder af postsynaptiske motoriske endeplader fra TA- og GA-muskler mærket med α-bungarotoxin-F488 (α-BTX). (B) Kvantificering af NMJ postsynaptisk endepladevolumen, (C) maksimal intensitetsprojektion (MIP) areal og (D) relativ tortuositet i TA af 3 uger gamle vildtype (WT) og Smn2B /- mus (venstre grafer, N = 3 dyr pr. genotype, n = 37 og n = 56 NMJ'er) og 6 uger gamle WT og ColQ Dex2/Dex2 mus (højre grafer, N = 5 mus pr. genotype, henholdsvis n = 89 og n = 97 NMJ'er). Data udtrykkes som middelværdien pr. mus (prik) ± SEM. Forskelle mellem grupper blev analyseret ved Mann-Whitney-test (* p < 0,05). Skalabjælken er 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig03.jpg"> Figur 3: Morfometrisk analyse af presynaptisk axonterminalfordeling i muskler hos WT og mutante mus. NMJ innerveringsmønster i tibialis anterior (TA) og gastrocnemius (GA) muskler af vildtype, SMA og ColQ-relaterede CMS-mus. (A, B) Repræsentative neuromuskulære kryds fra TA af WT- og Smn2B/- mus ved 21 dages alderen mærket med antistoffer mod neurofilament M (NF-M, rød) og α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, grøn) (A) og resultater fra kvantitativ analyse af neurofilamentakkumulering (B); (C, D) Repræsentative neuromuskulære kryds fra GA af 6 uger gamle WT- og ColQDex2/Dex2-mus mærket med antistoffer mod neurofilament M (NF-M, rød) og α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, grøn), der viser fragmenterede og umodne postsynaptiske endeplader (C) og resultater af neurofilamentakkumulering i de to grupper af dyr (D). N= 4 (n = 34 NMJs) (B) og N = 3 (n = 54 NMJs) (D) WT dyr, og N = 3 (n = 36 NMJs) Smn2B / - og N = 3 (n = 55 NMJs) ColQ Dex2 / Dex2 mus blev analyseret i forsøgene (B, D). (E, F) Repræsentative billeder af axonterminalbelægning i NMJ'er fra TA af 3 uger gamle WT- og Smn2B/- mus mærket med antistoffer mod synaptisk vesikelglycoprotein 2 (SV2, rød) og α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, grøn) (E) og resultater af NMJ-belægning (SV2/AChR-volumenforhold) (F). Muskler fra N = 3 (n = 50 NMJs) vildtype og N = 4 (n = 62 NMJs) Smn2B /- mus blev analyseret. Data udtrykkes som middelværdien pr. mus (prik) ± SEM. Forskelle mellem grupper blev analyseret ved Mann-Whitney-test (* p < 0,05). Skalastænger er 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig04.jpg"> Figur 4: STED-billeddannelse af NMJ postsynaptiske slutplader. (A) Repræsentativt STED-billede af en NMJ mærket med α-bungarotoxin-F633 (α-BTX) fra gastrocnemius af en 6 uger gammel vildtypemus, der viser postjunctional AChR-striber (skalabjælken er 5 μm). (B) Højere forstørrelse af et område med AChR-striber (bundpanel), der blev brugt til at generere intensitetsprofilen. Bredden (w) af AChR-striber og afstanden mellem to tilstødende striber (d) i denne region blev kvantificeret og præsenteret i søjlediagrammet. Skematisk gengivelse af den postsynaptiske endeplade for at illustrere AChR-stribebredde (w) og afstand (d). Disse parametre, (C) AChR stribeafstand og (D) bredde, blev målt i ColQ Dex2/Dex2 mus og kontrolkuldkammerater ved 6 ugers alderen. NMJ'er fra 5 WT (i alt n = 29 NMJ'er) og 6 ColQ Dex2/Dex2 (i alt n = 43 NMJ'er) dyr blev analyseret blindt. Data udtrykkes som middelværdien pr. mus (prik) ± SEM. Statistiske forskelle mellem grupper blev analyseret ved hjælp af Mann-Whitney-testen (* p < 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende figur 1: Lancering af LAS X-software og parametre for confocal acquisitions. De forskellige trin til erhvervelse af konfokale billeder er beskrevet i afsnit 3.1.2 til 3.1.7 i protokollen. For hver NMJ-stakanskaffelse åbnes et projekt (trin 3.1.4), og parametrene billedstørrelse, anskaffelseshastighed, X-, Y- og Z-akser vælges (trin 3.1.7), hvor hver sekventiel scanning er angivet (Seq.1, laser 405 til DAPI; Seq.2, laser 488 til α-BTX-F488; og Seq.3, laser 552 til F594 konjugerede sekundære antistoffer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 2: Lancering af LAS X-software og parametre for STED-opkøb. Trinene til erhvervelse af STED-billeder er beskrevet i afsnit 3.2.2 til 3.2.8 i protokollen. Mikroskopet startes i konfigurationstilstand STED ON (trin 3.2.2), og et projekt åbnes (trin 3.2.3). Parametrene for billedoptagelse (trin 3.2.7) (billedstørrelse, anskaffelseshastighed, zoomfaktor, X-akse) med hver sekventiel scanning er angivet (Seq.1 for α-BTX-F633; Seq.2 for F488 konjugerede sekundære antistoffer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%202.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 3: Billeder af α-BTX-farvede krydsfolder opnået ved STED-mikroskopi. Billedeksempler på en postsynaptisk slutplade mærket med α-BTX-F633 fra en 6 uger gammel vildtypemus, der blev erhvervet med enten et korrekt (venstre) eller forkert fokus (højre). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%203.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 4: Windows-pop op-vinduer til beskrivelse af input- og outputdata, der er opnået af de brugerdefinerede ImageJ-makroer. Inputdataeksempler (.tif- og .lif-filer) på NMJ-billeder vises i venstre kolonne. Outputdataene fra makroerne (højre kolonne) gemmes i mapper (Save_Volume, Save_Accu), der indeholder billeder af krydset (.tif) og datablade, der indeholder resultaterne (.csv filer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%204.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 5: AChR-stribeafstands- og breddeanalyse fra en STED-anskaffelse ved hjælp af LAS X-softwaren. Trinene til analyse af NMJ STED-billeder er beskrevet i afsnit 5 i protokollen. A) Billede af et mærket postsynaptisk endepladeområde indeholdende AChR-striber. Interesseområdet for stribeanalyse vælges ved at tegne en vinkelret linje (grøn linje, for stribeafstand) eller et vinkelret rektangel (lilla rektangel, for stribebredde). (B, C) Intensitetsprofiler for de valgte regioner og målinger til beregning af afstanden mellem AChR-striber (B) og AChR-stribebredde (C) vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%205.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende kodningsfil 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. ImageJ brugerdefineret makro til at udtrække NMJ-parametermålinger (NMJ-volumen, MIP-endepladeområde og NMJ-tortuositet). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende kodningsfil 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. ImageJ brugerdefineret makro til udpakning af NF-M-akkumulering og SV2-farvning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Denne protokol beskriver en metode til morfometrisk analyse af neuromuskulære kryds ved kombineret konfokal og STED-mikroskopi, der bruges til at kvantificere patologiske ændringer i musemodeller af SMA og ColQ-relateret CMS.

