Name: characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy
Uploaded: 2021-12-08T13:00:00
Duration: 11 min 3 s
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हम जेनेथन की "इमेजिंग और साइटोमेट्री कोर सुविधा" के साथ-साथ हिस्टोलॉजी सेवा को धन्यवाद देते हैं, जो क्षेत्र इले-डी-फ्रांस, कंसिल जनरल डी एल'एसोने, जेनोपोल रेचरचे ऑफ एवरी, यूनिवर्सिटी ऑफ एवरी वैल डी'एससोन और आईएनएसईआरएम, फ्रांस से उपकरण निधि द्वारा समर्थित हैं। हम एसएमएन2 बी / 2 बी माउस लाइन (ओटावा विश्वविद्यालय, कनाडा) और डॉ एरिक क्रेजी को कोलक्यूडेक्स 2 / + माउस लाइन (अप्रकाशित, पेरिस विश्वविद्यालय, फ्रांस) प्रदान करने के लिए डॉ रश्मि कोथारी के भी आभारी हैं। हम सांख्यिकीय विश्लेषण में उनके समर्थन के लिए गिलाउम कोरे को धन्यवाद देते हैं। 2एच3 (जेसेल, टीएम और डोड, जे द्वारा विकसित) और एसवी 2 (बकले, केएम द्वारा विकसित) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एनआईएच के एनआईसीएचडी द्वारा बनाए गए डेवलपमेंटल स्टडीज हाइब्रिडोमा बैंक (डीएसएचबी) से प्राप्त किए गए थे और आयोवा विश्वविद्यालय, जीव विज्ञान विभाग, आयोवा सिटी, आईए 52242 में बनाए गए थे। इस काम को एसोसिएशन फ्रैंकाइज़ कॉन्ट्रे लेस मायोपैथिस (एएफएम-टेलीथॉन), आईएनएसईआरएम और इवरी वैल डी'एससोन विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।

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लेखक इस काम से संबंधित हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

वर्णित वीडियो प्रोटोकॉल कॉन्फोकल और एसटीईडी माइक्रोस्कोपी के संयोजन से न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों की 3 डी संरचना को निर्धारित करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करता है जिसका उपयोग पूर्व और पोस्टसिनेप्टिक स्तरों पर पैथोलॉजिकल परिवर्तनों को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। एसटीईडी माइक्रोस्कोपी का उच्च रिज़ॉल्यूशन नैनोस्ट्रक्चर के विज़ुअलाइज़ेशन और मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण की अनुमति देता है जो पारंपरिक कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा पहचाने जाने योग्य नहीं हैं। इस प्रक्रिया ने हमें एसएमए और कोलक्यू से संबंधित सीएमएस चूहों के दो एपेंडिसुलर मांसपेशियों, टिबियलिस एंटीरियर और गैस्ट्रोकेनेमस में एनएमजे के संरचनात्मक परिवर्तनों को मापने में सक्षम बनाया।
इस तकनीक के साथ विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, मांसपेशियों को ठीक से विच्छेदित और चिढ़ाना महत्वपूर्ण है, मांसपेशियों के आसपास के प्रावरणी पर विशेष ध्यान देना और मांसपेशियों के बंडलों को अलग करने के लिए लागू ताकत; अन्यथा, संक्रमण पैटर्न को उचित प्रीसिनेप्टिक एनएमजे मूल्यांकन में बाधा डालने के लिए बाधित किया जा सकता है। यद्यपि टीए और जीए से एनएमजे का विश्लेषण करने के लिए विस्तृत जानकारी प्रदान की जाती है, सिद्धांत रूप में, इस प्रोटोकॉल को अन्य मांसपेशियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें फ्लैट मांसपेशियां शामिल हैं, जैसे कि डायाफ्राम या ट्रांसवर्स एब्डोमिनिस37, जिन्हें चिढ़ाने के कदम की आवश्यकता नहीं होती है। अच्छी गुणवत्ता वाले धुंधलापन सुनिश्चित करने के लिए ऊतक निर्धारण भी महत्वपूर्ण है; इसलिए, उचित मात्रा (मांसपेशियों के 15-20 गुना) पर उच्च गुणवत्ता वाले पीएफए का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, फिक्सेटिव के लिए एक्सपोजर