Name: characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy
Uploaded: 2021-12-08T13:00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Wir danken der "Imaging and Cytometry Core Facility" von Genethon sowie dem histologischen Dienst, die teilweise durch Ausrüstungsfonds der Region Ile-de-France, des Conseil General de l'Essonne, der Genopole Recherche von Evry, der Universität Evry Val d'Essonne und des INSERM, Frankreich, unterstützt werden. Wir danken auch Dr. Rashmi Kothary für die Bereitstellung der Mauslinie Smn 2B/2B (University of Ottawa, Kanada) und Dr. Eric Krejci für die Mauslinie ColQDex2/+ (unveröffentlicht, Universität Paris, Frankreich). Wir danken Guillaume Corre für seine Unterstützung bei der statistischen Analyse. Die monoklonalen Antikörper 2H3 (entwickelt von Jessel, T.M. und Dodd, J.) und SV2 (entwickelt von Buckley, K.M.) wurden von der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) erhalten, die vom NICHD des NIH erstellt und an der University of Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242, gepflegt wird. Diese Arbeit wurde von der Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon), dem INSERM und der Universität Evry Val d'Essonne unterstützt.

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Werk.

Das beschriebene Videoprotokoll bietet eine detaillierte Methode zur Quantifizierung der 3D-Struktur neuromuskulärer Verbindungen durch Kombination von konfokaler und STED-Mikroskopie, mit der pathologische Veränderungen auf prä- und postsynaptischer Ebene charakterisiert werden können. Die hohe Auflösung der STED-Mikroskopie ermöglicht die Visualisierung und morphometrische Analyse von Nanostrukturen, die mit herkömmlicher konfokaler Bildgebung nicht identifizierbar sind. Dieses Verfahren ermöglichte es uns, strukturelle Veränderungen von NMJs in zwei appendikulären Muskeln, Tibialis anterior und Gastrocnemius, von SMA- und ColQ-verwandten CMS-Mäusen zu messen.
Um zuverlässige Ergebnisse mit dieser Technik zu erzielen, ist es wichtig, die Muskeln richtig zu sezieren und zu necken, wobei besonders auf die Faszien geachtet wird, die den Muskel umgeben, und die angewandte Kraft, um Muskelbündel zu trennen. Andernfalls könnte das Innervationsmuster gestört werden, was eine ordnungsgemäße präsynaptische NMJ-Beurteilung behindert. Obwohl detaillierte Informationen zur Analyse von NMJs aus TA und GA bereitgestellt werden, könnte dieses Protokoll prinzipiell an andere Muskeln angepasst werden, einschließlich flacher Muskeln, wie dem Zwerchfell oder dem transversalen Abdominis37, die den neckenden Schritt nicht erfordern. Die Gewebefixierung ist ebenfalls entscheidend, um eine gute Färbungsqualität zu gewährleisten. Daher wird empfohlen, hochwertiges PFA in einem geeigneten Volumen (15-20-mal so viel wie der Muskel) zu verwenden. Darüber hinaus ist die Belichtungszeit gegenüber dem Fixiermittel ein wichtiger Schritt, da Artefakte wie Schrumpfung und Verklumpung aufgrund von Überfixierung auftreten und NMJ-Merkmale beeinflussen können. Angesichts der Größe der Proben und der Eindringrate der Paraformaldehydlösung in Gewebe38 wird für diesen Muskeltyp eine Fixationszeit von 18-24 h empfohlen. Falls der Färbeschritt mehr als eine Woche nach der Gewebeentnahme geplant ist, wird empfohlen, PFA-fixierte Muskeln in PBS mit Natriumazid bei 4 °C zu halten, um eine bakterielle Proliferation zu verhindern.
Dieses Protokoll stellt einen Ansatz dar, der α-BTX-F488 für die konfokale und α-BTX-F633 für die STED-Bildgebung verwendet. Diese Fluorophore wurden so ausgewählt, dass sie zum beschriebenen experimentellen Design passen, können jedoch entsprechend den verfügbaren Geräten und Materialien modifiziert werden. Beispielsweise kann die α-BTX F488-Beschriftung ausgewählt werden, wenn ein STED CW 592 nm-Laser zur Bildaufnahme und Quantifizierung verwendet wird. Es scheint jedoch, dass die in der vorliegenden Studie verwendete Konfiguration (gepulste Anregung mit STED, 775 nm Verarmung) eine höhere Leistung und eine bessere Auflösung aufweist als andere Ansätze, wie z. B. Dauerstrich STED39, wodurch sie für die aktuelle Anwendung besser geeignet ist. Es ist auch wichtig, die Laserleistungseinstellungen sorgfältig auszuwählen, insbesondere für STED (sowohl Anregung als auch Verarmung), da die Eigenschaften eines Intensitätsprofils im Falle einer Sättigung nicht gemessen werden können und daher jedes gesättigte Signal in einem NMJ-Bild die gesamte Analyse gefährden könnte.
