Name: characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy
Uploaded: 2021-12-08T13:00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Nous remercions le « Cœur de l’Imagerie et de la Cytométrie » de Généthon, ainsi que le service d’histologie, qui sont soutenus en partie par des fonds d’équipement de la Région Ile-de-France, du Conseil Général de l’Essonne, de la Genopole Recherche d’Evry, de l’Université d’Evry Val d’Essonne et de l’INSERM, France. Nous remercions également le Dr Rashmi Kothary d’avoir fourni la lignée de souris Smn 2B/2B (Université d’Ottawa, Canada) et le Dr Eric Krejci pour la lignée de souris ColQDex2/+ (inédite, Université de Paris, France). Nous remercions Guillaume Corre pour son soutien en analyse statistique. Les anticorps monoclonaux 2H3 (développés par Jessel, T.M. et Dodd, J.) et SV2 (développés par Buckley, K.M.) ont été obtenus à partir de la Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), créée par le NICHD des NIH et maintenue à l’Université de l’Iowa, Département de biologie, Iowa City, IA 52242. Ce travail a été soutenu par l’Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon), l’INSERM et l’Université d’Evry Val d’Essonne.

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts lié à ce travail.

Le protocole vidéo décrit fournit une méthode détaillée pour quantifier la structure 3D des jonctions neuromusculaires en combinant la microscopie confocale et la microscopie STED qui peuvent être utilisées pour caractériser les changements pathologiques aux niveaux pré- et postsynaptique. La haute résolution de la microscopie STED permet la visualisation et l’analyse morphométrique de nanostructures qui ne sont pas identifiables par imagerie confocale conventionnelle. Cette procédure nous a permis de mesurer les altérations structurelles des JNM dans deux muscles appendiculaires, tibial antérieur et gastrocnémien, de souris CMS liées à la SMA et à la ColQ.
Pour obtenir des résultats fiables avec cette technique, il est essentiel de disséquer et de taquiner correctement les muscles, en accordant une attention particulière au fascia entourant le muscle et à la force appliquée pour séparer les faisceaux musculaires; sinon, le schéma d’innervation pourrait être perturbé empêchant une évaluation correcte de la JNM présynaptique. Bien que des informations détaillées soient fournies pour analyser les JNM de TA et GA, en principe, ce protocole pourrait être adapté à d’autres muscles, y compris les muscles plats, tels que le diaphragme ou les abdominaux transversaux37, qui ne nécessitent pas l’étape de taquinerie. La fixation tissulaire est également cruciale pour assurer une coloration de bonne qualité; par conséquent, il est recommandé d’utiliser du PFA de haute qualité à un volume approprié (15 à 20 fois celui du muscle). En outre, le temps d’exposition au fixateur est une étape importante car des artefacts, tels que le retrait et l’agglutination, peuvent apparaître en raison d’une fixation excessive et influencer les caractéristiques de la JNM. Compte tenu de la taille des échantillons et du taux de pénétration de la solution de paraformaldéhyde dans les tissus38, un temps de fixation de 18-24 h est recommandé pour ce type de muscle. Dans le cas où l’étape de coloration est prévue plus d’une semaine après le prélèvement des tissus, il est suggéré de garder les muscles fixés au PFA dans le PBS supplémenté en azoture de sodium à 4 ° C pour prévenir la prolifération bactérienne.
Ce protocole présente une approche utilisant α-BTX-F488 pour la confocale et α-BTX-F633 pour l’imagerie STED. Ces fluorophores ont été choisis pour s’adapter à la conception expérimentale décrite, mais peuvent être modifiés en fonction de l’équipement et des matériaux disponibles. Par exemple, l’étiquetage α-BTX F488 peut être sélectionné lors de l’utilisation d’un laser STED CW 592 nm pour l’acquisition et la quantification d’images. Cependant, il semble que la configuration qui a été appliquée dans la présente étude (STED à excitation pulsée fermée, épuisement de 775 nm) présente des performances et une meilleure résolution que d’autres approches, telles que STED39 à onde continue, ce qui la rend plus adaptée à l’application actuelle. Il est également important de sélectionner avec soin les réglages de puissance laser, en particulier pour STED (excitation et épuisement), car les caractéristiques d’un profil d’intensité ne peuvent pas être mesurées en cas de saturation, et donc tout signal saturé dans une image NMJ pourrait compromettre l’ensemble de l’analyse.
