Name: characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy
Uploaded: 2021-12-08T13:00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

We danken Genethon's "Imaging and Cytometry Core Facility", evenals de histologiedienst, die gedeeltelijk worden ondersteund door apparatuurfondsen van de regio Ile-de-France, de Conseil General de l'Essonne, de Genopole Recherche van Evry, de Universiteit van Evry Val d'Essonne en de INSERM, Frankrijk. We zijn ook Dr. Rashmi Kothary dankbaar voor het leveren van de Smn2B/2B muislijn (Universiteit van Ottawa, Canada) en Dr. Eric Krejci voor de ColQDex2/+ muislijn (ongepubliceerd, Universiteit van Parijs, Frankrijk). Wij danken Guillaume Corre voor zijn steun bij de statistische analyse. De 2H3 (ontwikkeld door Jessel, T.M. en Dodd, J.) en SV2 (ontwikkeld door Buckley, K.M.) monoklonale antilichamen werden verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), gemaakt door de NICHD van de NIH en onderhouden aan de Universiteit van Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242. Dit werk werd ondersteund door de Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon), het INSERM en de Universiteit van Evry Val d'Essonne.

<ol>
	<li>Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+nerve-muscle+junctions+in+hindlimb+muscles+of+the+mouse.">Postnatal maturation of nerve-muscle junctions in hindlimb muscles of the mouse.</a> Developmental Biology. 94 (1), 11-22 (1982).</li><li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMJ-morph+reveals+principal+components+of+synaptic+morphology+influencing+structure-function+relationships+at+the+neuromuscular+junction.">NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction.</a> Open Biology. 6 (12), (2016).</li><li>Willadt, S., Nash, M., Slater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+the+structure+and+function+of+mammalian+neuromuscular+junctions.">Age-related changes in the structure and function of mammalian neuromuscular junctions.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1412, 41-53 (2018).</li><li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li><li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease.">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li><li>Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+as+a+distal+axonopathy:+molecular+mechanisms+affecting+neuromuscular+junction+stability+in+the+presymptomatic+stages+of+the+disease.">ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, (2014).</li><li>Lovering, R. M., Iyer, S. R., Edwards, B., Davies, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+neuromuscular+junctions+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Alterations of neuromuscular junctions in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuroscience Letters. 737, 135304 (2020).</li><li>Koneczny, I., Herbst, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+Gravis:+Pathogenic+effects+of+autoantibodies+on+neuromuscular+architecture.">Myasthenia Gravis: Pathogenic effects of autoantibodies on neuromuscular architecture.</a> Cells. 8 (7), 671 (2019).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubular+myopathy+and+the+neuromuscular+junction:+a+novel+therapeutic+approach+from+mouse+models.">Myotubular myopathy and the neuromuscular junction: a novel therapeutic approach from mouse models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 5 (6), 852-859 (2012).</li><li>Gibbs, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+abnormalities+in+DNM2-related+centronuclear+myopathy.">Neuromuscular junction abnormalities in DNM2-related centronuclear myopathy.</a> Journal of Molecular Medicine. 91 (6), 727-737 (2013).</li><li>Swoboda, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+denervation+in+SMA:+Relation+to+age,+SMN2+copy+number,+and+function.">Natural history of denervation in SMA: Relation to age, SMN2 copy number, and function.</a> Annals of Neurology. 57 (5), 704-712 (2005).</li><li>Rodr&#237;guez Cruz, P. M., Palace, J., Beeson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction+and+wide+heterogeneity+of+congenital+myasthenic+syndromes.">The neuromuscular junction and wide heterogeneity of congenital myasthenic syndromes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1677 (2018).</li><li>Tse, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction:+Measuring+synapse+size,+fragmentation+and+changes+in+synaptic+protein+density+using+confocal+fluorescence+microscopy.">The neuromuscular junction: Measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52220 (2014).</li><li>Mejia Maza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMJ-Analyser+identifies+subtle+early+changes+in+mouse+models+of+neuromuscular+disease.">NMJ-Analyser identifies subtle early changes in mouse models of neuromuscular disease.</a> Scientific Reports. 11 (1), 12251 (2021).</li><li>Minty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aNMJ-morph:+a+simple+macro+for+rapid+analysis+of+neuromuscular+junction+morphology.">aNMJ-morph: a simple macro for rapid analysis of neuromuscular junction morphology.</a> Royal Society Open Science. 7 (4), 200128 (2020).</li><li>Modla, S., Mendonca, J., Czymmek, K. J., Akins, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neuromuscular+junctions+by+correlative+confocal+and+transmission+electron+microscopy.">Identification of neuromuscular junctions by correlative confocal and transmission electron microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 191 (2), 158-165 (2010).</li><li>Kittel, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+promotes+active+zone+assembly,+Ca2++channel+clustering,+and+vesicle+release.">Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release.</a> Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).</li><li>York, A. L., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+a+nanoscale+organization+of+acetylcholine+receptors+for+trans-synaptic+alignment+at+neuromuscular+synapses.">Super-resolution microscopy reveals a nanoscale organization of acetylcholine receptors for trans-synaptic alignment at neuromuscular synapses.</a> eNeuro. 4 (4), (2017).</li><li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology.">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (3), 263-276 (2012).</li><li>Feng, G., Krejci, E., Molgo, J., Cunningham, J. M., Massouli&#233;, J., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+collagen+Q:+Roles+in+acetylcholinesterase+and+butyrylcholinesterase+assembly+and+in+synaptic+structure+and+function.">Genetic analysis of collagen Q: Roles in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase assembly and in synaptic structure and function.</a> Journal of Cell Biology. 144 (6), 1349-1360 (1999).</li><li>Sigoillot, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+immaturity+and+muscle+atrophy+are+hallmarks+of+the+ColQ-deficient+mouse,+a+model+of+congenital+myasthenic+syndrome+with+acetylcholinesterase+deficiency.">Neuromuscular junction immaturity and muscle atrophy are hallmarks of the ColQ-deficient mouse, a model of congenital myasthenic syndrome with acetylcholinesterase deficiency.</a> The FASEB Journal. 30 (6), 2382-2399 (2016).</li><li>Vanhaesebrouck, A. E., Beeson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+congenital+myasthenic+syndromes:+expanding+genetic+and+phenotypic+spectrums+and+refining+treatment+strategies.">The congenital myasthenic syndromes: expanding genetic and phenotypic spectrums and refining treatment strategies.</a> Current Opinion in Neurology. 32 (5), 696-703 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Legland, D., Beaugrand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+clustering+of+lignocellulosic+fibres+based+on+morphometric+features+and+using+clustering+of+variables.">Automated clustering of lignocellulosic fibres based on morphometric features and using clustering of variables.</a> Industrial Crops and Products. 45, 253-261 (2013).</li><li>. GitHUb Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/Genethon/ImCy">https://github.com/Genethon/ImCy</a> (2021)</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">A Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction,+assembly,+maturation+and+maintenance+of+a+postsynaptic+apparatus.">Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus.</a> Nature Reviews Neuroscience. 2 (11), 791-805 (2001).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+synaptic+vesicle+release+and+immaturity+of+neuromuscular+junctions+in+spinal+muscular+atrophy+mice.">Impaired synaptic vesicle release and immaturity of neuromuscular junctions in spinal muscular atrophy mice.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (3), 842-851 (2009).</li><li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Human Molecular Genetics. 11 (12), 1439-1447 (2002).</li><li>Murray, L. M., Comley, L. H., Thomson, D., Parkinson, N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 17 (7), 949-962 (2008).</li><li>Boyer, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+program+dysregulation+is+contributory+to+disease+pathogenesis+in+spinal+muscular+atrophy.">Myogenic program dysregulation is contributory to disease pathogenesis in spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 23 (16), 4249-4259 (2014).</li><li>Ling, K. K. Y., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 21 (1), 185-195 (2012).</li><li>Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+transversus+abdominis+muscle+for+whole-mount+neuromuscular+junction+analysis.">Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51162 (2014).</li><li>Baker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , (1958).</li><li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+Nanoscopy+with+time-gated+detection:+Theoretical+and+experimental+aspects.">STED Nanoscopy with time-gated detection: Theoretical and experimental aspects.</a> PLoS ONE. 8 (1), 054421 (2013).</li><li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses.">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).</li><li>Thomson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characteristics+of+motor+neurons+do+not+determine+their+relative+susceptibility+to+degeneration+in+a+mouse+model+of+severe+spinal+muscular+atrophy.">Morphological characteristics of motor neurons do not determine their relative susceptibility to degeneration in a mouse model of severe spinal muscular atrophy.</a> PLoS ONE. 7 (12), 052605 (2012).</li><li>McMacken, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salbutamol+modifies+the+neuromuscular+junction+in+a+mouse+model+of+ColQ+myasthenic+syndrome.">Salbutamol modifies the neuromuscular junction in a mouse model of ColQ myasthenic syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 28 (14), 2339-2351 (2019).</li></ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten met betrekking tot dit werk.

