Name: characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy
Uploaded: 2021-12-08T13:00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

אנו מודים ל"מתקן הליבה להדמיה וציטומטריה " של Genethon, כמו גם לשירות ההיסטולוגיה, הנתמכים בחלקם על ידי קרנות ציוד מאזור איל-דה-פראנס, הקונסיל גנרל דה ל'אסון, הגנופול רקרש של אוורי, אוניברסיטת Evry Val d'Essonne וה- INSERM, צרפת. אנו מודים גם לד"ר רשמי קותרי על אספקת קו העכבר Smn 2B/2B (אוניברסיטת אוטווה, קנדה) ולד"ר אריק קרייצ'י עבור קו העכבר ColQDex2/+ (לא פורסם, אוניברסיטת פריז, צרפת). אנו מודים לגיום קורה על תמיכתו בניתוח סטטיסטי. הנוגדנים החד-שבטיים 2H3 (שפותחו על ידי ג'סל, ט.מ. ודוד, ג'יי) ו-SV2 (שפותחו על ידי באקלי, ק.מ.) התקבלו מבנק ההיברידיומה למחקרים התפתחותיים (DSHB), שנוצר על ידי NICHD של ה-NIH ונשמר באוניברסיטת איווה, המחלקה לביולוגיה, איווה סיטי, IA 52242. עבודה זו נתמכה על ידי האגודה הצרפתית contre les Myopathies (AFM-Telethon), ה- INSERM ואוניברסיטת Evry Val d'Essonne.

<ol>
	<li>Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+nerve-muscle+junctions+in+hindlimb+muscles+of+the+mouse.">Postnatal maturation of nerve-muscle junctions in hindlimb muscles of the mouse.</a> Developmental Biology. 94 (1), 11-22 (1982).</li><li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMJ-morph+reveals+principal+components+of+synaptic+morphology+influencing+structure-function+relationships+at+the+neuromuscular+junction.">NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction.</a> Open Biology. 6 (12), (2016).</li><li>Willadt, S., Nash, M., Slater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+the+structure+and+function+of+mammalian+neuromuscular+junctions.">Age-related changes in the structure and function of mammalian neuromuscular junctions.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1412, 41-53 (2018).</li><li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li><li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease.">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li><li>Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+as+a+distal+axonopathy:+molecular+mechanisms+affecting+neuromuscular+junction+stability+in+the+presymptomatic+stages+of+the+disease.">ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, (2014).</li><li>Lovering, R. M., Iyer, S. R., Edwards, B., Davies, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+neuromuscular+junctions+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Alterations of neuromuscular junctions in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuroscience Letters. 737, 135304 (2020).</li><li>Koneczny, I., Herbst, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+Gravis:+Pathogenic+effects+of+autoantibodies+on+neuromuscular+architecture.">Myasthenia Gravis: Pathogenic effects of autoantibodies on neuromuscular architecture.</a> Cells. 8 (7), 671 (2019).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubular+myopathy+and+the+neuromuscular+junction:+a+novel+therapeutic+approach+from+mouse+models.">Myotubular myopathy and the neuromuscular junction: a novel therapeutic approach from mouse models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 5 (6), 852-859 (2012).</li><li>Gibbs, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+abnormalities+in+DNM2-related+centronuclear+myopathy.">Neuromuscular junction abnormalities in DNM2-related centronuclear myopathy.</a> Journal of Molecular Medicine. 91 (6), 727-737 (2013).</li><li>Swoboda, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+denervation+in+SMA:+Relation+to+age,+SMN2+copy+number,+and+function.">Natural history of denervation in SMA: Relation to age, SMN2 copy number, and function.</a> Annals of Neurology. 57 (5), 704-712 (2005).</li><li>Rodr&#237;guez Cruz, P. M., Palace, J., Beeson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction+and+wide+heterogeneity+of+congenital+myasthenic+syndromes.">The neuromuscular junction and wide heterogeneity of congenital myasthenic syndromes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1677 (2018).</li><li>Tse, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction:+Measuring+synapse+size,+fragmentation+and+changes+in+synaptic+protein+density+using+confocal+fluorescence+microscopy.">The neuromuscular junction: Measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52220 (2014).</li><li>Mejia Maza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMJ-Analyser+identifies+subtle+early+changes+in+mouse+models+of+neuromuscular+disease.">NMJ-Analyser identifies subtle early changes in mouse models of neuromuscular disease.</a> Scientific Reports. 11 (1), 12251 (2021).</li><li>Minty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aNMJ-morph:+a+simple+macro+for+rapid+analysis+of+neuromuscular+junction+morphology.">aNMJ-morph: a simple macro for rapid analysis of neuromuscular junction morphology.</a> Royal Society Open Science. 7 (4), 200128 (2020).</li><li>Modla, S., Mendonca, J., Czymmek, K. J., Akins, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neuromuscular+junctions+by+correlative+confocal+and+transmission+electron+microscopy.">Identification of neuromuscular junctions by correlative confocal and transmission electron microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 191 (2), 158-165 (2010).</li><li>Kittel, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+promotes+active+zone+assembly,+Ca2++channel+clustering,+and+vesicle+release.">Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release.</a> Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).</li><li>York, A. L., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+a+nanoscale+organization+of+acetylcholine+receptors+for+trans-synaptic+alignment+at+neuromuscular+synapses.">Super-resolution microscopy reveals a nanoscale organization of acetylcholine receptors for trans-synaptic alignment at neuromuscular synapses.</a> eNeuro. 4 (4), (2017).</li><li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology.">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (3), 263-276 (2012).</li><li>Feng, G., Krejci, E., Molgo, J., Cunningham, J. M., Massouli&#233;, J., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+collagen+Q:+Roles+in+acetylcholinesterase+and+butyrylcholinesterase+assembly+and+in+synaptic+structure+and+function.">Genetic analysis of collagen Q: Roles in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase assembly and in synaptic structure and function.</a> Journal of Cell Biology. 144 (6), 1349-1360 (1999).</li><li>Sigoillot, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+immaturity+and+muscle+atrophy+are+hallmarks+of+the+ColQ-deficient+mouse,+a+model+of+congenital+myasthenic+syndrome+with+acetylcholinesterase+deficiency.">Neuromuscular junction immaturity and muscle atrophy are hallmarks of the ColQ-deficient mouse, a model of congenital myasthenic syndrome with acetylcholinesterase deficiency.</a> The FASEB Journal. 30 (6), 2382-2399 (2016).</li><li>Vanhaesebrouck, A. E., Beeson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+congenital+myasthenic+syndromes:+expanding+genetic+and+phenotypic+spectrums+and+refining+treatment+strategies.">The congenital myasthenic syndromes: expanding genetic and phenotypic spectrums and refining treatment strategies.</a> Current Opinion in Neurology. 32 (5), 696-703 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Legland, D., Beaugrand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+clustering+of+lignocellulosic+fibres+based+on+morphometric+features+and+using+clustering+of+variables.">Automated clustering of lignocellulosic fibres based on morphometric features and using clustering of variables.</a> Industrial Crops and Products. 45, 253-261 (2013).</li><li>. GitHUb Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/Genethon/ImCy">https://github.com/Genethon/ImCy</a> (2021)</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">A Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction,+assembly,+maturation+and+maintenance+of+a+postsynaptic+apparatus.">Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus.</a> Nature Reviews Neuroscience. 2 (11), 791-805 (2001).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+synaptic+vesicle+release+and+immaturity+of+neuromuscular+junctions+in+spinal+muscular+atrophy+mice.">Impaired synaptic vesicle release and immaturity of neuromuscular junctions in spinal muscular atrophy mice.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (3), 842-851 (2009).</li><li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Human Molecular Genetics. 11 (12), 1439-1447 (2002).</li><li>Murray, L. M., Comley, L. H., Thomson, D., Parkinson, N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 17 (7), 949-962 (2008).</li><li>Boyer, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+program+dysregulation+is+contributory+to+disease+pathogenesis+in+spinal+muscular+atrophy.">Myogenic program dysregulation is contributory to disease pathogenesis in spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 23 (16), 4249-4259 (2014).</li><li>Ling, K. K. Y., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 21 (1), 185-195 (2012).</li><li>Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+transversus+abdominis+muscle+for+whole-mount+neuromuscular+junction+analysis.">Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51162 (2014).</li><li>Baker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , (1958).</li><li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+Nanoscopy+with+time-gated+detection:+Theoretical+and+experimental+aspects.">STED Nanoscopy with time-gated detection: Theoretical and experimental aspects.</a> PLoS ONE. 8 (1), 054421 (2013).</li><li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses.">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).</li><li>Thomson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characteristics+of+motor+neurons+do+not+determine+their+relative+susceptibility+to+degeneration+in+a+mouse+model+of+severe+spinal+muscular+atrophy.">Morphological characteristics of motor neurons do not determine their relative susceptibility to degeneration in a mouse model of severe spinal muscular atrophy.</a> PLoS ONE. 7 (12), 052605 (2012).</li><li>McMacken, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salbutamol+modifies+the+neuromuscular+junction+in+a+mouse+model+of+ColQ+myasthenic+syndrome.">Salbutamol modifies the neuromuscular junction in a mouse model of ColQ myasthenic syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 28 (14), 2339-2351 (2019).</li></ol>