Ce flux de travail détaillé, y compris l’acquisition et l’analyse d’images à l’aide d’un logiciel de microscope et de macros ImageJ, a été développé pour faciliter l’analyse morphométrique NMJ autonome par microscopie confocale et STED à partir d’un seul muscle. Les flux de travail décrits précédemment pour l’analyse confocale NMJ, tels que NMJ-morph2 ou NMJ-Analyser14, ont ouvert la voie à la conception de méthodes semi-automatiques qui facilitent l’analyse morphologique des NMJ et les études comparatives. NMJ-morph (et sa version mise à jour aNMJ-morph15) est une plate-forme gratuite basée sur ImageJ qui utilise la projection d’intensité maximale pour mesurer 21 caractéristiques morphologiques, et NMJ-Analyser utilise un script développé en Python qui génère 29 paramètres pertinents à partir de l’ensemble de la structure 3D NMJ. Le seuillage manuel est la seule étape du traitement d’image dans ces deux méthodes qui nécessitent une analyse utilisateur. Ce protocole intégré détaille les étapes de préparation des tissus, d’acquisition d’images confocales 3D et de traitement basé sur ImageJ des NMJ de muscles squelettiques entiers et fournit un aperçu simplifié de cinq paramètres importants des plaques terminales postsynaptiques (volume, surface de projection maximale et tortuosité) et présynaptiques (occupation terminale axonale et accumulation de neurofilaments). Un paramètre supplémentaire de pertinence biologique, le schéma d’organisation AChR des plis jonctionnels postsynaptiques, a été incorporé pour l’analyse morphométrique à l’échelle nanométrique par microscopie STED à super-résolution (résolution 20-30 nm)40. Il est intéressant de noter que la préparation des tissus pour l’imagerie STED est plus simple que d’autres méthodes utilisées pour les études ultrastructurales NMJ, telles que la microscopie électronique à transmission conventionnelle (TEM)9, qui est une procédure plutôt complexe et longue qui nécessite un manipulateur qualifié afin d’obtenir des sections ultraminces de la région musculaire appropriée. En outre, les données quantitatives provenant de plis jonctionnels multiples peuvent être obtenues automatiquement à l’aide du logiciel associé à STED.
Ce protocole a été appliqué pour illustrer les défauts des JNM précédemment connus dans les muscles déficients en SMN et ColQ 20,36,41,42. Des changements communs ont été trouvés dans les deux modèles murins par microscopie confocale, tels qu’une diminution du volume de la plaque terminale postsynaptique, de la zone MIP et de la tortuosité relative, ainsi qu’une accumulation accrue de neurofilaments, tandis que certains résultats plus spécifiques (diminution de l’occupation de la NMJ) n’ont été observés que chez les souris SMA, comme indicateur du trafic de vésicules altérées36. Enfin, une augmentation de la distance et de la largeur de la bande AChR a été détectée dans ColQ-KO par l’analyse STED, qui sont des signes de défauts ultrastructuraux dans les plis jonctionnels postsynaptiques, comme observé précédemment par TEM20. Il est important de noter que ce protocole peut aider à une caractérisation morphologique plus approfondie des jonctions neuromusculaires au cours du développement, de l’entretien et dans diverses conditions pathologiques.

La jonction neuromusculaire (NMJ) est une structure complexe composée d’un axone moteur terminal, d’une cellule de Schwann périsynaptique et d’une partie de myofibre squelettique impliquée dans la transmission de l’information chimique et le couplage de l’activité des motoneurones inférieurs à la contraction musculaire. Chez les mammifères, la morphologie de la jonction neuromusculaire change au cours du développement, adoptant une forme typique de bretzel après la maturation, avec des différences de forme et de complexité entre les espèces, et montre un certain degré de plasticité en réponse à des processus physiologiques tels que l’exercice ou le vieillissement 1,2,3,4 . La plaque motrice postsynaptique forme des invaginations membranaires appelées plis jonctionnels, où la partie supérieure contenant les récepteurs de l’acétylcholine (AChR) est en contact étroit avec la branche5 de l’axone terminal présynaptique.
Les changements morphologiques et fonctionnels dans les jonctions neuromusculaires contribuent à la physiopathologie de plusieurs troubles neurodégénératifs tels que l’amyotrophie spinale (SMA) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA), les myopathies comme la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), les syndromes myasthéniques congénitaux (CMS), la myasthénie grave (MG) et les myopathies centronucléaires (CNM), et la sarcopénie associée au vieillissement 3,6,7,8,9, 10,11,12. Dans ces maladies, on observe des altérations structurelles de la NMJ telles que la fragmentation de la plaque terminale, la réduction de la taille du pli jonctionnel postsynaptique et / ou la dénervation. La pathologie des NMJ peut être un événement primaire ou précoce au cours de la progression de la maladie ou apparaître plus récemment comme un événement secondaire contribuant aux manifestations cliniques. Dans tous les cas, le suivi de la morphologie des NMJ dans des modèles animaux de ces maladies représente un paramètre précieux pour étudier les changements pathologiques et évaluer l’efficacité des traitements potentiels.