Het beschreven videoprotocol biedt een gedetailleerde methode om de 3D-structuur van neuromusculaire juncties te kwantificeren door confocale en STED-microscopie te combineren die kan worden gebruikt om pathologische veranderingen op pre- en postsynaptisch niveau te karakteriseren. De hoge resolutie van STED-microscopie maakt visualisatie en morfometrische analyse mogelijk van nanostructuren die niet identificeerbaar zijn door conventionele confocale beeldvorming. Deze procedure stelde ons in staat om structurele veranderingen van NMJ's te meten in twee appendiculaire spieren, tibialis anterior en gastrocnemius, van SMA- en ColQ-gerelateerde CMS-muizen.
Om betrouwbare resultaten met deze techniek te verkrijgen, is het van cruciaal belang om spieren goed te ontleden en te plagen, met bijzondere aandacht voor de fascia rond de spier en de toegepaste kracht om spierbundels te scheiden; anders zou het innervatiepatroon kunnen worden verstoord, waardoor een goede presynaptische NMJ-beoordeling wordt belemmerd. Hoewel gedetailleerde informatie wordt verstrekt om NMJ's van TA en GA te analyseren, kan dit protocol in principe worden aangepast aan andere spieren, waaronder platte spieren, zoals het diafragma of transversale abdominis37, waarvoor de plagerige stap niet nodig is. Weefselfixatie is ook cruciaal om een goede kwaliteit kleuring te garanderen; daarom wordt aanbevolen om PFA van hoge kwaliteit te gebruiken op een geschikt volume (15-20 keer dat van de spier). Bovendien is de blootstellingstijd aan het fixatief een belangrijke stap omdat artefacten, zoals krimp en klontering, kunnen verschijnen als gevolg van overfixatie en NMJ-kenmerken kunnen beïnvloeden. Gezien de grootte van de monsters en de penetratiegraad van de paraformaldehyde-oplossing in weefsels38, wordt een fixatietijd van 18-24 uur aanbevolen voor dit type spier. In het geval dat de kleuringsstap meer dan een week na het oogsten van weefsel wordt gepland, wordt voorgesteld om PFA-gefixeerde spieren in PBS aangevuld met natriumazide bij 4 ° C te houden om bacteriële proliferatie te voorkomen.
Dit protocol presenteert een aanpak met behulp van α-BTX-F488 voor confocale en α-BTX-F633 voor STED-beeldvorming. Deze fluoroforen zijn gekozen om te passen bij het beschreven experimentele ontwerp, maar kunnen worden aangepast aan de beschikbare apparatuur en materialen. Zo kan α-BTX F488-etikettering worden geselecteerd bij gebruik van een STED CW 592 nm-laser voor beeldacquisitie en kwantificering. Het lijkt er echter op dat de configuratie die in de huidige studie werd toegepast (pulsed excitation gated STED, 775 nm depletion) hogere prestaties en betere resolutie vertoont dan andere benaderingen, zoals continue golf STED39, waardoor het meer geschikt is voor de huidige toepassing. Het is ook belangrijk om de instellingen voor het laservermogen zorgvuldig te selecteren, vooral voor STED (zowel excitatie als uitputting), omdat de kenmerken van een intensiteitsprofiel niet kunnen worden gemeten in geval van verzadiging, en daarom kan elk verzadigd signaal in een NMJ-beeld de hele analyse in gevaar brengen.
Deze gedetailleerde workflow, inclusief beeldacquisitie en -analyse met behulp van microscoopsoftware en ImageJ-macro's, is ontwikkeld om autonome NMJ-morfometrische analyse door confocale en STED-microscopie van een enkele spier mogelijk te maken. Eerder beschreven workflows voor NMJ confocale analyse, zoals NMJ-morph2 of NMJ-Analyser14, maakten de weg vrij voor het ontwerp van semi-automatische methoden die morfologische analyse van NMJ's en vergelijkende studies vergemakkelijken. NMJ-morph (en de bijgewerkte versie aNMJ-morph15) is een gratis ImageJ-gebaseerd platform dat de maximale intensiteitsprojectie gebruikt om 21 morfologische kenmerken te meten, en NMJ-Analyser gebruikt een script ontwikkeld in Python dat 29 relevante parameters genereert uit de gehele 3D NMJ-structuur. Handmatige drempels zijn de enige stap tijdens de beeldverwerking in deze twee methoden die gebruikersanalyse vereisen. Dit geïntegreerde protocol beschrijft stappen voor weefselvoorbereiding, 3D confocale beeldacquisitie en ImageJ-gebaseerde verwerking van NMJ's van volledige skeletspieren en biedt een vereenvoudigd overzicht van vijf belangrijke parameters van de postsynaptische (volume, maximaal projectiegebied en tortuositeit) en presynaptische (axon terminale bezetting en neurofilamentaccumulatie) endplates. Een extra parameter van biologische relevantie, het AChR-organisatiepatroon van de postsynaptische junctionele plooien, werd opgenomen voor morfometrische analyse op nanoschaalniveau door superresolutie STED-microscopie (resolutie 20-30 nm)40. Interessant is dat weefselvoorbereiding voor SOA-beeldvorming eenvoudiger is dan andere methoden die worden gebruikt voor NMJ-ultrastructurele studies, zoals conventionele transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)9, een vrij complexe en tijdrovende procedure die een bekwame manipulator vereist om ultradunne secties van het juiste spiergebied te verkrijgen. Bovendien kunnen kwantitatieve gegevens uit meerdere junctionele plooien automatisch worden verkregen met behulp van de STED-bijbehorende software.
Dit protocol werd toegepast om eerder bekende NMJ-defecten in SMN- en ColQ-deficiënte spieren te illustreren 20,36,41,42. Gemeenschappelijke veranderingen werden gevonden in de twee muismodellen door confocale microscopie, zoals een verminderd postsynaptisch endplatevolume, MIP-gebied en relatieve tortuositeit, en verhoogde neurofilamentaccumulatie, terwijl sommige meer specifieke bevindingen (verminderde NMJ-bezetting), alleen werden waargenomen bij SMA-muizen, als een indicator van verminderde blaasjeshandel36. Ten slotte werd een toename van de AChR-streepafstand en -breedte gedetecteerd in ColQ-KO door STED-analyse, die tekenen zijn van ultrastructurele defecten in de postsynaptische junctionele plooien, zoals eerder waargenomen door TEM20. Belangrijk is dat dit protocol kan helpen bij een meer diepgaande morfologische karakterisering van neuromusculaire juncties tijdens ontwikkeling, onderhoud en onder verschillende pathologische omstandigheden.