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים הקשורים לעבודה זו.

פרוטוקול הווידאו המתואר מספק שיטה מפורטת לכימות המבנה התלת-ממדי של צמתים עצביים-שריריים על ידי שילוב של מיקרוסקופיה קונפוקלית ו-STED שניתן להשתמש בה כדי לאפיין שינויים פתולוגיים ברמות הטרום-סינפטיות והפוסט-סינפטיות. הרזולוציה הגבוהה של מיקרוסקופיית STED מאפשרת הדמיה וניתוח מורפומטרי של ננו-מבנים שאינם ניתנים לזיהוי על ידי הדמיה קונפוקלית קונבנציונלית. הליך זה אפשר לנו למדוד שינויים מבניים של NMJs בשני שרירים תוספניים, טיביאליס קדמי וגסטרוקנמיוס, של עכברי CMS הקשורים ל-SMA ו-ColQ.
כדי להשיג תוצאות אמינות עם טכניקה זו, זה קריטי לנתח ולהקניט את השרירים כראוי, תוך מתן תשומת לב מיוחדת fascia סביב השריר ואת הכוח המופעל כדי להפריד צרורות שרירים; אחרת, דפוס העצבנות עלול להיות משובש ולפגוע בהערכת NMJ קדם-סינפטית נכונה. למרות מידע מפורט מסופק כדי לנתח NMJs מ TA ו GA, באופן עקרוני, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשרירים אחרים, כולל שרירים שטוחים, כגון הסרעפת או abdominis רוחבי37, אשר אינם דורשים את הצעד מתגרה. קיבוע רקמות הוא גם חיוני כדי להבטיח צביעה באיכות טובה; לכן, מומלץ להשתמש ב- PFA באיכות גבוהה בנפח מתאים (פי 15-20 מזה של השריר). בנוסף, זמן החשיפה לקיבוע הוא צעד חשוב מכיוון שחפצים, כגון התכווצות וגושים, עשויים להופיע עקב קיבוע יתר והשפעה על תכונות NMJ. בהתחשב בגודל הדגימות ובקצב החדירה של תמיסת paraformaldehyde ברקמות38, זמן קיבוע של 18-24 שעות מומלץ עבור סוג זה של שריר. במקרה ששלב ההכתמה מתוכנן יותר משבוע לאחר קצירת הרקמות, מומלץ לשמור על שרירים קבועים ב-PFA ב-PBS בתוספת נתרן אזיד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע התפשטות חיידקים.
פרוטוקול זה מציג גישה המשתמשת ב- α-BTX-F488 עבור קונפוקל ו- α-BTX-F633 להדמיית STED. פלואורופורים אלה נבחרו כך שיתאימו לתכנון הניסויי המתואר, אך ניתן לשנותם בהתאם לציוד ולחומרים הזמינים. לדוגמה, ניתן לבחור תיוג α-BTX F488 בעת שימוש בלייזר STED CW 592 ננומטר לרכישת תמונה וכימות. עם זאת, נראה כי התצורה שיושמה במחקר הנוכחי (עירור פועם מגודר STED, דלדול 775 ננומטר) מציגה ביצועים גבוהים יותר ורזולוציה טובה יותר מאשר גישות אחרות, כגון גל רציף STED39, מה שהופך אותו מתאים יותר עבור היישום הנוכחי. חשוב גם לבחור בקפידה את הגדרות כוח הלייזר, במיוחד עבור STED (הן עירור והן דלדול), שכן המאפיינים של פרופיל עוצמה לא ניתן למדוד במקרה של רוויה, ולכן כל אות רווי בתמונה NMJ יכול לסכן את הניתוח כולו.
תהליך עבודה מפורט זה, הכולל רכישות וניתוח תמונות באמצעות תוכנת מיקרוסקופ ופקודות מאקרו של ImageJ, פותח כדי להקל על ניתוח מורפומטרי אוטונומי של NMJ על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית ו-STED משריר יחיד. זרימות עבודה שתוארו בעבר עבור ניתוח קונפוקלי NMJ, כגון NMJ-morph2 או NMJ-Analyser14, סללו את הדרך לתכנון שיטות חצי אוטומטיות המאפשרות ניתוח מורפולוגי של NMJs ומחקרים השוואתיים. NMJ-morph (וגרסתו המעודכנת aNMJ-morph15) היא פלטפורמה חינמית מבוססת ImageJ המשתמשת בהיטל העוצמה המקסימלית כדי למדוד 21 תכונות מורפולוגיות, ו- NMJ-Analyser משתמשת בסקריפט שפותח בפייתון שמייצר 29 פרמטרים רלוונטיים מכל מבנה NMJ התלת-ממדי. סף ידני הוא השלב היחיד במהלך עיבוד תמונה בשתי שיטות אלה הדורשות ניתוח משתמש. פרוטוקול משולב זה מפרט שלבים להכנת רקמות, רכישת תמונה קונפוקלית תלת-ממדית ועיבוד מבוסס ImageJ של NMJs מכל שרירי השלד ומספק סקירה פשוטה של חמישה פרמטרים חשובים של לוחות הקצה הפוסט-סינפטיים (נפח, שטח הקרנה מרבי וטורטואוזיות) והקדם-סינפטיים (תפוסת מסוף האקסון והצטברות נוירופילמנט). פרמטר נוסף בעל רלוונטיות ביולוגית, תבנית ארגון AChR של הקפלים הצמתים הפוסט-סינפטיים, שולב לניתוח מורפומטרי ברמה הננומטרית על ידי מיקרוסקופיית STED ברזולוציה גבוהה במיוחד (רזולוציה 20-30 ננומטר)40. באופן מעניין, הכנת רקמות להדמיית STED פשוטה יותר משיטות אחרות המשמשות למחקרים אולטרה-סטרוקטורליים של NMJ, כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים קונבנציונלית (TEM)9, שהיא הליך מורכב למדי וגוזל זמן הדורש מניפולטור מיומן על מנת להשיג חלקים אולטרה-דקים של אזור השריר המתאים. בנוסף, ניתן לקבל נתונים כמותיים ממספר קיפולים צומתיים באופן אוטומטי באמצעות התוכנה המשויכת ל-STED.
פרוטוקול זה יושם כדי להמחיש פגמים ידועים בעבר NMJs בשרירים חסרים SMN ו- ColQ 20,36,41,42. שינויים נפוצים נמצאו בשני המודלים של העכברים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, כגון ירידה בנפח לוחית הקצה הפוסט-סינפטית, שטח MIP וטורטואוזיות יחסית, והצטברות מוגברת של נוירופילמנט, בעוד שכמה ממצאים ספציפיים יותר (ירידה בתפוסת NMJ), נצפו רק בעכברי SMA, כאינדיקטור לפגיעה בשלפוחית36. לבסוף, עלייה במרחק וברוחב פס AChR זוהו ב- ColQ-KO על ידי ניתוח STED, שהם סימנים לפגמים אולטרה-סטרוקטורליים בקפלים הצמתים הפוסט-סינפטיים, כפי שנצפה בעבר על ידי TEM20. חשוב לציין כי פרוטוקול זה עשוי לסייע באפיון מורפולוגי מעמיק יותר של צמתים עצביים-שריריים במהלך הפיתוח, התחזוקה ובתנאים פתולוגיים שונים.