Dieser detaillierte Workflow, einschließlich Bildaufnahmen und -analysen mit Mikroskopsoftware und ImageJ-Makros, wurde entwickelt, um eine autonome NMJ-morphometrische Analyse durch konfokale und STED-Mikroskopie von einem einzigen Muskel aus zu ermöglichen. Zuvor beschriebene Arbeitsabläufe für die konfokale NMJ-Analyse wie NMJ-morph2 oder NMJ-Analyser14 ebneten den Weg für die Entwicklung halbautomatischer Methoden, die morphologische Analysen von NMJs und vergleichende Studien ermöglichen. NMJ-morph (und seine aktualisierte Version aNMJ-morph15) ist eine freie ImageJ-basierte Plattform, die die maximale Intensitätsprojektion verwendet, um 21 morphologische Merkmale zu messen, und NMJ-Analyser verwendet ein in Python entwickeltes Skript, das 29 relevante Parameter aus der gesamten 3D-NMJ-Struktur generiert. Die manuelle Schwellenwertbestimmung ist der einzige Schritt während der Bildverarbeitung bei diesen beiden Methoden, die eine Benutzeranalyse erfordern. Dieses integrierte Protokoll beschreibt die Schritte für die Gewebevorbereitung, die konfokale 3D-Bildaufnahme und die ImageJ-basierte Verarbeitung von NMJs aus ganzen Skelettmuskeln und bietet einen vereinfachten Überblick über fünf wichtige Parameter der postsynaptischen (Volumen, maximale Projektionsfläche und Tortuosität) und präsynaptischen (Axonterminalbelegung und Neurofilamentakkumulation) Endplatten. Ein zusätzlicher Parameter von biologischer Relevanz, das AChR-Organisationsmuster der postsynaptischen Verbindungsfalten, wurde für die morphometrische Analyse auf nanoskaliger Ebene durch hochauflösende STED-Mikroskopie (Auflösung 20-30 nm) integriert40. Interessanterweise ist die Gewebevorbereitung für die STED-Bildgebung einfacher als andere Methoden, die für NMJ-Ultrastrukturstudien verwendet werden, wie die konventionelle Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)9, ein ziemlich komplexes und zeitaufwendiges Verfahren, das einen erfahrenen Manipulator erfordert, um ultradünne Abschnitte der entsprechenden Muskelregion zu erhalten. Darüber hinaus können quantitative Daten aus mehreren Verbindungsfalten mithilfe der STED-assoziierten Software automatisch abgerufen werden.
Dieses Protokoll wurde angewendet, um bereits bekannte NMJ-Defekte in SMN- und ColQ-defizienten Muskeln 20,36,41,42 zu veranschaulichen. Gemeinsame Veränderungen wurden in den beiden Mausmodellen durch konfokale Mikroskopie gefunden, wie z.B. vermindertes postsynaptisches Endplattenvolumen, MIP-Fläche und relative Tortuosität sowie erhöhte Neurofilamentakkumulation, während einige spezifischere Befunde (verminderte NMJ-Belegung) nur bei SMA-Mäusen als Indikator für einen gestörten Vesikeltransport beobachtet wurden36. Schließlich wurde eine Zunahme des AChR-Streifenabstands und der AChR-Breite in ColQ-KO durch STED-Analyse festgestellt, die Anzeichen für ultrastrukturelle Defekte in den postsynaptischen Verbindungsfalten sind, wie zuvor von TEM20 beobachtet. Wichtig ist, dass dieses Protokoll zu einer tieferen morphologischen Charakterisierung neuromuskulärer Verbindungen während der Entwicklung, Aufrechterhaltung und unter verschiedenen pathologischen Bedingungen beitragen kann.

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist eine komplexe Struktur, die aus einem motorischen Axonterminal, einer perisynaptischen Schwann-Zelle und einem skelettalen Myofaserteil besteht, der an der Übertragung chemischer Informationen und der Kopplung der Aktivität der unteren Motoneuronen an die Muskelkontraktion beteiligt ist. Bei Säugetieren ändert sich die Morphologie der neuromuskulären Verbindung während der Entwicklung, nimmt nach der Reifung eine typische brezelartige Form an, mit Unterschieden in Form und Komplexität zwischen den Arten, und zeigt ein gewisses Maß an Plastizität als Reaktion auf physiologische Prozesse wie Bewegung oder Alterung 1,2,3,4 . Die postsynaptische motorische Endplatte bildet Membraninvaginationen, die als Junctionfalten bezeichnet werden, wobei der obere Teil, der Acetylcholinrezeptoren (AChR) enthält, in engem Kontakt mit dem präsynaptischen terminalen Axonzweig5 steht.