De neuromusculaire junctie (NMJ) is een complexe structuur die bestaat uit een motorische axonterminal, een perisynaptische Schwann-cel en een skeletmyofibergedeelte dat betrokken is bij de overdracht van chemische informatie en de koppeling van lagere motorneuronactiviteit aan spiercontractie. Bij zoogdieren verandert de morfologie van de neuromusculaire overgang tijdens de ontwikkeling, waarbij een typische krakelingachtige vorm na rijping wordt aangenomen, met verschillen in vorm en complexiteit tussen soorten, en vertoont een zekere mate van plasticiteit als reactie op fysiologische processen zoals lichaamsbeweging of veroudering 1,2,3,4 . De postsynaptische motor endplate vormt membraaninfestaties die junctionele plooien worden genoemd, waarbij het bovenste deel met acetylcholinereceptoren (AChR) in nauw contact staat met de presynaptische terminale axontak5.
Morfologische en functionele veranderingen in neuromusculaire juncties dragen bij aan de pathofysiologie van verschillende neurodegeneratieve aandoeningen zoals spinale musculaire atrofie (SMA) en amyotrofische laterale sclerose (ALS), myopathieën zoals Duchenne spierdystrofie (DMD), congenitale myasthenische syndromen (CMS), myasthenia gravis (MG) en centronucleaire myopathieën (CNM), en verouderingsgerelateerde sarcopenie 3,6,7,8,9, 10,11,12. Bij deze ziekten worden structurele NMJ-veranderingen waargenomen, zoals fragmentatie van de endplate, verminderde postsynaptische junctionele vouwgrootte en/of denervatie. De pathologie van NMJ's kan een primaire of vroege gebeurtenis zijn tijdens ziekteprogressie of meer recentelijk verschijnen als een secundaire gebeurtenis die bijdraagt aan de klinische manifestaties. In ieder geval is het monitoren van de morfologie van NMJ's in diermodellen van deze ziekten een waardevolle parameter om pathologische veranderingen te bestuderen en de werkzaamheid van potentiële behandelingen te beoordelen.
De morfologie van neuromusculaire juncties wordt meestal geanalyseerd door technieken met behulp van confocale microscopie 2,13,14,15 of elektronenmicroscopie 5,16, met hun inherente beperkingen zoals respectievelijk resolutie of technische problemen. Meer recent werd superresolutiemicroscopie ook gebruikt om bepaalde gebieden van de NMJ te visualiseren, zoals presynaptische actieve zones of AChR-verdeling op het postsynaptische membraan 16,17,18, als een alternatieve of complementaire benadering van ultrastructurele analyse door elektronenmicroscopie.
Dit protocol heeft tot doel een gedetailleerde en reproduceerbare methode te bieden om NMJ morfologische parameters te beoordelen door fluorescentie confocale en gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie te combineren. Belangrijke kenmerken van de presynaptische en postsynaptische endplates, zoals volume, oppervlakte, relatieve tortuositeit, AChR-streepbreedte en axon terminale distributie in geïnnerveerde geplaagde spiervezels van muis gastrocnemius en tibialis anterior werden gekwantificeerd in de context van normale en zieke omstandigheden. Nmj-defecten werden met name geïllustreerd in het Smn2B/- muismodel van spinale musculaire atrofie, een neuromusculaire ziekte met motorneurondegeneratie veroorzaakt door mutaties in het SMN1-gen 11,19, en in een collageenachtige staartsubeenheid van asymmetrische acetylcholinesterase knock-out (ColQDex2/Dex2 of ColQ-KO) muizen, als model van het aangeboren myasthenische syndroom20, 21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Buffers and Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 &#945;-bungarotoxin (F488-a-BTX)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>B13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATTO-633 &#945;-bungarotoxin (F633-a-BTX)</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-100-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS</td>
			<td>Gibco, Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol Absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion Oil, n = 1.518</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>MOIL-10LF&#160;</td>
			<td>Low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurofilament (NF-M) antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_531793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.04005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_2315387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alnico Button cylindrical magnets</td>
			<td>Farnell France</td>
			<td>E822</td>
			<td>diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >63x 1.4 NA magnitude oil immersion&#160; HCX Plan Apo CS objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Curved thin forceps-Moria iris forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra thin scissors - Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15-003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel loading tip round 1-200 &#181;L</td>
			<td>COSTAR</td>
			<td>4853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue&#160;</td>
			<td>Whatman (GE Healthcare)</td>
			<td>2105-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170&#177;5 &#181;m</td>
			<td>Marienfield</td>
			<td>107222</td>
			<td>High precision</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (12-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (24-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safeshield scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.40.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost plus slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GraphPad&#160;</td>
			<td>Prism, San Diego (US)</td>
			<td>Release N&#176;6.07</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Release N&#176; 1.53f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Release N&#176;3.7.2.2283</td>
			<td >Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy

Neuromusculaire juncties (NMJ's) zijn zeer gespecialiseerde synapsen tussen lagere motorneuronen en skeletspiervezels die een essentiële rol spelen bij de overdracht van moleculen van het zenuwstelsel naar vrijwillige spieren, wat leidt tot contractie. Ze worden beïnvloed bij veel menselijke ziekten, waaronder erfelijke neuromusculaire aandoeningen zoals Duchenne spierdystrofie (DMD), congenitale myasthenische syndromen (CMS), spinale musculaire atrofie (SMA) en amyotrofische laterale sclerose (ALS). Daarom is het monitoren van de morfologie van neuromusculaire juncties en hun veranderingen in ziektemuismodellen een waardevol hulpmiddel voor pathologische studies en preklinische beoordeling van therapeutische benaderingen. Hier worden methoden beschreven voor het labelen en analyseren van de driedimensionale (3D) morfologie van de pre- en postsynaptische delen van motorische endplates van muizen geplaagde spiervezels. De procedures voor het voorbereiden van monsters en het meten van NMJ-volume, oppervlakte, tortuositeit en axon terminale morfologie / bezetting door confocale beeldvorming, en de afstand tussen postsynaptische junctionele plooien en acetylcholine receptor (AChR) streepbreedte door superresolutie gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie zijn gedetailleerd. Veranderingen in deze NMJ-parameters worden geïllustreerd bij mutante muizen die worden beïnvloed door SMA en CMS.