הצומת הנוירומוסקולרי (באנגלית: Neuromuscular junction, בראשי תיבות: NMJ) הוא מבנה מורכב המורכב ממסוף אקסון מוטורי, תא שוואן פריסינפטי וחלק מיופייבר שלדי המעורב בהעברת מידע כימי וצימוד של פעילות נוירונים מוטוריים נמוכים יותר להתכווצות שרירים. ביונקים, המורפולוגיה של הצומת העצבי-שרירי משתנה במהלך ההתפתחות, מאמצת צורה טיפוסית דמוית בייגלה לאחר ההתבגרות, עם הבדלים בצורה ובמורכבות בין המינים, ומראה מידה מסוימת של פלסטיות בתגובה לתהליכים פיזיולוגיים כגון פעילות גופנית או הזדקנות 1,2,3,4 . לוחית הקצה המוטורית הפוסט-סינפטית יוצרת אינווגינציות ממברנה הנקראות קפלים צומתיים, כאשר החלק העליון המכיל קולטני אצטילכולין (AChR) נמצא במגע הדוק עם ענף האקסון הטרמינלי הקדם-סינפטי5.
שינויים מורפולוגיים ותפקודיים בצמתים עצביים-שריריים תורמים לפתופיזיולוגיה של מספר הפרעות נוירודגנרטיביות כגון ניוון שרירים בעמוד השדרה (SMA) וטרשת אמיוטרופית צידית (ALS), מיופתיות כמו ניוון שרירים דושן (DMD), תסמונות מיאסטניות מולדות (CMS), מיאסטניה גרביס (MG) ומיופתיות צנטרו-גרעיניות (CNM), וסרקופניה הקשורה להזדקנות 3,6,7,8,9, 10,11,12. במחלות אלה נצפים שינויים מבניים NMJ כגון פיצול לוחית קצה, גודל קיפול צומתי פוסט-סינפטי מופחת ו/או ניתוק עצבים. הפתולוגיה של NMJs יכולה להיות אירוע ראשוני או מוקדם במהלך התקדמות המחלה או להופיע לאחרונה כאירוע משני התורם לביטויים הקליניים. בכל מקרה, ניטור המורפולוגיה של NMJs במודלים של בעלי חיים של מחלות אלה מייצג פרמטר רב ערך לחקר שינויים פתולוגיים והערכת היעילות של טיפולים פוטנציאליים.
המורפולוגיה של צמתים עצביים-שריריים מנותחת בדרך כלל על ידי טכניקות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית 2,13,14,15 או מיקרוסקופיית אלקטרונים 5,16, עם המגבלות המובנות שלהם כגון רזולוציה או קשיים טכניים, בהתאמה. לאחרונה, מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה שימשה גם כדי לדמיין אזורים מסוימים של NMJ, כגון אזורים פעילים presynaptic או התפלגות AChR על הממברנה הפוסט-סינפטית16,17,18, כגישה חלופית או משלימה לאנליזה אולטרה-סטרוקטורלית על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים.
פרוטוקול זה נועד לספק שיטה מפורטת וניתנת לשחזור להערכת פרמטרים מורפולוגיים של NMJ על ידי שילוב מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית ודלדול פליטה מגורה (STED). תכונות חשובות של לוחות הקצה הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים, כגון נפח, שטח, פיתול יחסי, רוחב פס AChR והתפלגות מסוף האקסון בסיבי שריר פנימיים של גסטרוקנמיוס עכבר וטיביאליס קדמי כומתו בהקשר של תנאים נורמליים וחולים. בפרט, פגמים NMJ הודגמו במודל העכבר Smn 2B/- של ניוון שרירים בעמוד השדרה, מחלה נוירומוסקולרית עם ניוון נוירונים מוטוריים הנגרמת על ידי מוטציות בגן SMN1 11,19, ובתת-יחידת זנב דמוית קולגן של נוקאאוט אצטילכולין אסטראז אסימטרי (ColQ Dex2/Dex2 או ColQ-KO), כמודל של תסמונת מיאסטנית מולדת 20, 21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Buffers and Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 &#945;-bungarotoxin (F488-a-BTX)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>B13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATTO-633 &#945;-bungarotoxin (F633-a-BTX)</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-100-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS</td>
			<td>Gibco, Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol Absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion Oil, n = 1.518</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>MOIL-10LF&#160;</td>
			<td>Low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurofilament (NF-M) antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_531793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.04005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_2315387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alnico Button cylindrical magnets</td>
			<td>Farnell France</td>
			<td>E822</td>
			<td>diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >63x 1.4 NA magnitude oil immersion&#160; HCX Plan Apo CS objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Curved thin forceps-Moria iris forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra thin scissors - Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15-003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel loading tip round 1-200 &#181;L</td>
			<td>COSTAR</td>
			<td>4853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue&#160;</td>
			<td>Whatman (GE Healthcare)</td>
			<td>2105-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170&#177;5 &#181;m</td>
			<td>Marienfield</td>
			<td>107222</td>
			<td>High precision</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (12-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (24-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safeshield scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.40.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost plus slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GraphPad&#160;</td>
			<td>Prism, San Diego (US)</td>
			<td>Release N&#176;6.07</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Release N&#176; 1.53f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Release N&#176;3.7.2.2283</td>
			<td >Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy

צמתים עצביים-שריריים (NMJs) הם סינפסות מיוחדות מאוד בין נוירונים מוטוריים נמוכים וסיבי שרירי שלד הממלאים תפקיד חיוני בהעברת מולקולות ממערכת העצבים לשרירים רצוניים, מה שמוביל להתכווצות. הם מושפעים ממחלות אנושיות רבות, כולל הפרעות נוירומוסקולריות תורשתיות כגון ניוון שרירים דושן (DMD), תסמונות מיאסטניות מולדות (CMS), ניוון שרירים בעמוד השדרה (SMA) וטרשת אמיוטרופית צידית (ALS). לכן, ניטור המורפולוגיה של צמתים עצביים-שריריים והשינויים שלהם במודלים של עכברי מחלה מהווה כלי רב ערך למחקרים פתולוגיים ולהערכה פרה-קלינית של גישות טיפוליות. כאן מתוארות שיטות לתיוג וניתוח המורפולוגיה התלת-ממדית (3D) של החלקים הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים של לוחות קצה מוטוריים מסיבי שריר ממוריניים. ההליכים להכנת דגימות ולמדידת נפח NMJ, שטח, טורטואוזיות ומורפולוגיה/תפוסה של מסוף אקסון על ידי הדמיה קונפוקלית, והמרחק בין קפלי צומת פוסט-סינפטיים לבין קולטן אצטילכולין (AChR) רוחב פס על ידי מיקרוסקופיית דלדול פליטה מגורה ברזולוציה גבוהה במיוחד (STED) מפורטים. שינויים בפרמטרים אלה של NMJ מודגמים בעכברים מוטנטיים המושפעים מ-SMA ו-CMS.