La morphologie des jonctions neuromusculaires est généralement analysée par des techniques utilisant la microscopie confocale 2,13,14,15 ou la microscopie électronique 5,16, avec leurs limitations inhérentes telles que la résolution ou les difficultés techniques, respectivement. Plus récemment, la microscopie à super-résolution a également été utilisée pour visualiser des régions particulières de la NMJ, telles que les zones actives présynaptiques ou la distribution AChR sur la membrane postsynaptique16,17,18, comme approche alternative ou complémentaire à l’analyse ultrastructurale par microscopie électronique.
Ce protocole vise à fournir une méthode détaillée et reproductible pour évaluer les paramètres morphologiques NMJ en combinant la microscopie confocale à fluorescence et la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED). Des caractéristiques importantes des plaques terminales présynaptiques et postsynaptiques, telles que le volume, la surface, la tortuosité relative, la largeur de la bande AChR et la distribution terminale de l’axone dans les fibres musculaires innervées de gastrocnémiens et tibiaux antérieurs de souris ont été quantifiées dans le contexte de conditions normales et malades. En particulier, les défauts de la NMJ ont été illustrés dans le modèle murin Smn 2B / - de l’amyotrophie spinale, une maladie neuromusculaire avec dégénérescence des motoneurones causée par des mutations du gène SMN1 11,19, et dans une sous-unité de queue semblable au collagène de souris asymétriques à knockout de l’acétylcholinestérase (ColQ Dex2 / Dex2 ou ColQ-KO), comme modèle du syndrome myasthénique congénital 20, 21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Buffers and Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 &#945;-bungarotoxin (F488-a-BTX)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>B13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATTO-633 &#945;-bungarotoxin (F633-a-BTX)</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-100-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS</td>
			<td>Gibco, Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol Absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion Oil, n = 1.518</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>MOIL-10LF&#160;</td>
			<td>Low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurofilament (NF-M) antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_531793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.04005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_2315387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alnico Button cylindrical magnets</td>
			<td>Farnell France</td>
			<td>E822</td>
			<td>diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >63x 1.4 NA magnitude oil immersion&#160; HCX Plan Apo CS objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Curved thin forceps-Moria iris forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra thin scissors - Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15-003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel loading tip round 1-200 &#181;L</td>
			<td>COSTAR</td>
			<td>4853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue&#160;</td>
			<td>Whatman (GE Healthcare)</td>
			<td>2105-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170&#177;5 &#181;m</td>
			<td>Marienfield</td>
			<td>107222</td>
			<td>High precision</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (12-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (24-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safeshield scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.40.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost plus slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GraphPad&#160;</td>
			<td>Prism, San Diego (US)</td>
			<td>Release N&#176;6.07</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Release N&#176; 1.53f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Release N&#176;3.7.2.2283</td>
			<td >Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy

Les jonctions neuromusculaires (JNM) sont des synapses hautement spécialisées entre les motoneurones inférieurs et les fibres musculaires squelettiques qui jouent un rôle essentiel dans la transmission des molécules du système nerveux aux muscles volontaires, conduisant à la contraction. Ils sont affectés dans de nombreuses maladies humaines, y compris les troubles neuromusculaires héréditaires tels que la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), les syndromes myasthéniques congénitaux (CMS), l’amyotrophie spinale (SMA) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Par conséquent, la surveillance de la morphologie des jonctions neuromusculaires et de leurs altérations dans les modèles murins de maladie représente un outil précieux pour les études pathologiques et l’évaluation préclinique des approches thérapeutiques. Ici, les méthodes de marquage et d’analyse de la morphologie tridimensionnelle (3D) des parties pré- et postsynaptiques des plaques d’extrémité motrices à partir de fibres musculaires murines taquinées sont décrites. Les procédures de préparation des échantillons et de mesure du volume, de la surface, de la tortuosité et de la morphologie/occupation terminale de l’axone par imagerie confocale, ainsi que la distance entre les plis jonctionnels postsynaptiques et la largeur de bande du récepteur de l’acétylcholine (AChR) par microscopie à déplétion par émission stimulée à super-résolution (STED) sont détaillées. Les altérations de ces paramètres NMJ sont illustrées chez des souris mutantes affectées par SMA et CMS.