समय एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि कलाकृतियां, जैसे संकोचन और झुरमुट, अति-निर्धारण के कारण दिखाई दे सकती हैं और एनएमजे सुविधाओं को प्रभावित कर सकती हैं। नमूनों के आकार औरऊतकों 38 में पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान की प्रवेश दर को देखते हुए, इस प्रकार की मांसपेशियों के लिए 18-24 घंटे के निर्धारण समय की सिफारिश की जाती है। यदि ऊतक कटाई के एक सप्ताह से अधिक समय बाद धुंधला कदम की योजना बनाई जाती है, तो बैक्टीरिया के प्रसार को रोकने के लिए पीबीएस में पीएफए-निश्चित मांसपेशियों को सोडियम एज़ाइड के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर पूरक रखने का सुझाव दिया जाता है।
यह प्रोटोकॉल कॉन्फोकल के लिए α-बीटीएक्स-एफ 488 और एसटीईडी इमेजिंग के लिए α-बीटीएक्स-एफ 633 का उपयोग करके एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है। इन फ्लोरोफोरे को वर्णित प्रयोगात्मक डिजाइन के साथ फिट करने के लिए चुना गया था, लेकिन उपलब्ध उपकरणों और सामग्रियों के अनुसार संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, छवि अधिग्रहण और परिमाणीकरण के लिए एसटीईडी सीडब्ल्यू 592 एनएम लेजर का उपयोग करते समय α-बीटीएक्स एफ 488 लेबलिंग का चयन किया जा सकता है। हालांकि, ऐसा प्रतीत होता है कि वर्तमान अध्ययन (स्पंदित उत्तेजना गेटेड एसटीईडी, 775 एनएम कमी) में लागू किया गया विन्यास अन्य दृष्टिकोणों की तुलना में उच्च प्रदर्शन और बेहतर रिज़ॉल्यूशन प्रदर्शित करता है, जैसे कि निरंतर तरंग एसटीईडी39, जिससे यह वर्तमान आवेदन के लिए अधिक उपयुक्त हो जाता है। लेजर पावर सेटिंग्स को ध्यान से चुनना भी महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से एसटीईडी (उत्तेजना और कमी दोनों) के लिए, क्योंकि संतृप्ति के मामले में तीव्रता प्रोफ़ाइल की विशेषताओं को मापा नहीं जा सकता है, और इसलिए एनएमजे छवि में कोई भी संतृप्त संकेत पूरे विश्लेषण को खतरे में डाल सकता है।
माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर और इमेजजे मैक्रोज़ का उपयोग करके छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सहित यह विस्तृत वर्कफ़्लो, एक मांसपेशी से कॉन्फोकल और एसटीईडी माइक्रोस्कोपी द्वारा स्वायत्त एनएमजे मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण की सुविधा के लिए विकसित किया गया था। एनएमजे कॉनफोकल विश्लेषण के लिए पहले वर्णित वर्कफ़्लो, जैसे एनएमजे-मॉर्फ2 या एनएमजे-एनालाइजर14, ने अर्ध-स्वचालित तरीकों के डिजाइन के लिए मार्ग प्रशस्त किया जो एनएमजे के रूपात्मक विश्लेषण और तुलनात्मक अध्ययन की सुविधा प्रदान करते हैं। एनएमजे-मॉर्फ (और इसका अद्यतन संस्करण एएनएमजे-मॉर्फ15) एक मुफ्त इमेजजे-आधारित मंच है जो 21 रूपात्मक विशेषताओं को मापने के लिए अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का उपयोग करता है, और एनएमजे-एनालाइजर पायथन में विकसित एक स्क्रिप्ट का उपयोग करता है जो पूरे 3 डी एनएमजे संरचना से 29 प्रासंगिक पैरामीटर उत्पन्न करता है। मैन्युअल थ्रेशोल्डिंग इन दो विधियों में छवि प्रसंस्करण के दौरान एकमात्र चरण है जिसके लिए उपयोगकर्ता विश्लेषण की आवश्यकता होती है। यह एकीकृत प्रोटोकॉल ऊतक तैयार करने, 3 डी कॉन्फोकल छवि अधिग्रहण, और पूरे कंकाल की मांसपेशियों से एनएमजे के इमेजजे-आधारित प्रसंस्करण के लिए चरणों का विवरण देता है और पोस्टसिनेप्टिक (वॉल्यूम, अधिकतम प्रक्षेपण क्षेत्र, और टॉर्टुओसिटी) और प्रीसिनेप्टिक (एक्सॉन टर्मिनल