על מנת להקל על הניתוח המורפולוגי של צמתים עצביים-שריריים ברמה הקדם-סינפטית והפוסט-סינפטית באופן הניתן לשחזור, פותחה זרימת עבודה מקצירת שרירים ועד הדמיה וכימות באמצעות תוכנת המיקרוסקופ ופקודות מאקרו מותאמות אישית של ImageJ (איור 1). כדי להדגים את התועלת של פרוטוקול זה, הוערכו המורפולוגיה של NMJs בשני מודלים של עכברים של הפרעות גנטיות, עכברי Smn2B/- ו-ColQ Dex2/Dex2 המושפעים מאטרופיה שרירית בעמוד השדרה (SMA) וצורה של תסמונת מיאסטנית מולדת (CMS), בהתאמה, והנתונים הושוו לחברי פסולת בקרה תואמי גיל.
מבנה ה-NMJ הוערך משרירי טיביאליס קדמיים וגסטרוקנמיוס של עכברי Smn2B/- (רקע C57Bl/6) ו-ColQ Dex2/Dex2 (רקע B6D2F1/J), בהתאמה, כאשר סימנים למחלה כבר נמצאים בבעלי חיים אלה. בגיל 3 שבועות, עכברי Smn2B/- מראים סימנים של עיכוב בהתפתחות שרירי השלד וניתוק עצבים, כגון ניוון NMJ ואובדן35,36. לעכברי CMS יש פתולוגיה ראשונית ב- NMJs והם מפגינים ירידה במשקל הגוף מהשבוע הראשון לחיים וחולשת שרירים מסומנת20 (נתונים לא מוצגים). כפי שניתן לראות באיור 2A, לוחית הקצה המוטורית הפוסט-סינפטית המסומנת בפלואורסצנט α-בונגארוטוקסין נראתה קטנה יותר ו/או מקוטעת במוטציות של שני קווי העכבר על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. כימות של ערימות NMJ Z באמצעות פקודות מאקרו מותאמות אישית אלה של ImageJ גילה ירידות ניכרות בנפח לוחית הקצה, בהקרנה בעוצמה מרבית (MIP) ובטורטואוזיות יחסית בעכברי SMA ו-CMS בהשוואה לפקדים, כסימנים לפגמים בהבשלת NMJ32 (איור 2B-D). נפח לוחית הקצה הפוסט-סינפטית ו-MIP ירדו בבעלי חיים חולים (שינוי קיפול של 2.7 ו-2.0 עבור נפח, ו-2.5 ו-2.0 עבור MIP, בעכברי Smn2B/- ו-ColQ Dex2/Dex2, בהתאמה). הטורטואוזיות היחסית הייתה גם קטנה יותר בשרירים עם מחסור ב-SMN וב-ColQ בהשוואה ל-WT (16.97% ±-1.33% ב-SMA לעומת 48.84% ±-5.90% בעכברי WT, ו-13.29% ±-2.79% ב-CMS לעומת 30.20% ±-4.44% עכברי בקרה). בנוסף, כימות ההתפלגות של ענפי מסוף האקסון הקדם-סינפטי באמצעות המאקרו המותאם אישית ImageJ חשף דפוס שונה בהתפלגות הנוירופילמנט M בשני המודלים החייתיים, עם עלייה באימונו-לייבלינג (84.65% ± 0.32% לעומת 16.57% ± 2.03% ו-23.64% ±-2.78% לעומת 18.77% ±-1.73% בעכברי Smn2B/- ו-ColQ Dex2/Dex2 בהשוואה לבקרים, בהתאמה) (איור 3A-D ). על ידי צביעת SV2, נצפתה ירידה של 43% ביחס התפוסה, כלומר אחוז מהאזורים המכילים AChR עם אזורים פעילים של מסוף העצבים הסמוך, גם בעכברי Smn2B/- (49.36% ± 3.76% בעכברי SMA לעומת 85.69% ± 2.34% עכברי WT) (איור 3E,F). פרמטר NMJ זה חושב גם ב-GA של מוטנטים מסוג ColQ Dex2/Dex2, אך לא נמצא הבדל מובהק סטטיסטית בהשוואה לחברי פסולת בקרה (הנתונים לא הוצגו).
בהמשך ניתחנו את מאפייני הממברנה הפוסט-סינפטית על ידי כימות המרחק בין קפלי צומת לרוחב פסי AChR, הממוקמים בפסגת הקפלים הללו, בשרירים חסרי ColQ באמצעות מיקרוסקופיית דלדול פליטה מגורה ברזולוציה גבוהה (STED). כפי שניתן לראות באיור 4, ניתן לדמיין בבירור את ההיבט של המבנים האלה על-ידי תיוג פלואורסצנטי של α-בונגארוטוקסין וניתוח פרופיל עוצמה. הערכנו את הפרמטרים האלה של NMJ ומצאנו עלייה במרחק הקיפול הצמתי (d) וברוחב (w) של פסי AChR בשריר הגסטרוקנמיוס של מוטנטים (358.3 ננומטר ± 11.97 ננומטר ו-320.8 ננומטר ± 10.90 ננומטר למרחק, ו-216.9 ננומטר ± 10.51 ננומטר ו-186.3 ננומטר ± 7.015 ננומטר לרוחב, ב-ColQ Dex2/Dex2 בהשוואה לעכברים מסוג פראי, בהתאמה, p < 0.05) (איור 4C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig01.jpg"> איור 1: תרשים זרימה של פרוטוקול הווידאו לאפיון NMJ רב-ממדי תלת-ממדי על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית ו-STED. שרירי טיביאליס קדמיים (TA) וגסטרוקנמיוס (GA) נאספו מעכברים, וסיבי שריר הוקניטו