Morphologische und funktionelle Veränderungen neuromuskulärer Verbindungen tragen zur Pathophysiologie verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen wie spinale Muskelatrophie (SMA) und amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Myopathien wie Duchenne-Muskeldystrophie (DMD), kongenitale myasthenische Syndrome (CMS), Myasthenia gravis (MG) und zentronukleäre Myopathien (CNM) sowie altersassoziierte Sarkopenie 3,6,7,8,9 bei. 10,11,12. Bei diesen Erkrankungen werden NMJ-Strukturveränderungen wie Endplattenfragmentierung, reduzierte postsynaptische Verbindungsfaltengröße und/oder Denervierung beobachtet. Die Pathologie von NMJs kann ein primäres oder frühes Ereignis während der Krankheitsprogression sein oder in jüngerer Zeit als sekundäres Ereignis auftreten, das zu den klinischen Manifestationen beiträgt. In jedem Fall stellt die Überwachung der Morphologie von NMJs in Tiermodellen dieser Krankheiten einen wertvollen Parameter dar, um pathologische Veränderungen zu untersuchen und die Wirksamkeit potenzieller Behandlungen zu bewerten.
Die Morphologie neuromuskulärer Verbindungen wird in der Regel mit Techniken der konfokalen Mikroskopie 2,13,14,15 oder der Elektronenmikroskopie 5,16 mit ihren inhärenten Einschränkungen wie Auflösung bzw. technischen Schwierigkeiten analysiert. In jüngerer Zeit wurde die hochauflösende Mikroskopie auch verwendet, um bestimmte Regionen des NMJ, wie präsynaptische aktive Zonen oder AChR-Verteilung auf der postsynaptischen Membran16,17,18, als alternativen oder ergänzenden Ansatz zur ultrastrukturellen Analyse durch Elektronenmikroskopie zu visualisieren.
Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine detaillierte und reproduzierbare Methode zur Bewertung morphologischer NMJ-Parameter durch die Kombination von konfokaler Fluoreszenzmikroskopie und stimulierter Emissionsverarmung (STED) bereitzustellen. Wichtige Merkmale der präsynaptischen und postsynaptischen Endplatten, wie Volumen, Fläche, relative Tortuosität, AChR-Streifenbreite und Axonterminalverteilung in innervierten neckischen Muskelfasern von Mausgastrocnemius und Tibialis anterior wurden im Kontext normaler und kranker Bedingungen quantifiziert. Insbesondere wurden NMJ-Defekte im Smn2B/- Mausmodell der spinalen Muskelatrophie, einer neuromuskulären Erkrankung mit Motoneurondegeneration, die durch Mutationen im SMN1-Gen 11,19 verursacht wird, und in einer kollagenartigen Schwanzuntereinheit von asymmetrischen Acetylcholinesterase-Knockout-Mäusen (ColQ Dex2/Dex2 oder ColQ-KO) als Modell des kongenitalen myasthenischen Syndroms20 veranschaulicht. 21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Buffers and Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 &#945;-bungarotoxin (F488-a-BTX)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>B13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATTO-633 &#945;-bungarotoxin (F633-a-BTX)</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-100-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS</td>
			<td>Gibco, Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol Absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion Oil, n = 1.518</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>MOIL-10LF&#160;</td>
			<td>Low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurofilament (NF-M) antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_531793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.04005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_2315387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alnico Button cylindrical magnets</td>
			<td>Farnell France</td>
			<td>E822</td>
			<td>diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >63x 1.4 NA magnitude oil immersion&#160; HCX Plan Apo CS objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Curved thin forceps-Moria iris forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra thin scissors - Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15-003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel loading tip round 1-200 &#181;L</td>
			<td>COSTAR</td>
			<td>4853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue&#160;</td>
			<td>Whatman (GE Healthcare)</td>
			<td>2105-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170&#177;5 &#181;m</td>
			<td>Marienfield</td>
			<td>107222</td>
			<td>High precision</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (12-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (24-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safeshield scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.40.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost plus slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GraphPad&#160;</td>
			<td>Prism, San Diego (US)</td>
			<td>Release N&#176;6.07</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Release N&#176; 1.53f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Release N&#176;3.7.2.2283</td>
			<td >Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy

Neuromuskuläre Verbindungen (NMJs) sind hochspezialisierte Synapsen zwischen unteren Motoneuronen und Skelettmuskelfasern, die eine wesentliche Rolle bei der Übertragung von Molekülen vom Nervensystem auf willkürliche Muskeln spielen, was zu einer Kontraktion führt. Sie sind bei vielen menschlichen Krankheiten betroffen, einschließlich erblicher neuromuskulärer Erkrankungen wie Duchenne-Muskeldystrophie (DMD), kongenitalen myasthenischen Syndromen (CMS), spinaler Muskelatrophie (SMA) und amyotropher Lateralsklerose (ALS). Daher stellt die Überwachung der Morphologie neuromuskulärer Verbindungen und ihrer Veränderungen in Krankheitsmausmodellen ein wertvolles Werkzeug für pathologische Studien und die präklinische Bewertung therapeutischer Ansätze dar. Hier werden Methoden zur Markierung und Analyse der dreidimensionalen (3D) Morphologie der prä- und postsynaptischen Teile motorischer Endplatten aus murinen neckischen Muskelfasern beschrieben. Die Verfahren zur Probenvorbereitung und zur Messung des NMJ-Volumens, der Fläche, der Tortuosität und der Axonterminalmorphologie/-belegung durch konfokale Bildgebung sowie des Abstands zwischen postsynaptischen Verbindungsfalten und der Streifenbreite des Acetylcholinrezeptors (AChR) durch hochauflösende Stimulated Emission Depletion (STED)-Mikroskopie sind detailliert. Veränderungen dieser NMJ-Parameter sind bei mutierten Mäusen dargestellt, die von SMA und CMS betroffen sind.