Afin de faciliter l’analyse morphologique des jonctions neuromusculaires au niveau pré- et postsynaptique de manière reproductible, un flux de travail a été développé de la récolte musculaire à l’imagerie et à la quantification à l’aide du logiciel de microscope et des macros personnalisées ImageJ (Figure 1). Pour illustrer l’utilité de ce protocole, la morphologie des NMJ dans deux modèles murins de troubles génétiques, les souris Smn2B / - et ColQDex2 / Dex2 touchées par l’amyotrophie spinale (SMA) et une forme de syndrome myasthénique congénital (CMS), respectivement, ont été évaluées et les données ont été comparées à des compagnons de portée témoins appariés selon l’âge.
La structure de la NMJ a été évaluée à partir de muscles tibiaux antérieurs et gastrocnémiens de souris Smn2B/- âgées de 3 et 6 semaines (C57Bl/6 de fond) et ColQ Dex2/Dex2 (B6D2F1/J de fond), respectivement, lorsque des signes de la maladie sont déjà présents chez ces animaux. À l’âge de 3 semaines, les souris Smn2B/- présentent des signes de retard du développement des muscles squelettiques et de dénervation, tels que l’atrophie et la perte de NMJ35,36. Les souris CMS ont une pathologie primaire dans les JNM et manifestent une réduction du poids corporel dès la première semaine de vie et une faiblesse musculaire marquée20 (données non présentées). Comme le montre la figure 2A, la plaque d’extrémité motrice postsynaptique marquée par la α-bungarotoxine fluorescente est apparue plus petite et/ou fragmentée chez les mutants des deux lignées de souris par microscopie confocale. La quantification des piles Z NMJ à l’aide de ces macros ImageJ personnalisées a révélé des diminutions marquées du volume de la plaque terminale, de la projection de l’intensité maximale (MIP) et de la tortuosité relative chez les souris SMA et CMS par rapport aux témoins, comme signes de défauts de maturation NMJ32 (Figure 2B-D). Le volume postsynaptique de la plaque terminale et la MIP ont diminué chez les animaux malades (changement de pli de 2,7 et 2,0 pour le volume, et de 2,5 et 2,0 pour la MIP, chez les souris Smn2B/- et ColQ Dex2/Dex2, respectivement). La tortuosité relative était également plus faible dans les muscles déficients en SMN et ColQ que dans les souris WT (16,97% ± 1,33% dans SMA contre 48,84% ± 5,90% WT souris, et 13,29% ± 2,79% dans CMS contre 30,20% ± 4,44% souris témoins). De plus, la quantification de la distribution des branches terminales de l’axone présynaptique à l’aide de la macro personnalisée ImageJ a révélé une altération de la distribution des neurofilaments M dans les deux modèles animaux, avec une augmentation du marquage immunologique (84,65 % ± 0,32 % contre 16,57 % ± 2,03 % et 23,64 % ± 2,78 % contre 18,77 % ± 1,73 % chez les souris Smn2B/- et ColQDex2/Dex2 par rapport aux témoins, respectivement) (Figure 3A-D ). Par coloration SV2, une réduction de 43 % du taux d’occupation, c’est-à-dire le pourcentage de régions contenant de l’AChR avec des zones actives terminales nerveuses adjacentes, a également été observée chez les souris Smn2B/- (49,36 % ± 3,76 % chez les souris SMA contre 85,69 % ± 2,34 % chez les souris WT) (Figure 3E,F). Ce paramètre NMJ a également été calculé dans l’AG des mutants ColQ Dex2/Dex2, mais aucune différence statistiquement significative n’a été trouvée par rapport aux compagnons de portée témoins (données non présentées).