לפני הסימון עם α-בונגארוטוקסין-F488 או α-בונגארוטוקסין-F633, DAPI, נוגדנים ראשוניים המכוונים נגד נוירופילמנט M (NF-M) וגליקופרוטאין שלפוחית סינפטית 2 (SV2), ונוגדנים משניים מצומדים לפלואורופור (F488 או F594). ערימות תמונות נרכשו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית ועובדו למדידת נפח NMJ פוסט-סינפטי, הצטברות NF-M קדם-סינפטית, תפוסת מסוף אקסון NMJ, אזור לוחית קצה של הקרנה בעוצמה מרבית פוסט-סינפטית (MIP) וטורטואוזיות (d Obj(AB) הוא המרחק בין A ל-B לאורך היקף האובייקט (קו אדום), בעוד ש-dEuc(AB) הוא המרחק האוקלידי בין A ל-B (הקו הירוק)). עבור ניתוח מיקרוסקופיה STED, רוחב פסי קולטן אצטילכולין (AChR) והמרחק בין קפלי צומת כומתו מפרופילי עוצמה של מכתים α-BTX-F633. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig02.jpg"> איור 2: אפיון NMJ פוסט-סינפטי מרובה פרמטרים במודלים של עכברים של ניוון שרירים בעמוד השדרה (SMA) ותסמונת מיאסטנית מולדת הקשורה ל-ColQ (CMS ). (A) תמונות מייצגות של לוחות קצה מוטוריים פוסט-סינפטיים משרירי TA ו-GA המסומנים ב-α-bungarotoxin-F488 (α-BTX). (B ) כימות של נפח לוחית הקצה הפוסט-סינפטית של NMJ, (C) אזור היטל העוצמה המרבית (MIP) ו-(D) הטורטואוזיות היחסית בת"א של עכברים מסוג בר בן 3 שבועות (WT) ו-Smn2B /- עכברים (גרפים שמאליים, N = 3 בעלי חיים לכל גנוטיפ, n = 37 ו-n = 56 NMJs, בהתאמה) ו-WT ו-ColQDex2/Dex2 בני 6 שבועות עכברים (גרפים ימניים, N = 5 עכברים לכל גנוטיפ, n = 89 ו- n = 97 NMJs, בהתאמה). הנתונים מבוטאים כממוצע לעכבר (נקודה) ± SEM. ההבדלים בין הקבוצות נותחו על ידי מבחן מאן-וויטני (* p < 0.05). סרגל קנה המידה הוא 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig03.jpg"> איור 3: ניתוח מורפומטרי של התפלגות מסוף האקסון הקדם-סינפטי בשרירי WT ועכברים מוטאנטים. תבנית העצבנות של NMJ בשרירים הקדמיים של טיביאליס (TA) וגסטרוקנמיוס (GA) של עכברי CMS מסוג פראי, SMA ו-ColQ. (א, ב) צמתים עצביים-שריריים מייצגים מ-TA של עכברי WT ו-Smn2B/- בגיל 21 יום המסומנים בנוגדנים נגד נוירופילמנט M (NF-M, אדום) ו-α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, ירוק) (A), ותוצאות מניתוח כמותי של הצטברות נוירופילמנט (B); (ג, ד) צמתים עצביים-שריריים מייצגים מ-GA של עכברי WT ו-ColQ Dex2/Dex2 בני 6 שבועות המסומנים בנוגדנים נגד נוירופילמנט M (NF-M, אדום) ו-α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, ירוק), המציגים לוחות קצה פוסט-סינפטיים מקוטעים ולא בשלים (C), ותוצאות של הצטברות נוירופילמנט בשתי קבוצות בעלי החיים (D). N= 4 (n = 34 NMJs) (B) ו- N = 3 (n = 54 NMJs) (D) חיות WT, ו- N = 3 (n = 36 NMJs) Smn2B/- ו- N = 3 (n = 55 NMJs) עכברי ColQ Dex2/Dex2 נותחו בניסויים (B, D). (ה, ו) תמונות מייצגות של תפוסת מסוף האקסון ב-NMJs מ-TA של עכברי WT ו-Smn 2B/- בני 3 שבועות המסומנים בנוגדנים נגד גליקופרוטאין שלפוחית סינפטית 2 (SV2, אדום) ו-α-בונגארוטוקסין-F488 (α-BTX, ירוק) (E), ותוצאות תפוסת NMJ (יחס נפח SV2/AChR) (F). נותחו שרירים מ-N = 3 (n = 50 NMJs) מסוג פראי ו-N = 4 (n = 62 NMJs) עכברי Smn2B/- . הנתונים מבוטאים כערך הממוצע לעכבר (נקודה) ± SEM. ההבדלים בין הקבוצות נותחו על ידי מבחן מאן-וויטני (* p < 0.05). סרגלי קנה המידה הם 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig04.jpg"> איור 4: הדמיית STED של לוחות קצה פוסט-סינפטיים של NMJ. (A) תמונת STED מייצגת של NMJ המסומנת ב-α-bungarotoxin-F633 (α-BTX) מגסטרוקנמיוס של עכבר פראי בן 6 שבועות המציג פסי AChR פוסט-ג'ונטאליים (סרגל קנה המידה הוא 5 מיקרומטר). (B) הגדלה גבוהה יותר של אזור עם פסי AChR (פאנל תחתון) ששימש ליצירת פרופיל העוצמה. הרוחב (w) של פסי AChR והמרחק