अधिभोग और न्यूरोफिलामेंट संचय) एंडप्लेट के पांच महत्वपूर्ण मापदंडों का सरलीकृत अवलोकन प्रदान करता है। जैविक प्रासंगिकता का एक अतिरिक्त पैरामीटर, पोस्टसिनेप्टिक जंक्शनल सिलवटों का एसीएचआर संगठन पैटर्न, सुपर-रिज़ॉल्यूशन एसटीईडी माइक्रोस्कोपी (रिज़ॉल्यूशन 20-30 एनएम) 40 द्वारा नैनोस्केल स्तर पर मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए शामिल किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि एसटीईडी इमेजिंग के लिए ऊतक तैयारी एनएमजे अल्ट्रास्ट्रक्चरल अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य तरीकों की तुलना में सरल है, जैसे कि पारंपरिक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) 9, जो एक जटिल और समय लेने वाली प्रक्रिया है जिसे उपयुक्त मांसपेशी क्षेत्र के अल्ट्राथिन वर्गों को प्राप्त करने के लिए एक कुशल मैनिपुलेटर की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, एसटीईडी से जुड़े सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कई जंक्शन सिलवटों से मात्रात्मक डेटा स्वचालित रूप से प्राप्त किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल एसएमएन और कोलक्यू की कमी वाली मांसपेशियों 20,36,41,42 में पहले से ज्ञात एनएमजे दोषों को चित्रित करने के लिए लागू किया गया था। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा दो माउस मॉडल में सामान्य परिवर्तन पाए गए, जैसे कि पोस्टसिनेप्टिक एंडप्लेट वॉल्यूम, एमआईपी क्षेत्र, और सापेक्ष टॉर्टुओसिटी में कमी, और न्यूरोफिलामेंट संचय में वृद्धि, जबकि कुछ और विशिष्ट निष्कर्ष (एनएमजे अधिभोग में कमी), केवल एसएमए चूहों में देखे गए थे, बिगड़ा हुआ पुटिका तस्करी36 के संकेतक के रूप में। अंत में, एसटीईडी विश्लेषण द्वारा कोलक्यू-केओ में एसीएचआर पट्टी दूरी और चौड़ाई में वृद्धि का पता लगाया गया था, जो पोस्टसिनेप्टिक जंक्शनल सिलवटों में अल्ट्रास्ट्रक्चरल दोषों के संकेत हैं, जैसा कि पहले टीईएम20 द्वारा देखा गया था। महत्वपूर्ण रूप से, यह प्रोटोकॉल विकास, रखरखाव और विभिन्न रोग स्थितियों के तहत न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के अधिक गहन रूपात्मक लक्षण वर्णन में मदद कर सकता है।

न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) एक जटिल संरचना है जो मोटर एक्सॉन टर्मिनल, एक पेरिसिनेप्टिक श्वान सेल और एक कंकाल मायोफिबर भाग से बना है जो रासायनिक जानकारी के संचरण और मांसपेशियों के संकुचन के लिए कम मोटर न्यूरॉन गतिविधि के युग्मन में शामिल है। स्तनधारियों में, न्यूरोमस्कुलर जंक्शन की आकृति विज्ञान विकास के दौरान बदल जाता है, परिपक्वता के बाद एक विशिष्ट प्रेट्ज़ेल जैसे आकार को अपनाता है, प्रजातियों के बीच आकार और जटिलता में अंतर के साथ, और व्यायाम या उम्र बढ़ने जैसी शारीरिक प्रक्रियाओं के जवाब में कुछ हद तक प्लास्टिसिटी दिखाता है 1,2,3,4 . पोस्टसिनेप्टिक मोटर एंडप्लेट जंक्शनल सिलवटनामक झिल्ली इनवेजाइनेशन बनाता है, जहां एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर्स (एसीएचआर) युक्त ऊपरी हिस्सा प्रीसिनेप्टिक टर्मिनल एक्सॉन शाखा5 के साथ निकट संपर्क में होता है।