Nous avons ensuite analysé les caractéristiques de la membrane postsynaptique en quantifiant la distance entre les plis jonctionnels et la largeur des bandes AChR, qui sont situées à la crête de ces plis, dans les muscles déficients en ColQ en utilisant la microscopie à déplétion par émission stimulée à super-résolution (STED). Comme le montre la figure 4, l’aspect de ces structures peut être clairement visualisé par marquage par α-bungarotoxine fluorescente et analyse du profil d’intensité. Nous avons évalué ces paramètres NMJ et constaté une augmentation de la distance de pli jonctionnel (d) et de la largeur (w) des bandes AChR dans le muscle gastrocnémien des mutants (358,3 nm ± 11,97 nm et 320,8 nm ± 10,90 nm pour la distance, et 216,9 nm ± 10,51 nm et 186,3 nm ± 7,015 nm pour la largeur, chez ColQ Dex2 / Dex2 par rapport aux souris de type sauvage, respectivement, p < 0,05) (figure 4C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig01.jpg"> Figure 1 : Organigramme du protocole vidéo pour la caractérisation 3D multi-échelle de la JNM par microscopie confocale et STED. Les muscles tibiaux antérieurs (TA) et gastrocnémiens (GA) ont été prélevés chez des souris, et les fibres musculaires ont été taquinées avant d’être marquées avec α-bungarotoxine-F488 ou α-bungarotoxine-F633, DAPI, des anticorps primaires dirigés contre le neurofilament M (NF-M) et la glycoprotéine 2 des vésicules synaptiques (SV2), et des anticorps secondaires conjugués fluorophore (F488 ou F594). Les piles d’images ont été acquises par microscopie confocale et traitées pour mesurer le volume postsynaptique de la JNM, l’accumulation de NF-M présynaptique, l’occupation terminale de l’axone NMJ, la surface de la plaque terminale de projection d’intensité maximale postsynaptique (MIP) et la tortuosité (d Obj(AB) est la distance entre A et B le long du périmètre de l’objet (ligne rouge), tandis que dEuc(AB) est la distance euclidienne entre A et B (ligne verte)). Pour l’analyse microscopique STED, la largeur des bandes du récepteur de l’acétylcholine (AChR) et la distance entre les plis jonctionnels ont été quantifiées à partir des profils d’intensité de la coloration α-BTX-F633. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig02.jpg"> Figure 2 : Caractérisation multi-paramètres de la NMJ postsynaptique dans des modèles murins d’amyotrophie spinale (SMA) et de syndrome myasthénique congénital (CMS) lié à ColQ. (A) Images représentatives des plaques motrices postsynaptiques des muscles TA et GA marqués avec α-bungarotoxine-F488 (α-BTX). (B) Quantification du volume de la plaque terminale postsynaptique des NMJ, (C) zone de projection de l’intensité maximale (MIP) et (D) tortuosité relative chez les souris de type sauvage (WT) et Smn2B/- âgées de 3 semaines (graphiques de gauche, N = 3 animaux par génotype, n = 37 et n = 56 NMJ, respectivement) et WT et ColQ Dex2/Dex2 âgées de 6 semaines souris (graphiques de droite, N = 5 souris par génotype, n = 89 et n = 97 NMJ, respectivement). Les données sont exprimées sous forme de moyenne par souris (point) ± SEM. Les différences entre les groupes ont été analysées par test de Mann-Whitney (* p < 0,05). La barre d’échelle est de 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig03.jpg"> Figure 3 : Analyse morphométrique de la distribution terminale de l’axone présynaptique dans les muscles de souris WT et mutantes. Modèle d’innervation de la NMJ dans les muscles tibiaux antérieurs (TA) et gastrocnémiens (GA) de souris CMS de type sauvage, SMA et ColQ. (A, B) Jonctions neuromusculaires représentatives de TA de souris WT et Smn2B/- à l’âge de 21 jours marquées avec des anticorps contre le neurofilament M (NF-M, rouge) et la α-bungarotoxine-F488 (α-BTX, vert) (A), et résultats de l’analyse quantitative de l’accumulation de neurofilaments (B); (C, D) Jonctions neuromusculaires représentatives de GA de souris WT et ColQDex2 / Dex2 âgées de 6 semaines marquées avec des anticorps contre le neurofilament M (NF-M, rouge) et α-bungarotoxine-F488 (α-BTX, vert), montrant des plaques terminales postsynaptiques fragmentées et immatures (C), et des résultats de l’accumulation de neurofilaments dans les deux groupes d’animaux (D). N = 4 (n = 34 NMJs) (B) et N = 3 (n = 54 NMJs) (D) WT animaux, et N = 3 (n = 36 NMJs) Smn2B/- et N = 3 (n = 55 NMJs) ColQ Dex2/Dex2 souris ont été analysées dans les expériences (B, D). (E, F) Images représentatives de l’occupation terminale des axones dans les JNM de TA de souris WT et Smn2B/- âgées de 3 semaines marquées avec des anticorps dirigés contre la glycoprotéine 2 des vésicules synaptiques (SV2, rouge) et la α-bungarotoxine-F488 (α-BTX, vert) (E), et les résultats de l’occupation des JNM (rapport volume SV2/AChR) (F). Les muscles de N = 3 (n = 50 NMJs) de type sauvage et de N = 4 (n = 62 NMJs) Smn2B/- souris ont été analysés. Les données sont exprimées sous forme de valeur moyenne par souris (point) ± SEM. Les différences entre les groupes ont été analysées par test de Mann-Whitney (* p < 0,05). Les barres d’échelle sont de 