Um die morphologische Analyse neuromuskulärer Verbindungen auf prä- und postsynaptischer Ebene reproduzierbar zu erleichtern, wurde ein Workflow von der Muskelentnahme bis zur Bildgebung und Quantifizierung mit der Mikroskopsoftware und ImageJ Custom Macros entwickelt (Abbildung 1). Um den Nutzen dieses Protokolls zu veranschaulichen, wurde die Morphologie von NMJs in zwei Mausmodellen genetischer Störungen, Smn2B /- und ColQDex2/Dex2-Mäusen , die von spinaler Muskelatrophie (SMA) bzw. einer angeborenen myasthenischen Syndromform (CMS) betroffen sind, ausgewertet und die Daten mit altersangepassten Kontroll-Wurfgeschwistern verglichen.
Die NMJ-Struktur wurde anhand von Tibialis anterior- und Gastrocnemius-Muskeln von 3- und 6 Wochen alten Smn2B/- (C57Bl/6 Hintergrund) bzw. ColQDex2/Dex2 (B6D2F1/J Hintergrund) Mäusen beurteilt, wenn bei diesen Tieren bereits Anzeichen der Krankheit vorhanden sind. Im Alter von 3 Wochen zeigen Smn2B/- Mäuse Anzeichen einer verzögerten Skelettmuskelentwicklung und Denervierung, wie NMJ-Atrophie und Verlust35,36. CMS-Mäuse haben eine primäre Pathologie bei NMJs und zeigen eine Verringerung des Körpergewichts ab der ersten Lebenswoche und eine ausgeprägte Muskelschwäche20 (Daten nicht gezeigt). Wie in Abbildung 2A gezeigt, erschien die postsynaptische motorische Endplatte, die mit fluoreszierendem α-Bungarotoxin markiert war, in Mutanten der beiden Mauslinien durch konfokale Mikroskopie kleiner und/oder fragmentiert. Die Quantifizierung von NMJ-Z-Stacks mit diesen kundenspezifischen ImageJ-Makros zeigte deutliche Abnahmen des Endplattenvolumens, der maximalen Intensitätsprojektion (MIP) und der relativen Tortuosität sowohl bei SMA- als auch bei CMS-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen als Anzeichen für NMJ-Reifungsdefekte32 (Abbildung 2B-D). Postsynaptisches Endplattenvolumen und MIP waren bei erkrankten Tieren vermindert (Faltenänderung von 2,7 und 2,0 für Volumen und 2,5 und 2,0 für MIP bei Smn2B/- bzw. ColQ Dex2/Dex2 Mäusen). Die relative Tortuosität war auch bei SMN- und ColQ-defizienten Muskeln geringer als bei WT (16,97% ± 1,33% bei SMA versus 48,84% ± 5,90% WT-Mäusen und 13,29% ± 2,79% bei CMS gegenüber 30,20% ± 4,44% Kontrollmäusen). Darüber hinaus zeigte die Quantifizierung der Verteilung präsynaptischer axonendlicher Zweige mit dem benutzerdefinierten Makro ImageJ ein verändertes Muster in der Verteilung von Neurofilament M in den beiden Tiermodellen mit erhöhter Immunmarkierung (84,65% ± 0,32% versus 16,57% ± 2,03% und 23,64% ± 2,78% versus 18,77% ± 1,73% bei Smn2B/- und ColQ Dex2/Dex2 Mäusen im Vergleich zu Kontrollen) (Abbildung 3A-D ). Durch SV2-Färbung wurde auch bei Smn2B/- Mäusen (49,36% ± 3,76% bei SMA versus 85,69% ± 2,34% WT-Mäusen) eine 43%ige Reduktion des Belegungsverhältnisses, d.h. Prozent der AChR-haltigen Regionen mit benachbarten nerventerminalen aktiven Zonen, beobachtet (Abbildung 3E,F). Dieser NMJ-Parameter wurde auch in GA von ColQ Dex2/Dex2-Mutanten berechnet, aber es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied im Vergleich zu Kontroll-Wurfgeschwistern gefunden (Daten nicht gezeigt).