न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों में रूपात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन कई न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों जैसे स्पाइनल मस्कुलर एट्रोफी (एसएमए) और एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस), मायोपैथी जैसे ड्यूशेन मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी), जन्मजात मायस्थेनिक सिंड्रोम (सीएमएस), मायास्थेनिया ग्रेविस (एमजी) और सेंट्रोन्यूक्लियर मायोपैथिस (सीएनएम), और उम्र बढ़ने से जुड़े सरकोपेनिया 3,6,7,8,9, 10,11,12. इन रोगों में, एनएमजे संरचनात्मक परिवर्तन जैसे एंडप्लेट विखंडन, कम पोस्टसिनेप्टिक जंक्शनल फोल्ड आकार और / या डीनेरवेशन देखा जाता है। एनएमजे की विकृति रोग की प्रगति के दौरान एक प्राथमिक या प्रारंभिक घटना हो सकती है या नैदानिक अभिव्यक्तियों में योगदान देने वाली द्वितीयक घटना के रूप में अधिक हाल ही में दिखाई देती है। किसी भी मामले में, इन रोगों के पशु मॉडल में एनएमजे की आकृति विज्ञान की निगरानी पैथोलॉजिकल परिवर्तनों का अध्ययन करने और संभावित उपचारों की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए एक मूल्यवान पैरामीटर का प्रतिनिधित्व करती है।
न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों की आकृति विज्ञान का विश्लेषण आमतौर पर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 2,13,14,15 या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 5,16 का उपयोग करके तकनीकों द्वारा किया जाता है, जिसमें क्रमशः संकल्प या तकनीकी कठिनाइयों जैसी उनकी अंतर्निहित सीमाएं होती हैं। हाल ही में, सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग एनएमजे के विशेष क्षेत्रों की कल्पना करने के लिए भी किया गया था, जैसे कि प्रीसिनेप्टिक सक्रिय क्षेत्र या पोस्टसिनेप्टिक झिल्ली 16,17,18 पर एसीएचआर वितरण, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा अल्ट्रास्ट्रक्चरल विश्लेषण के लिए एक वैकल्पिक या पूरक दृष्टिकोण के रूप में।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य फ्लोरेसेंस कॉन्फोकल और उत्तेजित उत्सर्जन कमी (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी के संयोजन से एनएमजे रूपात्मक मापदंडों का आकलन करने के लिए एक विस्तृत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रदान करना है। प्रीसिनेप्टिक और पोस्टसिनेप्टिक एंडप्लेट की महत्वपूर्ण विशेषताएं, जैसे वॉल्यूम, क्षेत्र, सापेक्ष टॉर्टुओसिटी, एसीएचआर पट्टी चौड़ाई, और माउस गैस्ट्रोकेनेमस और टिबियलिस एंटीरियर के आंतरिक टेड टीज मांसपेशी फाइबर में एक्सॉन टर्मिनल वितरण को सामान्य और रोगग्रस्त स्थितियों के संदर्भ में निर्धारित किया गया था। विशेष रूप से, एनएमजे दोषों को स्पाइनल मस्कुलर एट्रोफी के एसएमएन2 बी / - माउस मॉडल में उदाहरण दिया गया था, जो एसएमएन 1 जीन 11,19 में उत्परिवर्तन के कारण मोटर न्यूरॉन अपघटन के साथ एक न्यूरोमस्कुलर बीमारी है, और एसिमेट्रिक एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ नॉकआउट (कोलक्यूडेक्स 2 / डेक्स 2 या कोलक्यू-केओ) चूहों के कोलेजन जैसी पूंछ सबयूनिट में, जन्मजात मायस्थेनिक सिंड्रोम20 के मॉडल के रूप में। 21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Buffers and Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 &#945;-bungarotoxin (F488-a-BTX)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>B13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATTO-633 &#945;-bungarotoxin (F633-a-BTX)</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-100-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS</td>