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig04.jpg"> Figure 4 : Imagerie STED des plaques terminales postsynaptiques de la JNM. (A) Image STED représentative d’une JNM marquée à la α-bungarotoxine-F633 (α-BTX) provenant d’un gastrocnémien d’une souris de type sauvage âgée de 6 semaines présentant des rayures AChR post-jonctionnelles (la barre d’échelle est de 5 μm). (B) Grossissement plus élevé d’une région avec des bandes AChR (panneau inférieur) qui a été utilisée pour générer le profil d’intensité. La largeur (w) des bandes AChR et la distance entre deux bandes adjacentes (d) de cette région ont été quantifiées et présentées dans le graphique à barres. Représentation schématique de la plaque d’extrémité postsynaptique pour illustrer la largeur de bande AChR (w) et la distance (d). Ces paramètres, (C) distance de bande AChR et (D) largeur, ont été mesurés chez des souris ColQ Dex2/Dex2 et des compagnons de portée témoins à l’âge de 6 semaines. Les NMJ de 5 WT (total n = 29 NMJ) et de 6 ColQ Dex2/Dex2 (total n = 43 NMJ) ont été analysés à l’aveugle. Les données sont exprimées sous forme de moyenne par souris (point) ± SEM. Les différences statistiques entre les groupes ont été analysées à l’aide du test de Mann-Whitney (* p < 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1 : Lancement du logiciel LAS X et paramètres pour les acquisitions confocales. Les différentes étapes d’acquisition d’images confocales sont décrites aux sections 3.1.2 à 3.1.7 du protocole. Pour chaque acquisition de pile NMJ, un projet est ouvert (étape 3.1.4) et les paramètres de taille d’image, vitesse d’acquisition, axes X, Y et Z sont sélectionnés (étape 3.1.7), avec chaque balayage séquentiel indiqué (Seq.1, laser 405 pour DAPI ; Seq.2, laser 488 pour α-BTX-F488; et Seq.3, laser 552 pour les anticorps secondaires conjugués F594). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 2 : Lancement du logiciel LAS X et paramètres pour les acquisitions de STED. Les étapes pour acquérir des images STED sont décrites dans les sections 3.2.2 à 3.2.8 du protocole. Le microscope est lancé en mode de configuration STED ON (étape 3.2.2), et un projet est ouvert (étape 3.2.3). Les paramètres d’acquisition d’image (étape 3.2.7) (taille de l’image, vitesse d’acquisition, facteur de zoom, axe X), à chaque balayage séquentiel, sont indiqués (Seq.1 pour α-BTX-F633; Seq.2 pour les anticorps secondaires conjugués F488). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%202.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 3 : Images de plis jonctionnels colorés au α-BTX obtenues par microscopie STED. Exemples d’images d’une plaque terminale postsynaptique marquée avec α-BTX-F633 d’une souris de type sauvage âgée de 6 semaines qui ont été acquises avec une mise au point correcte (à gauche) ou incorrecte (à droite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%203.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure 4 supplémentaire : fenêtres contextuelles Windows pour décrire les données d’entrée et de sortie obtenues par les macros ImageJ personnalisées. Des exemples de données d’entrée (fichiers .tif et .lif) d’images NMJ sont affichés dans la colonne de gauche. Les données de sortie des macros (colonne de droite) sont enregistrées dans des dossiers (Save_Volume, Save_Accu) contenant des images de la jonction (.tif) et des feuilles de données contenant les résultats (fichiers .csv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%204.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 5 : Analyse de la distance et de la largeur des bandes AChR à partir d’une acquisition STED à l’aide du logiciel LAS X. Les étapes d’analyse des images NMJ STED sont décrites dans la section 5 du protocole. A) Image d’une région de plaque terminale postsynaptique étiquetée contenant des bandes AChR. La région d’intérêt pour l’analyse des bandes est sélectionnée en traçant une ligne perpendiculaire (ligne verte, pour la distance de bande) ou un rectangle perpendiculaire (rectangle violet, pour la largeur de la bande). (B, C) Les profils d’intensité des régions sélectionnées et les mesures permettant de calculer la distance entre les bandes AChR (B) et la largeur de bande AChR (C) sont affichés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%205.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier de codage supplémentaire 1 : Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. Macro personnalisée ImageJ pour extraire les mesures des paramètres NMJ (volume NMJ, zone de la plaque terminale MIP et tortuosité NMJ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier de codage supplémentaire 2 : Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. Macro personnalisée ImageJ pour extraire l’accumulation NF-M et la coloration SV2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Ce protocole décrit une méthode d’analyse morphométrique des jonctions neuromusculaires par microscopie confocale et STED combinée qui est utilisée pour quantifier les changements pathologiques dans les modèles murins de SMA et de CMS liés à ColQ.