Karakterisering af neuromuskulære kryds i mus ved kombineret konfokal og superopløsningsmikroskopi

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Denne protokol hjælper kvantitativt med at analysere 3D-strukturen af neuromuskulære kryds ved en opløsning tæt på elektronmikroskopi ved hjælp af en simpel procedure. Den største fordel ved denne protokol er, at muskelprøver behandles på samme måde og immunmærkes til konfokal og STED-mikroskopi, hvilket reducerer tiden for nøjagtig neuromuskulær krydsstrukturevaluering i dyremodeller. Den morfologiske kvantificering, som vi udviklede, kan let tilpasses til at analysere andre subcellulære strukturer.Det er mig en fornøjelse at introducere Dr.Martina Marinello, en videnskabsmand fra mit team, der vil vise, hvordan muskeldrilleri og immunostainings udføres og give nogle anbefalinger til en vellykket anvendelse af denne protokol. Jeg er glad for at introducere Dr.Jeremie Cosette fra Genethons billedbehandlingsplatform, der vil vise billedoptagelse og analyse ved hjælp af konfokale og STED-mikroskoper. Efter aflivning skal du begynde at drille tibialis forreste muskler i små fiberbundter på cirka en millimeter bred ved hjælp af to fine savtakkede tang.Overfør derefter disse muskelbundter til en 24-brøndsplade indeholdende 1% Triton X-100 fremstillet i PBS og lad den forsigtigt omrøre i en time ved stuetemperatur eller fem timer ved fire grader Celsius. Efter vask af prøverne tre gange i fem minutter med PBS ved stuetemperatur inkuberes prøverne med en blokerende opløsning bestående af 4% BSA fremstillet i PBS med 1% Triton X-100 i fire timer ved fire grader Celsius under blid omrøring. Derefter inkuberes prøverne natten over med den samme blokerende opløsning indeholdende primære monoklonale antistoffer mod enten neurofilament M eller synaptisk vesikelglycoprotein 2 for at mærke henholdsvis præsynaptiske axonterminaler eller aktive zoner.Den følgende dag vaskes de mærkede muskelbundter tre gange i fem minutter med PBS under blid omrøring. Derefter inkuberes dem med passende sekundære antistoffer ved at placere dem på en ryster i to timer ved stuetemperatur. Når du har vasket muskelbundterne igen, skal du placere dem på et dias med monteringsmedium.Placer derefter en 1,5-grade glasdæksel på toppen, efterfulgt af cylindriske magneter på begge sider af diaset for at lægge pres og flade musklerne. For at erhverve billeder ved hjælp af det konfokale mikroskop skal du starte mikroskopsoftwaren og vælge maskine som konfigurationstilstand og indsamle billedstakke af de neuromuskulære kryds i hver eksperimentel gruppe i henhold til de indstillinger, der er nævnt i tekstmanuskriptet. I slutningen af sessionen skal du klikke på Åbn i 3D-fremviser og vælge et neuromuskulært kryds, der er repræsentativt for en eksperimentel gruppe for at visualisere 3D-mærkningen.For at beregne postsynaptisk neuromuskulær kryds og pladevolumen, maksimal intensitetsprojektionsområde og relativ tortuositet skal du trække og slippe makroen til neuromuskulær krydsvolumenkvantificering til Image J-vinduet, og når makroen åbnes i et andet vindue, skal du klikke på Makroer og Kør makro. Vælg den oprindelige mappe, der indeholder de krydsundermapper, der skal analyseres, og klik på Vælg. Vælg derefter lagringsmappen i pop op-menuen gemmemappe, og klik på Vælg.I den nye pop op-menu kaldet Billedtype skal du vælge formatet for Z-stakanskaffelserne. Vælg den RGB-kanal, der svarer til farvningen af interesse, og angiv X, Y-pixelstørrelse og Z-trin. Hvis der vælges proprietære filformater, læser makroen direkte pixelstørrelse og Z-trin.For at kvantificere præsynaptisk neurofilamentakkumulering skal du trække og slippe makroen til neuromuskulær krydsakkumuleringskvantificering til Image J-vinduet og klikke på Makroer og Kør makro. Vælg forbindelsesundermapper, lagermappe og formatet for Z-stakanskaffelserne som vist tidligere. I pop op-vinduet Farveinfos skal du derefter angive den præsynaptiske og postsynaptiske etiket og farve og klikke på OK.In pop op-vinduet Pixelstørrelse, angive X, Y-pixelstørrelse som 0.072 mikrometer, Z-trinnet som 0.5 mikrometer, og klik på OK. Hvis der vælges proprietære filformater, læser makroen direkte pixelstørrelse og Z-trin.For at beregne afstanden mellem acetylcholin receptor striber, vælg Quantify menuen øverst i det centrale vindue. Klik på fanen Værktøjer, vælg intensitet, og klik på linjeprofilikonet. Indstil Oversampling til én, og marker Sortér kanaler.Klik på fanen Åbn projekter, og vælg det filtrerede billede, der skal analyseres. Klik derefter på tegnelinjeikonet og spor en linje, der krydser vinkelret flere