Wir analysierten die postsynaptischen Membraneigenschaften weiter, indem wir den Abstand zwischen den Verbindungsfalten und die Breite der AChR-Streifen, die sich am Kamm dieser Falten befinden, in ColQ-defizienten Muskeln unter Verwendung von hochauflösender stimulierter Emissionsverarmung (STED) Mikroskopie quantifizierten. Wie in Abbildung 4 gezeigt, kann der Aspekt dieser Strukturen durch fluoreszierende α-Bungarotoxin-Markierung und Intensitätsprofilanalyse deutlich visualisiert werden. Wir bewerteten diese NMJ-Parameter und fanden eine Zunahme des Verbindungsfaltenabstands (d) und der Breite (w) von AChR-Streifen im Musculus gastrocnemius von Mutanten (358,3 nm ± 11,97 nm und 320,8 nm ± 10,90 nm für die Entfernung und 216,9 nm ± 10,51 nm und 186,3 nm ± 7,015 nm für die Breite, in ColQ Dex2/Dex2 im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen. jeweils p < 0,05) (Abbildung 4C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig01.jpg"> Abbildung 1: Flussdiagramm des Videoprotokolls zur 3D-Multiskalen-NMJ-Charakterisierung mittels konfokaler und STED-Mikroskopie. Tibialis anterior (TA) und Gastrocnemius (GA) Muskeln wurden von Mäusen gesammelt, und Muskelfasern wurden gehänselt, bevor sie mit α-Bungarotoxin-F488 oder α-Bungarotoxin-F633, DAPI, primären Antikörpern gegen Neurofilament M (NF-M) und synaptischem Vesikelglykoprotein 2 (SV2) und Fluorophor (F488 oder F594)-konjugierten sekundären Antikörpern markiert wurden. Bildstapel wurden mittels konfokaler Mikroskopie aufgenommen und verarbeitet, um das postsynaptische NMJ-Volumen, die präsynaptische NF-M-Akkumulation, die NMJ-Axonterminalbelegung, die postsynaptische Maximumintensitätsprojektion (MIP) und die Tortuosität zu messen (d Obj(AB) ist der Abstand zwischen A und B entlang des Objektumfangs (rote Linie), während dEuc(AB) ist der euklidische Abstand zwischen A und B (grüne Linie)). Für die STED-Mikroskopieanalyse wurden die Breite der Acetylcholinrezeptor (AChR)-Streifen und der Abstand zwischen den Verbindungsfalten aus Intensitätsprofilen der α-BTX-F633-Färbung quantifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig02.jpg"> Abbildung 2: Multiparameter-postsynaptische NMJ-Charakterisierung in Mausmodellen der spinalen Muskelatrophie (SMA) und des ColQ-assoziierten kongenitalen myasthenischen Syndroms (CMS). (A) Repräsentative Bilder von postsynaptischen motorischen Endplatten aus TA- und GA-Muskeln, markiert mit α-Bungarotoxin-F488 (α-BTX). (B) Quantifizierung des postsynaptischen NMJ-Endplattenvolumens, (C) der Projektionsfläche maximaler Intensität (MIP) und (D) relativer Tortuosität in TA von 3 Wochen alten Wildtyp- (WT) und Smn2B/- Mäusen (linke Grafiken, N = 3 Tiere pro Genotyp, n = 37 bzw. n = 56 NMJs) und 6 Wochen alten WT und ColQ Dex2/Dex2 Mäuse (rechte Grafiken, N = 5 Mäuse pro Genotyp, n = 89 bzw. n = 97 NMJs). Die Daten werden als Mittelwert pro Maus (Punkt) ± REM ausgedrückt. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit dem Mann-Whitney-Test (* p < 0,05) analysiert. Der Maßstabsbalken beträgt 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig03.jpg"> Abbildung 3: Morphometrische Analyse der präsynaptischen axonterminalen Verteilung in Muskeln von WT- und mutierten Mäusen. NMJ-Innervationsmuster in Tibialis anterior (TA) und Gastrocnemius (GA) Muskeln von Wildtyp-, SMA- und ColQ-verwandten CMS-Mäusen. (A, B) Repräsentative neuromuskuläre Verbindungen aus TA von WT- und Smn2B/- Mäusen im Alter von 21 Tagen, markiert mit Antikörpern gegen Neurofilament M (NF-M, rot) und α-Bungarotoxin-F488 (α-BTX, grün) (A), und Ergebnisse der quantitativen Analyse der Neurofilamentakkumulation (B); (C, D) Repräsentative neuromuskuläre Verbindungen von GA von 6 Wochen alten WT- und ColQ Dex2/Dex2-Mäusen, markiert mit Antikörpern gegen Neurofilament M (NF-M, rot) und α-Bungarotoxin-F488 (α-BTX, grün), zeigten fragmentierte und unreife postsynaptische Endplatten (C) und Ergebnisse der Neurofilamentakkumulation in den beiden Tiergruppen (D). N= 4 (n = 34 NMJs) (B) und N = 3 (n = 54 NMJs) (D) WT-Tiere, und N=3 (n = 36 NMJs) Smn2B/- und N = 3 (n = 55 NMJs) ColQ Dex2/Dex2-Mäuse wurden in den Experimenten analysiert (B, D). (E, F) Repräsentative Bilder der Axonterminalbelegung in NMJs aus TA von 3 Wochen alten WT- und Smn 2B/-Mäusen, markiert mit Antikörpern gegen synaptisches Vesikel-Glykoprotein 2 (SV2, rot) und α-Bungarotoxin-F488 (α-BTX, grün) (E), und Ergebnisse der NMJ-Belegung (SV2/AChR-Volumenverhältnis) (F). Muskeln von N = 3 (n = 50 NMJs) Wildtyp- und N = 4 (n = 62 NMJs) Smn2B/- Mäusen wurden analysiert. Die Daten werden als Mittelwert pro Maus (Punkt) ± REM ausgedrückt. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit dem Mann-Whitney-Test (* p < 0,05) analysiert. Maßstabsbalken sind 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig04.jpg"> Abbildung 4: STED-Bildgebung von NMJ-postsynaptischen Endplatten. (A) Repräsentatives STED-Bild eines NMJ, markiert mit α-Bungarotoxin-F633 (α-BTX) von Gastrocnemius einer 6 Wochen alten Wildtyp-Maus mit postjunctionalen AChR-Streifen (Maßstabsbalken ist 5 μm). (B) Höhere Vergrößerung eines Bereichs mit AChR-Streifen (unteres Bild), der zur Erzeugung des Intensitätsprofils verwendet wurde. Die Breite (w) von AChR-Streifen und der Abstand zwischen zwei benachbarten Streifen (d) dieser Region wurden quantifiziert und im Balkendiagramm dargestellt. Schematische Darstellung der postsynaptischen Endplatte zur Veranschaulichung der AChR-Streifenbreite (w) und des Abstands (d). Diese Parameter, (C) AChR-Streifenabstand und (D) Breite, wurden bei ColQ Dex2/Dex2-Mäusen und Kontroll-Wurfgeschwistern im Alter von 6 Wochen gemessen. NMJs von 5 WT (insgesamt n = 29 NMJs) und 6 ColQ Dex2/Dex2 (insgesamt n = 43 NMJs) Tieren wurden blind analysiert. Die Daten werden als Mittelwert pro Maus (Punkt) ± REM ausgedrückt. Statistische Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit dem Mann-Whitney-Test (* p < 0,05) analysiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Einführung der LAS X-Software und Parameter für konfokale Erfassungen. Die verschiedenen Schritte zur Aufnahme konfokaler Bilder sind in den Abschnitten 3.1.2 bis 3.1.7 des Protokolls beschrieben. Für jede NMJ-Stack-Erfassung wird ein Projekt geöffnet (Schritt 3.1.4) und die Parameter Bildgröße, Aufnahmegeschwindigkeit, X-, Y- und Z-Achsen ausgewählt (Schritt 3.1.7), wobei jeder sequentielle Scan angezeigt wird (Seq.1, Laser 405 für DAPI; Seq.2, Laser 488 für α-BTX-F488; und Seq.3, Laser 552 für F594 konjugierte sekundäre Antikörper). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 2: Einführung der LAS X-Software und Parameter für STED-Akquisitionen. Die Schritte zur Erfassung von STED-Bildern sind in den Abschnitten 3.2.2 bis 3.2.8 des Protokolls beschrieben. Das Mikroskop wird im Konfigurationsmodus STED ON gestartet (Schritt 3.2.2) und ein Projekt wird geöffnet (Schritt 3.2.3). Die Parameter für die Bildaufnahme (Schritt 3.2.7) (Bildgröße, Aufnahmegeschwindigkeit, Zoomfaktor, X-Achse) werden bei jedem sequentiellen Scan angegeben (Seq.1 für α-BTX-F633; Seq.2 für F488 konjugierte sekundäre Antikörper). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%202.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 3: Bilder von α-BTX-gefärbten Verbindungsfalten, die durch STED-Mikroskopie erhalten wurden. Bildbeispiele einer postsynaptischen Endplatte, beschriftet mit α-BTX-F633 von einer 6 Wochen alten Wildtyp-Maus, die entweder mit einem korrekten (links) oder falschen Fokus (rechts) aufgenommen wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%203.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 4: Windows-Popups zum Beschreiben der Eingabe- und Ausgabedaten, die von den benutzerdefinierten ImageJ-Makros abgerufen werden. Beispiele für Eingabedaten (.tif und .lif-Dateien) von NMJ-Bildern werden in der linken Spalte angezeigt. Die Ausgabedaten der Makros (rechte Spalte) werden in Ordnern (Save_Volume, Save_Accu) gespeichert, die Bilder der Kreuzung (.tif) und Datenblätter mit den Ergebnissen (.csv Dateien) enthalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%204.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 5: AChR-Streifenabstands- und -breitenanalyse aus einer STED-Erfassung mit der LAS X-Software. Die Schritte zur Analyse von NMJ-STED-Bildern sind in Abschnitt 5 des Protokolls beschrieben. A) Bild einer markierten postsynaptischen Endplattenregion mit AChR-Streifen. Der für die Streifenanalyse interessierende Bereich wird ausgewählt, indem eine senkrechte Linie (grüne Linie für Streifenabstand) oder ein senkrechtes Rechteck (violettes Rechteck für Streifenbreite) gezeichnet wird. (B, C) Es werden Intensitätsprofile der ausgewählten Bereiche und Messungen zur Berechnung des Abstands zwischen AChR-Streifen (B) und der AChR-Streifenbreite (C) gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%205.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Kodierungsdatei 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. Benutzerdefiniertes ImageJ-Makro zum Extrahieren von NMJ-Parametermessungen (NMJ-Volumen, MIP-Endplattenfläche und NMJ-Tortuosität). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Kodierungsdatei 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. ImageJ benutzerdefiniertes Makro zum Extrahieren von NF-M-Akkumulation und SV2-Färbung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur morphometrischen Analyse neuromuskulärer Verbindungen durch kombinierte konfokale und STED-Mikroskopie, die zur Quantifizierung pathologischer Veränderungen in Mausmodellen von SMA und ColQ-bezogenen CMS verwendet wird.