			<td>Gibco, Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol Absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion Oil, n = 1.518</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>MOIL-10LF&#160;</td>
			<td>Low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurofilament (NF-M) antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_531793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.04005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_2315387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alnico Button cylindrical magnets</td>
			<td>Farnell France</td>
			<td>E822</td>
			<td>diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >63x 1.4 NA magnitude oil immersion&#160; HCX Plan Apo CS objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Curved thin forceps-Moria iris forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra thin scissors - Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15-003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel loading tip round 1-200 &#181;L</td>
			<td>COSTAR</td>
			<td>4853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue&#160;</td>
			<td>Whatman (GE Healthcare)</td>
			<td>2105-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170&#177;5 &#181;m</td>
			<td>Marienfield</td>
			<td>107222</td>
			<td>High precision</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (12-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (24-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safeshield scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.40.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost plus slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GraphPad&#160;</td>
			<td>Prism, San Diego (US)</td>
			<td>Release N&#176;6.07</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Release N&#176; 1.53f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Release N&#176;3.7.2.2283</td>
			<td >Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy

न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) निचले मोटर न्यूरॉन्स और कंकाल की मांसपेशी फाइबर के बीच अत्यधिक विशिष्ट सिनैप्स हैं जो तंत्रिका तंत्र से स्वैच्छिक मांसपेशियों तक अणुओं के संचरण में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं, जिससे संकुचन होता है। वे कई मानव रोगों में प्रभावित होते हैं, जिनमें विरासत में मिले न्यूरोमस्कुलर विकार जैसे ड्यूचेन मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी), जन्मजात मायस्थेनिक सिंड्रोम (सीएमएस), स्पाइनल मस्कुलर एट्रोफी (एसएमए), और एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) शामिल हैं। इसलिए, न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों की आकृति विज्ञान की निगरानी और रोग माउस मॉडल में उनके परिवर्तन पैथोलॉजिकल अध्ययन और चिकित्सीय दृष्टिकोण के प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। यहां, म्यूरिन टीज्ड मांसपेशी फाइबर से मोटर एंडप्लेट के पूर्व और पोस्टसिनेप्टिक भागों के त्रि-आयामी (3 डी) आकृति विज्ञान को लेबल करने और विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन किया गया है। नमूने तैयार करने और कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा एनएमजे की मात्रा, क्षेत्र, टोर्टुओसिटी और एक्सॉन टर्मिनल आकृति विज्ञान / अधिभोग को मापने की प्रक्रियाएं, और सुपर-रिज़ॉल्यूशन उत्तेजित उत्सर्जन कमी (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी द्वारा पोस्टसिनेप्टिक जंक्शनल सिलवटों और एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर (एसीएचआर) पट्टी चौड़ाई के बीच की दूरी विस्तृत है। इन एनएमजे मापदंडों में परिवर्तन एसएमए और सीएमएस से प्रभावित उत्परिवर्ती चूहों में चित्रित किए गए हैं।