Om de morfologische analyse van neuromusculaire juncties op pre- en postsynaptisch niveau op een reproduceerbare manier te vergemakkelijken, werd een workflow ontwikkeld van spieroogst tot beeldvorming en kwantificering met behulp van de microscoopsoftware en ImageJ aangepaste macro's (figuur 1). Om het nut van dit protocol te illustreren, werd de morfologie van NMJ's in twee muismodellen van genetische aandoeningen, Smn2B / - en ColQDex2 / Dex2-muizen die werden beïnvloed door spinale musculaire atrofie (SMA) en een aangeboren myasthenisch syndroom (CMS) -vorm, geëvalueerd en werden gegevens vergeleken met leeftijdsgematchte controlebrobsters.
De NMJ-structuur werd beoordeeld aan de hand van tibialis anterieure en gastrocnemiusspieren van respectievelijk 3- en 6 weken oude Smn2B/- (C57Bl/6-achtergrond) en ColQDex2/Dex2 (B6D2F1/J-achtergrond) muizen, wanneer er al tekenen van de ziekte bij deze dieren aanwezig zijn. Op de leeftijd van 3 weken vertonen Smn2B/- muizen tekenen van vertraagde skeletspierontwikkeling en denervatie, zoals NMJ-atrofie en verlies35,36. CMS-muizen hebben een primaire pathologie bij NMJ's en manifesteren een vermindering van het lichaamsgewicht vanaf de eerste levensweek en duidelijke spierzwakte20 (gegevens niet getoond). Zoals te zien is in figuur 2A, leek de postsynaptische motoreindplaat gelabeld met fluorescerende α-bungarotoxine kleiner en/of gefragmenteerd in mutanten van de twee muislijnen door confocale microscopie. Kwantificering van NMJ Z-stacks met behulp van deze aangepaste ImageJ-macro's onthulde duidelijke afnames in endplatevolume, maximale intensiteitsprojectie (MIP) en relatieve tortuositeit in zowel SMA- als CMS-muizen in vergelijking met controles, als tekenen van NMJ-rijpingsdefecten32 (figuur 2B-D). Postsynaptisch endplatevolume en MIP waren afgenomen bij zieke dieren (vouwverandering van respectievelijk 2,7 en 2,0 voor volume en 2,5 en 2,0 voor MIP, bij Smn2B/- en ColQDex2/Dex2 muizen). De relatieve tortuositeit was ook kleiner in SMN- en ColQ-deficiënte spieren dan WT (16,97% ± 1,33% in SMA versus 48,84% ± 5,90% WT-muizen en 13,29% ± 2,79% in CMS versus 30,20% ± 4,44% controlemuizen). Bovendien onthulde de kwantificering van de verdeling van presynaptische axonterminaltakken met behulp van de ImageJ aangepaste macro een veranderd patroon in neurofilament M-distributie in de twee diermodellen, met verhoogde immunolabelling (84,65% ± 0,32% versus 16,57% ± 2,03% en 23,64% ± 2,78% versus 18,77% ± 1,73% in Smn2B / - en ColQDex2 / Dex2-muizen in vergelijking met controles) (Figuur 3A-D ). Door SV2-kleuring werd ook een vermindering van 43% van de bezettingsgraad, d.w.z. procent van de AChR-bevattende regio's met aangrenzende zenuwterminale actieve zones, waargenomen bij Smn2B / - muizen (49,36% ± 3,76% in SMA versus 85,69% ± 2,34% WT-muizen) (figuur 3E, F). Deze NMJ-parameter werd ook berekend in GA van ColQDex2/Dex2-mutanten, maar er werd geen statistisch significant verschil gevonden in vergelijking met controlebrobzingenoten (gegevens niet getoond).
We analyseerden verder postsynaptische membraankenmerken door de afstand tussen junctionele plooien en de breedte van AChR-strepen, die zich op de top van deze plooien bevinden, in ColQ-deficiënte spieren te kwantificeren met behulp van superresolutie gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie. Zoals te zien is in figuur 4, kan het aspect van deze structuren duidelijk worden gevisualiseerd door fluorescerende α-bungarotoxine-etikettering en intensiteitsprofielanalyse. We evalueerden deze NMJ-parameters en vonden een toename van de junctionele vouwafstand (d) en breedte (w) van AChR-strepen in de gastrocnemiusspier van mutanten (358,3 nm ± 11,97 nm en 320,8 nm ± 10,90 nm voor de afstand, en 216,9 nm ± 10,51 nm en 186,3 nm ± 7,015 nm voor de breedte, in ColQDex2 / Dex2 in vergelijking met wildtype muizen, respectievelijk p < 0,05) (figuur 4C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig01.jpg"> Figuur 1: Stroomdiagram van het videoprotocol voor 3D multiscale NMJ-karakterisering door confocale en STED-microscopie. Tibialis anterieure (TA) en gastrocnemius (GA) spieren werden verzameld van muizen, en spiervezels werden geplaagd voordat ze werden geëtiketteerd met α-bungarotoxine-F488 of α-bungarotoxine-F633, DAPI, primaire antilichamen gericht tegen neurofilament M (NF-M) en synaptisch vesikelglycoproteïne 2 (SV2) en fluorofoor (F488 of F594) -geconjugeerde secundaire antilichamen. Beeldstapels werden verkregen door confocale microscopie en verwerkt om postsynaptisch NMJ-volume, presynaptische NF-M-accumulatie, NMJ axon terminale bezetting, postsynaptische maximale intensiteitsprojectie (MIP) endplate-oppervlakte en tortuositeit (dObj (AB) is de afstand tussen A en B langs de omtrek van het object (rode lijn), terwijl dEuc (AB) is de Euclides-afstand tussen A en B (groene lijn)). Voor STED-microscopieanalyse werden de breedte van acetylcholinereceptor (AChR) strepen en de afstand tussen junctionele plooien gekwantificeerd uit intensiteitsprofielen van α-BTX-F633-kleuring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig02.jpg"> Figuur 2: Multi-parameter postsynaptische NMJ-karakterisering in muismodellen van spinale musculaire atrofie (SMA) en ColQ-gerelateerd congenitaal myasthenisch syndroom (CMS). (A) Representatieve afbeeldingen van postsynaptische motorische endplates van TA- en GA-spieren gelabeld met α-bungarotoxine-F488 (α-BTX). (B) Kwantificering van NMJ postsynaptisch endplate volume, (C) maximale intensiteit projectie (MIP) gebied en (D) relatieve tortuositeit in TA van respectievelijk 3 weken oude wild-type (WT) en Smn2B/- muizen (linker grafieken, N = 3 dieren per genotype, n = 37 en n = 56 NMJ's) en 6 weken oude WT en ColQDex2/Dex2 muizen (rechter grafieken, N = 5 muizen per genotype, n = 89 en n = 97 NMJ's, respectievelijk). Gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde per muis (punt) ± SEM. Verschillen tussen groepen werden geanalyseerd door Mann-Whitney-test (* p < 0,05). Schaalbalk is 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig03.jpg"> Figuur 3: Morfometrische analyse van presynaptische axon terminale distributie in spieren van WT en mutante muizen. NMJ innervatiepatroon in tibialis anterieure (TA) en gastrocnemius (GA) spieren van wild-type, SMA en ColQ-gerelateerde