Charakterisierung neuromuskulärer Verbindungen bei Mäusen mittels kombinierter konfokaler und hochauflösender Mikroskopie

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Dieses Protokoll hilft, die 3D-Struktur neuromuskulärer Verbindungen mit einer Auflösung nahe der Elektronenmikroskopie mit einem einfachen Verfahren quantitativ zu analysieren. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass Muskelproben für die konfokale und STED-Mikroskopie ähnlich verarbeitet und immunmarkiert werden, wodurch die Zeit für die genaue Bewertung der neuromuskulären Verbindungsstruktur in Tiermodellen verkürzt wird. Die von uns entwickelte morphologische Quantifizierung kann leicht angepasst werden, um andere subzelluläre Strukturen zu analysieren.Es ist mir eine Freude, Dr. Martina Marinello, eine Wissenschaftlerin aus meinem Team, vorzustellen, die zeigen wird, wie Muskelnecken und Immunfärbungen durchgeführt werden, und einige Empfehlungen für die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls geben wird. Ich freue mich, Dr. Jeremie Cosette von der Bildgebungsplattform von Genethon vorzustellen, der die Bildaufnahme und -analyse mit konfokalen und STED-Mikroskopen zeigen wird. Nach der Euthanasierung beginnen Sie, die Tibialis-vorderen Muskeln in kleinen Faserbündeln von etwa einem Millimeter Breite mit zwei feinen gezackten Pinzetten zu necken.Dann übertragen Sie diese Muskelbündel in eine 24-Well-Platte mit 1% Triton X-100, die in PBS hergestellt wurde, und lassen Sie sie eine Stunde bei Raumtemperatur oder fünf Stunden bei vier Grad Celsius sanft rühren. Nach dreimaligem Waschen der Proben für fünf Minuten mit PBS bei Raumtemperatur inkubieren die Proben mit einer Blockierlösung aus 4%BSA, die in PBS mit 1% Triton X-100 hergestellt wurde, vier Stunden lang bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren. Dann inkubieren Sie die Proben über Nacht mit der gleichen Blocklösung, die primäre monoklonale Antikörper gegen entweder Neurofilament M oder synaptisches Vesikelglykoprotein 2 enthält, um präsynaptische Axonterminals bzw. aktive Zonen zu markieren.Am nächsten Tag waschen Sie die markierten Muskelbündel dreimal für fünf Minuten mit PBS unter sanftem Rühren. Dann inkubieren Sie sie mit geeigneten sekundären Antikörpern, indem Sie sie für zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einen Shaker legen. Nachdem Sie die Muskelbündel erneut gewaschen haben, legen Sie sie auf einen Schieber mit Montagemedium.Legen Sie dann einen 1,5-Grad-Glasdeckel auf die Oberseite, gefolgt von zylindrischen Magneten auf beiden Seiten des Objektträgers, um Druck auszuüben und die Muskeln abzuflachen. Um Bilder mit dem konfokalen Mikroskop zu erfassen, starten Sie die Mikroskopsoftware und wählen Sie Maschine als Konfigurationsmodus und sammeln Sie Bildstapel der neuromuskulären Verbindungen in jeder experimentellen Gruppe gemäß den im Textmanuskript genannten Einstellungen. Klicken Sie am Ende der Sitzung auf Im 3D-Viewer öffnen und wählen Sie eine neuromuskuläre Verbindung, die für eine experimentelle Gruppe repräsentativ ist, um die 3D-Beschriftung zu visualisieren.Wählen Sie im neuen Popupmenü "Bildtyp" das Format der Z-Stack-Erfassungen aus. Wählen Sie den RGB-Kanal aus, der der gewünschten Färbung entspricht, und geben Sie X, Y-Pixelgröße und Z-Schritt an. Wenn proprietäre Dateiformate ausgewählt sind, liest das Makro direkt die Pixelgröße und den Z-Schritt.Um den Abstand zwischen den Acetylcholinrezeptorstreifen zu berechnen, wählen Sie das Menü Quantifizieren oben im mittleren Fenster. Klicken Sie auf die Registerkarte Extras, wählen Sie Intensität und klicken Sie auf das Linienprofilsymbol. Setzen Sie Oversampling auf eins und aktivieren Sie Kanäle sortieren.Klicken Sie auf die Registerkarte Projekte öffnen und wählen Sie das gefilterte Bild aus, das analysiert werden soll. Klicken Sie dann auf das Symbol "Linie zeichnen" und zeichnen Sie eine Linie nach, die senkrecht mehrere Streifen oder Verbindungsfalten kreuzt. Klicken Sie auf die Spitze des ersten Gipfels und bewegen Sie den Mauszeiger mit gedrückter linker Maustaste, bis der nächste maximale Gipfel erreicht ist.Beachten Sie den DX-Wert, der dem Abstand zwischen den beiden Spitzen entspricht. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, während Sie sich im Bild des rechten Fensters befinden, und wählen Sie ROIs speichern. Nachdem Sie auf das Pfeilsymbol geklickt haben, klicken Sie auf den ROI und löschen Sie ihn, indem Sie auf das Papierkorbsymbol klicken.Um die Breite des Acetylcholinrezeptorstreifens zu berechnen, wählen Sie die Intensität oben links unter der Registerkarte Extras, klicken Sie auf das Symbol FWHM bestimmen und aktivieren Sie die Sortierkanäle. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Projekte öffnen und wählen Sie das gefilterte Bild aus, das analysiert werden soll. Klicken Sie anschließend auf das Symbol zum Zeichnen des Rechtecks im oberen Menü des rechten Fensters.Wählen Sie einen horizontalen oder vertikalen Streifen aus, und zeichnen Sie ein Rechteck senkrecht zum Streifen. Im mittleren Fenster wird ein Profil angezeigt. Klicken Sie im Menü "Durchschnittliche Projektion" im linken Bereich auf "Vertikal" oder "Horizontal", je nachdem, ob die Streifenausrichtung vertikal oder horizontal ist.Klicken Sie auf die Statistik im zentralen Fenster, um den FWHM-Wert zu lesen und dann die ROIs wie zuvor demonstriert zu speichern und zu löschen. Die postsynaptische motorische Endplatte, markiert mit fluoreszierendem alpha-Bungarotoxin, erschien in den Mutanten zweier Mauslinien kleiner und fragmentiert. Die Quantifizierung der neuromuskulären Junction-Z-Stacks mit den kundenspezifischen Image J-Makros zeigte eine deutliche Abnahme des Endplattenvolumens, der maximalen Intensitätsprojektion und der relativen Tortuosität in beiden Krankheitsmausmodellen im Vergleich zu Kontrollen, was auf neuromuskuläre Verbindungsreifungsdefekte hinweist.Die Quantifizierung der präsynaptischen axonterminalen Zweigverteilung mit dem benutzerdefinierten Makro Image J zeigte ein verändertes Muster in der Neurofilament-M-Verteilung in den beiden Tiermodellen mit erhöhter Immunmarkierung. Durch synaptische Vesikel-Glykoprotein-2-Färbung wurde bei Smn 2B/Mäusen eine 43%ige Reduktion des Belegungsverhältnisses der Acetylcholinrezeptor-haltigen Regionen mit benachbarten nerventerminalen aktiven Zonen beobachtet. Der Aspekt der postsynaptischen Endplatten der neuromuskulären Verbindung wurde durch fluoreszierende alpha-Bungarotoxin-Markierung und Intensitätsprofilanalyse deutlich visualisiert.Die Auswertung der neuromuskulären Verbindungsparameter ergab eine Zunahme des Verbindungsfaltenabstands und der Breite der Acetylcholinrezeptorstreifen im Musculus gastrocnemius der Mutanten. Um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, die Muskeln richtig zu straffen und besonders auf die angewandte Kraft zu achten, um Muskelbündel zu trennen. Dieses Protokoll kann zu einer tiefergehenden morphologischen Charakterisierung der neuromuskulären Verbindung beitragen, die bisher nur durch komplexe und zeitaufwändige Verfahren wie die Transmissionselektronenmikroskopie erklärt wurde.Das STED-Bildgebungsverfahren ebnete den Weg für die Untersuchung neuer Erkenntnisse über prä- und postsynaptische Marker, die zur Pathophysiologie von Erkrankungen beitragen, die die neuromuskuläre Verbindung betreffen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Spectral konfokale Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Nikotinrezeptoren in Knock-in Mäusen mit chronischer Gabe von Nikotin

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Forschung

Neurowissenschaften

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Visualisierung und Live Imaging Oligodendrozyt Organellen in organotypischen Gehirnscheiben mit Adeno-assoziierten Virus und konfokale Mikroskopie

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