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Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

यह प्रोटोकॉल संयुक्त कॉन्फोकल और एसटीईडी माइक्रोस्कोपी द्वारा न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन करता है जिसका उपयोग एसएमए और कोलक्यू से संबंधित सीएमएस के माउस मॉडल में पैथोलॉजिकल परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए किया जाता है।

संयुक्त कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी द्वारा चूहों में न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों का लक्षण वर्णन

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

यह प्रोटोकॉल मात्रात्मक रूप से एक सरल प्रक्रिया का उपयोग करके इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के करीब एक संकल्प पर न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों की 3 डी संरचना का विश्लेषण करने में मदद करता है। इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ यह है कि मांसपेशियों के नमूनों को समान रूप से संसाधित किया जाता है और कॉन्फोकल और एसटीईडी माइक्रोस्कोपी के लिए इम्यूनोलेबल किया जाता है, जिससे पशु मॉडल में सटीक न्यूरोमस्कुलर जंक्शन संरचना मूल्यांकन के लिए समय कम हो जाता है। हमारे द्वारा विकसित रूपात्मक परिमाणीकरण को आसानी से अन्य उपकोशिकीय संरचनाओं का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।मार्टिना मारिनेलो, मेरी टीम के एक वैज्ञानिक को पेश करना मेरी खुशी है, जो दिखा रहे होंगे कि मांसपेशियों को छेड़ना और इम्यूनोस्टेनिंग कैसे किया जाता है और इस प्रोटोकॉल के सफल अनुप्रयोग के लिए कुछ सिफारिशें देते हैं। जेरेमी कोसेट को जीनथन के इमेजिंग प्लेटफॉर्म से पेश करते हुए खुशी हो रही है जो कॉन्फोकल और एसटीईडी माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवि अधिग्रहण और विश्लेषण दिखाएंगे। यूथेनाइजेशन के बाद, टिबियलिस पूर्ववर्ती मांसपेशियों को लगभग एक मिलीमीटर चौड़े छोटे फाइबर बंडलों में दो महीन सेरेटेड फोर्सेस का उपयोग करके चिढ़ाना शुरू करें।फिर, इन मांसपेशियों के बंडलों को पीबीएस में तैयार 1% ट्राइटन एक्स -100 युक्त 24-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें और इसे कमरे के तापमान पर एक घंटे या चार डिग्री सेल्सियस पर पांच घंटे के लिए धीरे से आंदोलन करने की अनुमति दें। कमरे के तापमान पर पीबीएस के साथ पांच मिनट के लिए नमूनों को तीन बार धोने के बाद, नमूनों को पीबीएस में तैयार 4% बीएसए से बने ब्लॉकिंग समाधान के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर चार घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर चार घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, प्रीसिनेप्टिक एक्सॉन टर्मिनल या सक्रिय क्षेत्रों को लेबल करने के लिए क्रमशः न्यूरोफिलामेंट एम या सिनैप्टिक पुटिका ग्लाइकोप्रोटीन 2 के खिलाफ प्राथमिक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी युक्त एक ही ब्लॉकिंग समाधान के साथ रात भर नमूनों को इनक्यूबेट करें।