CMS muizen. (A, B) Representatieve neuromusculaire juncties van TA van WT en Smn2B/- muizen op een leeftijd van 21 dagen gelabeld met antilichamen tegen neurofilament M (NF-M, rood) en α-bungarotoxine-F488 (α-BTX, groen) (A), en resultaten van kwantitatieve analyse van neurofilamentaccumulatie (B); (C, D) Representatieve neuromusculaire juncties van GA van 6 weken oude WT- en ColQDex2/Dex2-muizen gelabeld met antilichamen tegen neurofilament M (NF-M, rood) en α-bungarotoxine-F488 (α-BTX, groen), met gefragmenteerde en onrijpe postsynaptische endplates (C) en resultaten van neurofilamentaccumulatie in de twee groepen dieren (D). N= 4 (n = 34 NMJ's) (B) en N = 3 (n = 54 NMJ's) (D) WT-dieren, en N=3 (n = 36 NMJ's) Smn2B/- en N = 3 (n = 55 NMJ's) ColQDex2/Dex2-muizen werden geanalyseerd in de experimenten (B, D). (E, F) Representatieve beelden van axon terminale bezetting in NMJ's van TA van 3 weken oude WT en Smn2B/- muizen gelabeld met antilichamen tegen synaptische blaasjesglycoproteïne 2 (SV2, rood) en α-bungarotoxine-F488 (α-BTX, groen) (E), en resultaten van NMJ-bezetting (SV2/AChR-volumeverhouding) (F). Spieren van N = 3 (n = 50 NMJ's) wild-type en N = 4 (n = 62 NMJ's) Smn2B/- muizen werden geanalyseerd. Gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelde waarde per muis (punt) ± SEM. Verschillen tussen groepen werden geanalyseerd door Mann-Whitney-test (* p < 0,05). Schaalbalken zijn 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig04.jpg"> Figuur 4: STED-beeldvorming van NMJ postsynaptische endplates. (A) Representatieve SOA-afbeelding van een NMJ gelabeld met α-bungarotoxine-F633 (α-BTX) van gastrocnemius van een 6 weken oude wild-type muis met postjunctionale AChR-strepen (schaalbalk is 5 μm). (B) Hogere vergroting van een gebied met AChR-strepen (onderste paneel) dat werd gebruikt om het intensiteitsprofiel te genereren. De breedte (w) van AChR-strepen en de afstand tussen twee aangrenzende strepen (d) van dit gebied werden gekwantificeerd en weergegeven in het staafdiagram. Schematische weergave van de postsynaptische eindplaat om de breedte van de AChR-streep (w) en de afstand (d) te illustreren. Deze parameters, (C) AChR-streepafstand en (D) breedte, werden gemeten bij ColQDex2/Dex2-muizen en controlebroedgenoten op de leeftijd van 6 weken. NMJ's van 5 WT (totaal n = 29 NMJ's) en 6 ColQDex2/Dex2 (totaal n = 43 NMJ's) dieren werden blind geanalyseerd. Gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde per muis (punt) ± SEM. Statistische verschillen tussen groepen werden geanalyseerd met behulp van de Mann-Whitney-test (* p < 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur 1: Lancering van LAS X-software en parameters voor confocale overnames. De verschillende stappen om confocale beelden te verkrijgen worden beschreven in de paragrafen 3.1.2 tot en met 3.1.7 van het protocol. Voor elke NMJ stack acquisitie wordt een project geopend (stap 3.1.4) en worden de parameters van beeldgrootte, acquisitiesnelheid, X, Y en Z assen geselecteerd (stap 3.1.7), waarbij elke sequentiële scan wordt aangegeven (Seq.1, laser 405 voor DAPI; Seq.2, laser 488 voor α-BTX-F488; en Seq.3, laser 552 voor F594 geconjugeerde secundaire antilichamen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 2: Lancering van LAS X-software en parameters voor STED-acquisities. De stappen voor het verkrijgen van STED-beelden worden beschreven in de punten 3.2.2 tot en met 3.2.8 van het protocol. De microscoop wordt gestart in configuratiemodus STED ON (stap 3.2.2) en een project wordt geopend (stap 3.2.3). De parameters voor beeldacquisitie (stap 3.2.7) (beeldgrootte, acquisitiesnelheid, zoomfactor, X-as), bij elke sequentiële scan worden aangegeven (Seq.1 voor α-BTX-F633; Seq.2 voor F488 geconjugeerde secundaire antilichamen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%202.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 3: Afbeeldingen van α-BTX-gekleurde junctionele plooien verkregen door STED-microscopie. Afbeeldingsvoorbeelden van een postsynaptische endplate gelabeld met α-BTX-F633 van een 6 weken oude wild-type muis die werden verkregen met een juiste (links) of onjuiste focus (rechts). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%203.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende afbeelding 4: Windows-pop-ups om de invoer- en uitvoergegevens te beschrijven die zijn verkregen door de aangepaste ImageJ-macro's. Voorbeelden van invoergegevens (.tif- en .lif-bestanden) van NMJ-afbeeldingen worden weergegeven in de linkerkolom. De uitvoergegevens van de macro's (rechterkolom) worden opgeslagen in mappen (Save_Volume, Save_Accu) die afbeeldingen van het knooppunt (.tif) en gegevensbladen met de resultaten (.csv bestanden) bevatten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%204.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 5: AChR-streepafstands- en breedteanalyse van een STED-acquisitie met behulp van de LAS X-software. De stappen om NMJ STED-beelden te analyseren worden beschreven in sectie 5 van het protocol. A) Afbeelding van een gelabeld postsynaptisch endplate-gebied met AChR-strepen. Het gebied dat van belang is voor streepanalyse wordt geselecteerd door een loodrechte lijn (groene lijn, voor streepafstand) of een loodrechte rechthoek (paarse rechthoek, voor streepbreedte) te tekenen. (B, C) Intensiteitsprofielen van de geselecteerde gebieden en metingen om de afstand tussen AChR-strepen (B) en de AChR-streepbreedte (C) te berekenen, worden weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%205.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende coderingsbestand 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. Aangepaste macro imageJ om NMJ-parametermetingen te extraheren (NMJ-volume, MIP-eindplaatoppervlak en NMJ-tortuositeit). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend coderingsbestand 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. ImageJ aangepaste macro om NF-M accumulatie en SV2-kleuring te extraheren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Dit protocol beschrijft een methode voor morfometrische analyse van neuromusculaire juncties door gecombineerde confocale en STED-microscopie die wordt gebruikt om pathologische veranderingen in muismodellen van SMA- en ColQ-gerelateerd CMS te kwantificeren.