Caractérisation des jonctions neuromusculaires chez la souris par microscopie confocale et super-résolution combinée

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Ce protocole permet d’analyser quantitativement la structure 3D des jonctions neuromusculaires à une résolution proche de la microscopie électronique à l’aide d’une procédure simple. Le principal avantage de ce protocole est que les échantillons musculaires sont traités de manière similaire et immunomarqués pour la microscopie confocale et STED, ce qui réduit le temps nécessaire à l’évaluation précise de la structure de la jonction neuromusculaire dans des modèles animaux. La quantification morphologique que nous avons développée peut être facilement adaptée pour analyser d’autres structures subcellulaires.J’ai le plaisir de vous présenter la Dre Martina Marinello, une scientifique de mon équipe qui montrera comment les taquineries musculaires et les immunocolorations sont effectuées et de donner quelques recommandations pour l’application réussie de ce protocole. J’ai le plaisir de vous présenter le Dr Jérémie Cosette de la plateforme d’imagerie de Généthon qui présentera l’acquisition et l’analyse d’images à l’aide de microscopes confocaux et STED. Après l’euthanasie, commencez à taquiner les muscles antérieurs du tibial en petits faisceaux de fibres d’environ un millimètre de large à l’aide de deux pinces fines dentelées.Ensuite, transférez ces faisceaux musculaires dans une plaque de 24 puits contenant 1% de Triton X-100 préparé dans du PBS et laissez-le agiter doucement pendant une heure à température ambiante ou cinq heures à quatre degrés Celsius. Après avoir lavé les échantillons trois fois pendant cinq minutes avec du PBS à température ambiante, incuber les échantillons avec une solution de blocage composée de 4% BSA préparée dans du PBS avec 1% Triton X-100 pendant quatre heures à quatre degrés Celsius sous agitation douce. Ensuite, incuber les échantillons pendant la nuit avec la même solution de blocage contenant des anticorps monoclonaux primaires contre le neurofilament M ou la glycoprotéine 2 des vésicules synaptiques pour marquer les terminaisons axonales présynaptiques ou les zones actives, respectivement.Le lendemain, lavez les faisceaux musculaires étiquetés trois fois pendant cinq minutes avec du PBS sous agitation douce. Ensuite, incuber avec des anticorps secondaires appropriés en les plaçant sur un agitateur pendant deux heures à température ambiante. Après avoir lavé à nouveau les faisceaux musculaires, placez-les sur une lame avec un support de montage.Ensuite, placez un couvercle en verre de qualité 1,5 sur le dessus, suivi d’aimants cylindriques des deux côtés de la glissière pour appliquer une pression et aplatir les muscles. Pour acquérir des images à l’aide du microscope confocal, lancez le logiciel de microscope et choisissez la machine comme mode de configuration et collectez des piles d’images des jonctions neuromusculaires dans chaque groupe expérimental selon les paramètres mentionnés dans le manuscrit du texte. À la fin de la séance, cliquez sur Ouvrir dans la visionneuse 3D et choisissez une jonction neuromusculaire représentative d’un groupe expérimental pour visualiser l’étiquetage 3D.Pour calculer la jonction neuromusculaire post-synaptique et le volume de la plaque, la surface de projection d’intensité maximale et la tortuosité relative, faites glisser et déposez la macro pour la quantification du volume de la jonction neuromusculaire dans la fenêtre Image J, et lorsque la macro s’ouvre dans une deuxième fenêtre, cliquez sur Macros et exécuter la macro. Sélectionnez le dossier natif contenant les sous-dossiers de jonction à analyser et cliquez sur Sélectionner. Ensuite, dans le menu contextuel d’enregistrement du dossier, sélectionnez le dossier de stockage et cliquez sur Sélectionner.Dans le nouveau menu contextuel appelé Type d’image, sélectionnez le format des acquisitions de la pile Z. Sélectionnez le canal RVB correspondant à la coloration d’intérêt et indiquez X, Y taille de pixel et étape Z. Si des formats de fichier propriétaires sont sélectionnés, la macro lit directement la taille en pixels et l’étape Z.Pour quantifier l’accumulation de neurofilaments présynaptiques, faites glisser et déposez la macro pour la quantification de l’accumulation des jonctions neuromusculaires dans la fenêtre Image J, puis cliquez sur Macros et exécuter la macro. Sélectionnez les sous-dossiers de jonction, le dossier de stockage et le format des acquisitions de pile