striber eller krydsningsfolder. Klik på toppen af den første top, og flyt musemarkøren, mens du trykker på venstre museknap, indtil den næste maksimale top er nået.Bemærk DX-værdien, som svarer til afstanden mellem de to toppe. Højreklik på musen, mens du er i billedet af højre vindue, og vælg Gem ROI'er. Når du har klikket på pilikonet, skal du klikke på ROI og slette det ved at klikke på bin-ikonet.For at beregne acetylcholinreceptorstribens bredde skal du vælge intensitet i øverste venstre panel under fanen Værktøjer, klikke på ikonet Bestem FWHM og markere sorteringskanalerne. Klik derefter på fanen Åbn projekter, og vælg det filtrerede billede, der skal analyseres. Klik derefter på tegnerektangelikonet i topmenuen i højre vindue.Vælg en stribe, der enten er vandret eller lodret, og tegn et rektangel vinkelret på striben. Der vises en profil i det centrale vindue. Klik på enten lodret eller vandret i menuen Gennemsnitlig projektion i venstre panel, afhængigt af om striberetningen er lodret eller vandret.Klik på Statistik i det centrale vindue for at læse FWHM-værdien, og gem og slet derefter ROI'erne som vist tidligere. Den postsynaptiske motorendeplade, mærket med fluorescerende alfa-bungarotoxin, syntes mindre og fragmenteret i mutanterne af to muselinjer. Kvantificering af de neuromuskulære junction Z-stakke ved hjælp af de tilpassede Image J-makroer afslørede et markant fald i slutpladevolumenet, maksimal intensitetsprojektion og relativ tortuositet i begge sygdomsmusemodeller sammenlignet med kontroller, hvilket indikerer neuromuskulære junction modningsdefekter.Kvantificering af den presynaptiske axonterminalgrenfordeling ved hjælp af Image J brugerdefinerede makro afslørede et ændret mønster i neurofilament M-distribution i de to dyremodeller med øget immunmærkning. Gennem synaptisk vesikel glycoprotein 2 farvning, en 43% reduktion i belægningsgraden af acetylcholin receptor-holdige regioner med tilstødende nerve terminal aktive zoner blev observeret i Smn 2B / mus. Aspektet af de neuromuskulære junction postsynaptiske endeplader blev tydeligt visualiseret ved fluorescerende alfa-bungarotoxin mærkning og intensitetsprofilanalyse.Evaluering af de neuromuskulære krydsparametre afslørede en stigning i den junctional foldafstand og bredde af acetylcholinreceptorstriber i mutanternes gastrocnemiusmuskel. For at opnå pålidelige resultater er det afgørende at drille musklerne ordentligt og være særlig opmærksom på den anvendte styrke til at adskille muskelbundter. Denne protokol kan hjælpe med at opnå en mere dybtgående morfologisk karakterisering af neuromuskulært kryds, som tidligere kun blev redegjort for ved komplekse og tidskrævende procedurer, såsom transmissionselektronmikroskopi.STED-billeddannelsesproceduren banede vejen for undersøgelse af nye indsigter vedrørende præ- og postsynaptiske markører, som bidrager til patofysiologien af sygdomme, der påvirker neuromuskulært kryds.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Spektral konfokal afbildning af Fluorescerende mærkede nikotinreceptorer i Knock-i mus med kronisk Nikotin Administration

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-opløsning Imaging af neuronale Dense-core blærer

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Den neuromuskulære forbindelse: Måling Synapse Størrelse, fragmentering og ændringer i Synaptic Protein Density Brug Konfokal Fluorescens mikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokol til tredimensionel Konfokal Morfometrisk Analyse af Astrocytter

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Hvorfor Kvantificering Matters: Karakterisering af fænotyper på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Neuromuskulær Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Ekstracellulær Registrering af neuronal aktivitet Kombineret med Microiontophoretic Anvendelse af Neuroaktive stoffer i Awake mus

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

Den fibular nerveskade Metode: En pålidelig analyse til at identificere og Test faktorer, Reparation neuromuskulære forbindelse

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Udløsning Cell Stress and Death anvendelse af konventionelle UV laser konfokal mikroskopi

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisering og Live Imaging af Oligodendrocyte organeller i Organotypic hjerne skiver ved hjælp af Adeno-associeret Virus og konfokal mikroskopi

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Super-resolution Imaging at studere co-lokalisering af proteiner og synaptiske markører i primære neuroner

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...