Karakterisering van neuromusculaire juncties bij muizen door gecombineerde confocale en superresolutiemicroscopie

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Dit protocol helpt kwantitatief de 3D-structuur van neuromusculaire juncties te analyseren met een resolutie die dicht bij elektronenmicroscopie ligt met behulp van een eenvoudige procedure. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat spiermonsters op dezelfde manier worden verwerkt en immunoactief worden gelabeld voor confocale en SOA-microscopie, waardoor de tijd voor nauwkeurige neuromusculaire junctiestructuurevaluatie in diermodellen wordt verkort. De morfologische kwantificering die we hebben ontwikkeld, kan eenvoudig worden aangepast om andere subcellulaire structuren te analyseren.Het is mij een genoegen om Dr. Martina Marinello voor te stellen, een wetenschapper uit mijn team die zal laten zien hoe spierpesten en immunostainings worden uitgevoerd en enkele aanbevelingen zal geven voor de succesvolle toepassing van dit protocol. Ik ben verheugd om Dr.Jeremie Cosette van Genethon's beeldvormingsplatform te introduceren die beeldacquisitie en -analyse zal tonen met behulp van confocale en STED-microscopen. Begin na euthanasie met het plagen van de tibialis anterieure spieren in kleine vezelbundels van ongeveer een millimeter breed met behulp van twee fijne gekartelde tangen.Breng vervolgens deze spierbundels over in een 24-wells plaat met 1% Triton X-100 bereid in PBS en laat het een uur zachtjes roeren bij kamertemperatuur of vijf uur bij vier graden Celsius. Na het driemaal wassen van de monsters gedurende vijf minuten met PBS bij kamertemperatuur, incubeer de monsters met een blokkerende oplossing bestaande uit 4% BSA bereid in PBS met 1% Triton X-100 gedurende vier uur bij vier graden Celsius onder zachte agitatie. Incubeer vervolgens de monsters 's nachts met dezelfde blokkerende oplossing die primaire monoklonale antilichamen bevat tegen neurofilament M of synaptisch blaasjeglycoproteïne 2 om respectievelijk presynaptische axonterminals of actieve zones te labelen.Was de volgende dag de gelabelde spierbundels drie keer gedurende vijf minuten met PBS onder zachte agitatie. Incubeer ze vervolgens met geschikte secundaire antilichamen door ze twee uur op een shaker bij kamertemperatuur te plaatsen. Nadat je de spierbundels opnieuw hebt gewassen, plaats je ze op een schuif met bevestigingsmedium.Plaats vervolgens een glazen afdekslip van 1,5 kwaliteit aan de bovenkant, gevolgd door cilindrische magneten aan beide zijden van de glijbaan om druk uit te oefenen en de spieren af te vlakken. Om beelden te verkrijgen met behulp van de confocale microscoop, start u de microscoopsoftware en kiest u de machine als configuratiemodus en verzamelt u beeldstapels van de neuromusculaire juncties in elke experimentele groep volgens de instellingen die in het tekstmanuscript worden vermeld. Klik aan het einde van de sessie op Openen in 3D-viewer en kies een neuromusculaire junctie die representatief is voor een experimentele groep om de 3D-labeling te visualiseren.Om post-synaptische neuromusculaire junctie en plaatvolume, maximale intensiteit projectiegebied en relatieve tortuositeit te berekenen, sleept u de macro voor neuromusculaire junctievolumekwantificering naar het Image J-venster en wanneer de macro in een tweede venster wordt geopend, klikt u op Macro's en Macro uitvoeren. Selecteer de native map met de junction submappen die geanalyseerd moeten worden en klik op Select( Selecteren). Selecteer vervolgens in het pop-upmenu van de opslagmap de opslagmap en klik op Selecteren.Selecteer in het nieuwe pop-upmenu Met de naam Afbeeldingstype de indeling van de Z-stackaankopen. Selecteer het RGB-kanaal dat overeenkomt met de kleuring van belang en geef X, Y pixelgrootte en Z stap aan. Als eigen bestandsindelingen zijn geselecteerd, leest de macro rechtstreeks de pixelgrootte en de Z-stap.Om presynaptische neurofilamentaccumulatie te kwantificeren, sleept u de macro voor neuromusculaire junctieaccumulatiekwantificering naar het afbeelding J-venster en klikt u op Macro's en Macro uitvoeren. Selecteer de junction-submappen, opslagmap en de indeling van de Z-stackaankopen zoals eerder gedemonstreerd. Geef vervolgens in de pop-up Kleuring Infos het pre-synaptische en post-synaptische label en de kleur aan en klik op OK.In de pop-up Pixelgrootte, geef de X- en Y-pixelgrootte aan als 0,072 micrometer, de Z-stap als 0,5 micrometer en klik op OK. Als eigen bestandsindelingen zijn geselecteerd, leest de macro rechtstreeks de pixelgrootte en de Z-stap.Als u de afstand tussen de acetylcholinereceptorstrepen wilt berekenen, selecteert u het menu Kwantificeren boven in het centrale venster. Klik op het tabblad Extra, selecteer intensiteit en klik op het pictogram van het regelprofiel. Stel Oversampling in op één en vink Sorteerkanalen