בין שני פסים סמוכים (d) של אזור זה כומתו והוצגו בגרף העמודות. ייצוג סכמטי של לוחית הקצה הפוסט-סינפטית להמחשת רוחב פס AChR (w) ומרחק (d). פרמטרים אלה, (C) מרחק פס AChR ורוחב (D), נמדדו בעכברי ColQ Dex2/Dex2 ובחברי פסולת בקרה בגיל 6 שבועות. NMJs מ-5 WT (סה"כ n = 29 NMJs) ו-6 ColQ Dex2/Dex2 (סה"כ n = 43 NMJs) בעלי חיים נותחו באופן עיוור. הנתונים מבוטאים כממוצע לעכבר (נקודה) ± SEM. הבדלים סטטיסטיים בין קבוצות נותחו באמצעות מבחן מאן-וויטני (* p < 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
איור משלים 1: השקת תוכנת LAS X ופרמטרים לרכישות קונפוקליות. השלבים השונים לרכישת תמונות קונפוקליות מתוארים בסעיפים 3.1.2 עד 3.1.7 של הפרוטוקול. עבור כל רכישה של מחסנית NMJ, נפתח פרויקט (שלב 3.1.4) ונבחרים הפרמטרים של גודל תמונה, מהירות רכישה, צירי X, Y ו- Z (שלב 3.1.7), כאשר כל סריקה רציפה מסומנת (Seq.1, לייזר 405 עבור DAPI; Seq.2, לייזר 488 עבור α-BTX-F488; ו- Seq.3, לייזר 552 עבור נוגדנים משניים מצומדים F594). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים 2: השקת תוכנת LAS X ופרמטרים לרכישות STED. השלבים לרכישת תמונות STED מתוארים בסעיפים 3.2.2 עד 3.2.8 של הפרוטוקול. המיקרוסקופ משוגר במצב תצורה STED ON (שלב 3.2.2), ופרויקט נפתח (שלב 3.2.3). הפרמטרים לרכישת תמונה (שלב 3.2.7) (גודל תמונה, מהירות רכישה, גורם זום, ציר X), עם כל סריקה רציפה מסומנים (Seq.1 עבור α-BTX-F633; Seq.2 עבור F488 נוגדנים משניים מצומדים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%202.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים 3: תמונות של קפלים צומתיים מוכתמים ב-α-BTX שהתקבלו על-ידי מיקרוסקופיית STED. דוגמאות תמונה של לוחית קצה פוסט-סינפטית המסומנת ב- α-BTX-F633 מעכבר מסוג פראי בן 6 שבועות שנרכשו עם מיקוד נכון (משמאל) או שגוי (מימין). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%203.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים 4: חלונות מוקפצים של Windows לתיאור נתוני הקלט והפלט המתקבלים על-ידי פקודות המאקרו המותאמות אישית של ImageJ. דוגמאות נתוני קלט (קבצי .tif ו- .lif) של תמונות NMJ מוצגות בעמודה השמאלית. נתוני הפלט מפקודות המאקרו (עמודה ימנית) נשמרים בתיקיות (Save_Volume, Save_Accu) המכילות תמונות של הצומת (.tif) וגליונות נתונים המכילים את התוצאות (.csv קבצים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%204.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים 5: ניתוח מרחק ורוחב פס AChR מרכישת STED באמצעות תוכנת LAS X. השלבים לניתוח תמונות NMJ STED מתוארים בסעיף 5 של הפרוטוקול. A) תמונה של אזור לוחית קצה פוסט-סינפטי עם תווית המכיל פסי AChR. אזור העניין לניתוח פסים נבחר על ידי ציור קו מאונך (קו ירוק, למרחק פס), או מלבן מאונך (מלבן סגול, לרוחב פס). (ב, ג) פרופילי עוצמה של האזורים שנבחרו ומדידות לחישוב המרחק בין פסי AChR (B) לרוחב פס AChR (C) מוצגים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%205.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ קידוד משלים 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. מאקרו מותאם אישית של ImageJ לחילוץ מדידות פרמטרים של NMJ (אמצעי אחסון NMJ, אזור לוחית קצה MIP וטורטואוזיות NMJ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ קידוד משלים 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. מאקרו מותאם אישית של ImageJ לחילוץ הצטברות NF-M וצביעת SV2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח מורפומטרי של צמתים עצביים-שריריים על ידי מיקרוסקופיה משולבת של קונפוקל ו-STED המשמשת לכימות שינויים פתולוגיים במודלים של עכברים של SMA ו-CMS הקשורים ל-ColQ.