Z, comme illustré précédemment. Ensuite, dans la fenêtre contextuelle Informations sur la coloration, indiquez l’étiquette et la couleur pré-synaptiques et post-synaptiques et cliquez sur OK.In la fenêtre contextuelle Taille des pixels, indiquez la taille de pixel X, Y comme 0,072 micromètre, l’étape Z comme 0,5 micromètre, puis cliquez sur OK. Si des formats de fichier propriétaires sont sélectionnés, la macro lit directement la taille en pixels et l’étape Z.Pour calculer la distance entre les bandes du récepteur de l’acétylcholine, sélectionnez le menu Quantifier en haut de la fenêtre centrale. Cliquez sur l’onglet Outils, sélectionnez l’intensité, puis cliquez sur l’icône de profil de ligne. Définissez le suréchantillonnage sur un et cochez Trier les canaux.Cliquez sur l’onglet Ouvrir des projets et sélectionnez l’image filtrée à analyser. Ensuite, cliquez sur l’icône de ligne de dessin et tracez une ligne traversant perpendiculairement plusieurs bandes ou plis jonctionnels. Cliquez sur le haut du premier pic et déplacez le pointeur de la souris tout en appuyant sur le bouton gauche de la souris jusqu’à ce que le prochain pic maximum soit atteint.Notez la valeur DX, qui correspond à la distance entre les deux pics. Faites un clic droit sur la souris dans l’image de la fenêtre de droite et sélectionnez Enregistrer les ROI. Après avoir cliqué sur l’icône en forme de flèche, cliquez sur le ROI et supprimez-le en cliquant sur l’icône de la corbeille.Pour calculer la largeur de la bande du récepteur de l’acétylcholine, sélectionnez l’intensité dans le panneau supérieur gauche sous l’onglet Outils, cliquez sur l’icône Déterminer FWHM et cochez les canaux de tri. Cliquez ensuite sur l’onglet Ouvrir des projets et sélectionnez l’image filtrée à analyser. Ensuite, cliquez sur l’icône de dessin rectangulaire dans le menu supérieur de la fenêtre de droite.Sélectionnez une bande horizontale ou verticale et dessinez un rectangle perpendiculairement à la bande. Un profil apparaît dans la fenêtre centrale. Cliquez sur vertical ou horizontal dans le menu Projection moyenne situé dans le panneau de gauche, selon que l’orientation de la bande est verticale ou horizontale.Cliquez sur les statistiques dans la fenêtre centrale pour lire la valeur FWHM, puis enregistrez et supprimez les ROI comme indiqué précédemment. La plaque d’extrémité motrice post-synaptique, marquée avec de l’alpha-bungarotoxine fluorescente, semblait plus petite et fragmentée chez les mutants de deux lignées de souris. La quantification des piles Z de la jonction neuromusculaire à l’aide des macros personnalisées de l’image J a révélé une diminution marquée du volume de la plaque terminale, de la projection de l’intensité maximale et de la tortuosité relative dans les deux modèles de souris malades par rapport aux témoins, indiquant des défauts de maturation de la jonction neuromusculaire.La quantification de la distribution de la branche terminale de l’axone présynaptique à l’aide de la macro personnalisée Image J a révélé un modèle modifié dans la distribution des neurofilaments M dans les deux modèles animaux avec un immunomarquage accru. Grâce à la coloration de la glycoprotéine 2 des vésicules synaptiques, une réduction de 43% du taux d’occupation des régions contenant le récepteur de l’acétylcholine avec des zones actives terminales nerveuses adjacentes a été observée chez les souris Smn 2B/souris. L’aspect des plaques terminales postsynaptiques de la jonction neuromusculaire a été clairement visualisé par marquage de l’alpha-bungarotoxine fluorescente et analyse du profil d’intensité.L’évaluation des paramètres de jonction neuromusculaire a révélé une augmentation de la distance de pli jonctionnel et de la largeur des bandes du récepteur de l’acétylcholine dans le muscle gastrocnémien des mutants. Pour obtenir des résultats fiables, il est crucial de taquiner correctement les muscles, en accordant une attention particulière à la force appliquée pour séparer les faisceaux musculaires. Ce protocole peut aider à obtenir une caractérisation morphologique plus approfondie de la jonction neuromusculaire, qui n’était auparavant prise en compte que par des procédures complexes et longues, telles que la microscopie électronique à transmission.La procédure d’imagerie STED a ouvert la voie à l’étude de nouvelles connaissances concernant les marqueurs pré et post-synaptiques, qui contribuent à la physiopathologie des maladies affectant la jonction neuromusculaire.

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