aan.Klik op het tabblad Projecten openen en selecteer de gefilterde afbeelding die u wilt analyseren. Klik vervolgens op het tekenlijnpictogram en traceer een lijn die loodrecht verschillende strepen of junctionele plooien kruist. Klik op de bovenkant van de eerste piek en beweeg de muisaanwijzer terwijl u op de linkermuisknop drukt totdat de volgende maximale piek is bereikt.Let op de DX-waarde, die overeenkomt met de afstand tussen de twee pieken. Klik met de rechtermuisknop in de afbeelding van het rechtervenster en selecteer ROIs opslaan. Nadat u op het pijlpictogram hebt geklikt, klikt u op de ROI en verwijdert u deze door op het prullenbakpictogram te klikken.Voor het berekenen van de breedte van de acetylcholinereceptorstreep selecteert u intensiteit in het linkerbovenhoekpaneel onder het tabblad Gereedschappen, klikt u op het pictogram FWHM bepalen en vinkt u de sorteerkanalen aan. Klik vervolgens op het tabblad Projecten openen en selecteer de gefilterde afbeelding die moet worden geanalyseerd. Klik vervolgens op het tekenrechthoekpictogram in het bovenste menu van het rechtervenster.Selecteer een horizontale of verticale streep en teken een rechthoek loodrecht op de streep. Er verschijnt een profiel in het centrale venster. Klik op verticaal of horizontaal van het menu Gemiddelde projectie in het linkerdeelvenster, afhankelijk van of de streepstand verticaal of horizontaal is.Klik op de statistieken in het centrale venster om de FWHM-waarde te lezen en sla vervolgens de ROI's op en verwijder deze zoals eerder gedemonstreerd. De post-synaptische motoreindplaat, gelabeld met fluorescerend alfa-Bungarotoxine, leek kleiner en gefragmenteerd in de mutanten van twee muislijnen. Kwantificering van de neuromusculaire junctie Z-stacks met behulp van de aangepaste Image J-macro's onthulde een duidelijke afname van het eindplaatvolume, maximale intensiteitsprojectie en relatieve tortuositeit in beide ziektemuismodellen in vergelijking met controles, wat wijst op neuromusculaire junctierijpingsdefecten.Het kwantificeren van de presynaptische axon terminale branch distributie met behulp van de Image J aangepaste macro onthulde een veranderd patroon in neurofilament M-distributie in de twee diermodellen met verhoogde immunolabeling. Door synaptische blaasjesglycoproteïne 2-kleuring werd een vermindering van 43% van de bezettingsgraad van de acetylcholinereceptorbevattende regio's met aangrenzende zenuwterminale actieve zones waargenomen in Smn 2B / muizen. Het aspect van de neuromusculaire junction postsynaptische eindplaten werd duidelijk gevisualiseerd door fluorescerende alfa-Bungarotoxine-etikettering en intensiteitsprofielanalyse.Evaluatie van de neuromusculaire junctieparameters onthulde een toename van de junctionele vouwafstand en breedte van acetylcholinereceptorstrepen in de gastrocnemiusspier van de mutanten. Om betrouwbare resultaten te verkrijgen, is het cruciaal om spieren goed te plagen, met bijzondere aandacht voor de toegepaste kracht om spierbundels te scheiden. Dit protocol kan helpen bij het verkrijgen van een meer diepgaande morfologische karakterisering van neuromusculaire junctie, die voorheen alleen werd verklaard door complexe en tijdrovende procedures, zoals transmissie-elektronenmicroscopie.De SOA-beeldvormingsprocedure maakte de weg vrij voor het onderzoek naar nieuwe inzichten met betrekking tot pre- en post-synaptische markers, die bijdragen aan de pathofysiologie van ziekten die de neuromusculaire junctie beïnvloeden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Spectrale confocale beelden van de fluorescent gelabeld nicotinereceptoren in de knock-in muizen met chronische Nicotine Administratie

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-resolution Imaging van Neuronal Dense-core Blaasjes

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocol voor drie-dimensionale confocale Morfometrische Analyse van Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Waarom kwantificering Matters: karakterisering van fenotypes bij de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Neuromusculaire Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Extracellulaire van neuronale activiteit Gecombineerd met Microiontophoretic Toepassing van neuroactive stoffen in Awake Muizen

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

De fibular Nerve Injury Methode: Een betrouwbare Assay kunnen identificeren en Test factoren die Repair neuromusculaire verbindingen

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Triggering Cell Stress en Dood met behulp van conventionele uv laser confocale microscopie

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisatie en Live beeldvorming van Oligodendrocyte organellen in Organotypic hersenen plakjes met behulp van Adeno-associated Virus en confocale microscopie

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...