אפיון צמתים עצביים-שריריים בעכברים על ידי מיקרוסקופיה משולבת קונפוקלית וסופר-רזולוציה

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

פרוטוקול זה מסייע לנתח באופן כמותי את המבנה התלת-ממדי של צמתים עצביים-שריריים ברזולוציה הקרובה למיקרוסקופיית אלקטרונים באמצעות הליך פשוט. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שדגימות שרירים מעובדות באופן דומה ומאושרות באופן חיסוני עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית ו-STED, מה שמקצר את הזמן להערכה מדויקת של מבנה הצומת העצבי-שרירי במודלים של בעלי חיים. ניתן להתאים בקלות את הכימות המורפולוגי שפיתחנו כדי לנתח מבנים תת-תאיים אחרים.אני שמח להציג את ד"ר מרטינה מרינלו, מדענית מהצוות שלי שתראה כיצד מבוצעים הקנטות שרירים וכתמי חיסון ותיתן כמה המלצות ליישום מוצלח של פרוטוקול זה. אני שמח להציג את ד"ר ג'רמי קוזט מפלטפורמת ההדמיה של ג'נתון שיציג רכישה וניתוח של תמונות באמצעות מיקרוסקופים קונפוקליים ו-STED. לאחר המתת חסד, מתחילים להקניט את השרירים הקדמיים של הטיביאליס בצרורות סיבים קטנים ברוחב של כמילימטר אחד באמצעות שני מלקחיים משוננים עדינים.לאחר מכן, העבירו את צרורות השרירים הללו לצלחת בת 24 בארות המכילה 1% Triton X-100 שהוכנה ב-PBS ואפשרו לה להתסיס בעדינות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר או חמש שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת הדגימות שלוש פעמים במשך חמש דקות עם PBS בטמפרטורת החדר, דגירה של הדגימות עם תמיסת חסימה המורכבת מ-4% BSA שהוכנה ב-PBS עם 1% Triton X-100 למשך ארבע שעות בארבע מעלות צלזיוס תחת תסיסה עדינה. לאחר מכן, דגרו את הדגימות למשך הלילה עם אותה תמיסת חסימה המכילה נוגדנים חד-שבטיים ראשוניים נגד נוירופילמנט M או גליקופרוטאין שלפוחית סינפטית 2 כדי לסמן מסופי אקסון קדם-סינפטיים או אזורים פעילים, בהתאמה.למחרת, יש לשטוף את צרורות השרירים המסומנים שלוש פעמים במשך חמש דקות עם PBS תחת תסיסה עדינה. לאחר מכן, לדגור אותם עם נוגדנים משניים מתאימים על ידי הנחתם על שייקר במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת צרורות השרירים שוב, מניחים אותם על מגלשה עם מדיום הרכבה.לאחר מכן, הניחו מכסה זכוכית בדרגה 1.5 על החלק העליון, ולאחר מכן מגנטים גליליים משני צידי המגלשה כדי להפעיל לחץ ולשטח את השרירים. כדי לרכוש תמונות באמצעות המיקרוסקופ הקונפוקלי, הפעל את תוכנת המיקרוסקופ ובחר מכונה כמצב תצורה ואסוף ערימות תמונות של הצמתים העצביים-שריריים בכל קבוצת ניסוי בהתאם להגדרות המוזכרות בכתב היד של הטקסט. בסוף המפגש, לחץ על פתח במציג תלת מימד ובחר צומת נוירומוסקולרי המייצג קבוצת ניסוי כדי לדמיין את התיוג התלת-ממדי.כדי לחשב את הצומת העצבי-שרירי הפוסט-סינפטי ואת נפח הצלחת, את שטח ההקרנה בעוצמה מרבית ואת הטורטואוזיות היחסית, גרור ושחרר את המאקרו לכימות נפח הצומת העצבי-שרירי לחלון Image J, וכאשר המאקרו נפתח בחלון שני, לחץ על פקודות מאקרו והפעל מאקרו. בחר את התיקייה המקורית המכילה את תיקיות המשנה של הצומת לניתוח ולחץ על בחר. לאחר מכן, בתפריט הקופץ של תיקיית השמירה, בחר את תיקיית האחסון ולחץ על בחר.בתפריט הנפתח החדש שנקרא Image Type, בחר בתבנית של רכישות מחסנית Z. בחר בערוץ RGB המתאים לצביעת העניין וציין X, Y גודל פיקסלים ושלב Z. אם נבחרו תבניות קובץ קנייניות, המאקרו יקרא ישירות את גודל הפיקסלים ואת שלב Z.כדי לכמת הצטברות נוירופילמנט קדם-סינפטית, גרור ושחרר את המאקרו לכימות הצטברות צומת עצבי-שרירי לחלון תמונה J, ולחץ על פקודות מאקרו והפעל מאקרו. בחר את תיקיות המשנה של הצומת, תיקיית האחסון ואת התבנית של רכישות מחסנית Z כפי שהוכח קודם לכן. לאחר מכן, בחלון הקופץ Staining Infos, ציין את התווית והצבע הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים ולחץ על OK.In החלון הקופץ גודל פיקסל, ציין את גודל הפיקסל X, Y כ- 0.072 מיקרומטר, שלב Z כ- 0.5 מיקרומטר ולחץ על אישור. אם נבחרו תבניות קובץ קנייניות, המאקרו יקרא ישירות את גודל הפיקסלים ואת שלב Z.כדי לחשב את המרחק בין פסי הקולטן אצטילכולין, בחר בתפריט כימות מעל החלון המרכזי. לחץ על הכרטיסייה כלים, בחר עוצמה ולחץ על סמל פרופיל הקו. הגדר דגימת יתר לאחד וסמן את מיין ערוצים.לחץ על הכרטיסייה פתח פרויקטים ובחר את התמונה המסוננת לניתוח. לאחר מכן, לחץ על סמל קו הציור ועקוב אחר קו חוצה בניצב מספר פסים או קיפולים צומתיים. לחץ על החלק העליון של השיא הראשון והזז את מצביע העכבר תוך כדי לחיצה על לחצן העכבר השמאלי עד להגעה לשיא המרבי הבא.שים לב לערך DX, המתאים למרחק בין שתי הפסגות. לחץ לחיצה ימנית על העכבר כאשר בתמונה של החלון הימני ובחר שמור ROIs. לאחר לחיצה על סמל החץ, לחץ על החזר ההשקעה ומחק אותו על ידי לחיצה על סמל הפח.לחישוב רוחב פס הקולטן אצטילכולין, בחר עוצמה בחלונית השמאלית העליונה מתחת לכרטיסייה כלים, לחץ על הסמל קבע FWHM וסמן את ערוצי המיון. לאחר מכן לחץ על פתח פרויקטים הכרטיסייה ובחר את התמונה המסוננת לניתוח. לאחר מכן, לחץ על סמל מלבן הציור בתפריט העליון של החלון הימני.בחר פס אופקי או אנכי וצייר מלבן בניצב לפס. פרופיל מופיע בחלון המרכזי. לחץ על אנכי או אופקי בתפריט 'הקרנה ממוצעת' הממוקם בחלונית השמאלית, בהתאם לכיוון הפס או לאופקי.לחץ על סטטיסטיקה בחלון המרכזי כדי לקרוא את הערך FWHM ולאחר מכן שמור ומחק את ה- ROIs כפי שהודגם קודם לכן. לוחית הקצה המוטורית הפוסט-סינפטית, המסומנת באלפא-בונגארוטוקסין פלואורסצנטית, נראתה קטנה יותר ומקוטעת במוטנטים של שני קווי עכבר. כימות ערימות הצומת העצבי-שרירי Z באמצעות פקודות המאקרו המותאמות אישית של Image J חשף ירידה ניכרת בנפח לוח הקצה, הקרנה בעוצמה מרבית וטורטואוזיות יחסית בשני המודלים של עכברי מחלה בהשוואה לפקדים, מה שמעיד על פגמים בהבשלה של צומת נוירומוסקולרי.כימות התפלגות הענפים הטרמינליים של האקסון הקדם-סינפטי באמצעות המאקרו המותאם אישית Image J חשף שינוי בהתפלגות הנוירופילמנט M בשני המודלים החייתיים עם תיוג חיסוני מוגבר. באמצעות צביעת גליקופרוטאין 2 שלפוחית סינפטית, נצפתה ירידה של 43% ביחס התפוסה של האזורים המכילים קולטן אצטילכולין עם אזורים פעילים סמוכים של מסוף העצבים ב- Smn 2B / עכברים. ההיבט של לוחות הקצה הפוסט-סינפטיים של הצומת העצבי-שרירי הודגם בבירור על ידי תיוג אלפא-בונגארוטוקסין פלואורסצנטי וניתוח פרופיל עוצמה.הערכת הפרמטרים של הצומת העצבי-שרירי גילתה עלייה במרחק הקפל הצומתי וברוחב של פסי קולטן אצטילכולין בשריר הגסטרוקנמיוס של המוטנטים. כדי להשיג תוצאות אמינות, חיוני להקניט את השרירים כראוי, תוך מתן תשומת לב מיוחדת לכוח המופעל כדי להפריד בין צרורות שרירים. פרוטוקול זה יכול לסייע בהשגת אפיון מורפולוגי מעמיק יותר של צומת נוירומוסקולרי, שבעבר הובא בחשבון רק על ידי הליכים מורכבים וגוזלי זמן, כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה.הליך הדמיית STED סלל את הדרך לחקר תובנות חדשות בנוגע לסמנים טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים, התורמים לפתופיזיולוגיה של מחלות המשפיעות על צומת עצבי-שרירי.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

דימות ספקטרלי Confocal של קולטנים ניאציניות מתויג fluorescently ב עקום בעכברים עם מינהל ניקוטין כרונית

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית ​​צפופות ליבות עצבית

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

הקלטה תאית של העצבית פעילות משולבת עם Microiontophoretic יישום של חומרי Neuroactive עכברי Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

עצב שׁוֹקִיתִי השיטה פגיעה: A Assay אמין כדי לזהות מבחן הגורמים תיקון Neuromuscular הצומת

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

מתח ומות תא מפעיל באמצעות מיקרוסקופ Confocal הקונבנציונלי UV הליזר

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

ויזואליזציה והדמיה בשידור חי של Organelles אוליגודנדרוציטים בפרוסות Organotypic המוח באמצעות וירוס Adeno-הקשורים ומיקרוסקופיה קונפוקלית

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

הדמיה סופר-רזולוציה ללמוד התאמה ית-מקומית של חלבונים וסמנים סינפטיים בנוירונים ראשוניים

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...