अगले दिन, लेबल किए गए मांसपेशियों के बंडलों को सौम्य आंदोलन के तहत पीबीएस के साथ पांच मिनट के लिए तीन बार धोएं। फिर, उन्हें कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए शेकर पर रखकर उचित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें। मांसपेशियों के बंडलों को फिर से धोने के बाद, उन्हें बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड पर रखें।फिर, शीर्ष पर 1.5-ग्रेड ग्लास कवर स्लिप रखें, इसके बाद दबाव लागू करने और मांसपेशियों को समतल करने के लिए स्लाइड के दोनों किनारों पर बेलनाकार मैग्नेट रखें। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करने के लिए, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर लॉन्च करें और कॉन्फ़िगरेशन मोड के रूप में मशीन चुनें और पाठ पांडुलिपि में उल्लिखित सेटिंग्स के अनुसार प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के छवि ढेर एकत्र करें। सत्र के अंत में, ओपन इन 3 डी व्यूअर पर क्लिक करें और 3 डी लेबलिंग की कल्पना करने के लिए एक प्रयोगात्मक समूह के न्यूरोमस्कुलर जंक्शन प्रतिनिधि चुनें।पोस्ट-सिनैप्टिक न्यूरोमस्कुलर जंक्शन और प्लेट वॉल्यूम, अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण क्षेत्र, और सापेक्ष टॉर्टुओसिटी की गणना करने के लिए, न्यूरोमस्कुलर जंक्शन वॉल्यूम परिमाणीकरण के लिए मैक्रो को इमेज जे विंडो में खींचें और छोड़ दें, और जब मैक्रो दूसरी विंडो में खुलता है, तो मैक्रोज़ और रन मैक्रो पर क्लिक करें। विश्लेषण किए जाने वाले जंक्शन सबफ़ोल्डर वाले मूल फ़ोल्डर का चयन करें और चयन करें पर क्लिक करें। फिर, सहेजने फ़ोल्डर पॉपअप मेनू में, संग्रहण फ़ोल्डर का चयन करें और चयन करें पर क्लिक करें।छवि प्रकार नामक नए पॉप-अप मेनू में, जेड स्टैक अधिग्रहण के प्रारूप का चयन करें। रुचि के धुंधलापन के अनुरूप आरजीबी चैनल का चयन करें और एक्स, वाई पिक्सेल आकार और जेड चरण इंगित करें। यदि मालिकाना फ़ाइल स्वरूपों का चयन किया जाता है, तो मैक्रो सीधे पिक्सेल आकार और Z चरण पढ़ता है।प्रीसिनेप्टिक न्यूरोफिलामेंट संचय को मापने के लिए, न्यूरोमस्कुलर जंक्शन संचय परिमाणीकरण के लिए मैक्रो को इमेज जे विंडो में खींचें और छोड़ दें, और मैक्रोज़ और रन मैक्रो पर क्लिक करें। जंक्शन सबफ़ोल्डर्स, स्टोरेज फ़ोल्डर और जेड स्टैक अधिग्रहण के प्रारूप का चयन करें जैसा कि पहले दिखाया गया है। फिर, स्टेनिंग इन्फोस पॉपअप में, प्री-सिनैप्टिक और पोस्ट-सिनैप्टिक लेबल और रंग इंगित करें और पिक्सेल आकार पॉपअप OK.In पर क्लिक करें, एक्स, वाई पिक्सेल आकार को 0.072 माइक्रोमीटर के रूप में इंगित करें, जेड चरण को 0.5 माइक्रोमीटर के रूप में इंगित करें, और ओके पर क्लिक करें। यदि मालिकाना फ़ाइल स्वरूपों का चयन किया जाता है, तो मैक्रो सीधे पिक्सेल आकार और Z चरण पढ़ता है।एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर धारियों के बीच की दूरी की गणना करने के लिए, केंद्रीय विंडो के शीर्ष पर मात्रा मेनू का चयन करें। उपकरण टैब पर क्लिक करें, तीव्रता का चयन करें, और लाइन प्रोफ़ाइल आइकन पर क्लिक करें। ओवरसैंपलिंग को एक पर सेट करें और चैनल ों को सॉर्ट करें।ओपन प्रोजेक्ट्स टैब पर क्लिक करें और विश्लेषण किए जाने के लिए फ़िल्टर की गई छवि का चयन करें। फिर, ड्रॉ लाइन आइकन पर क्लिक करें और कई धारियों या जंक्शन सिलवटों के लंबवत एक रेखा पार करने का पता लगाएं। पहले शिखर के शीर्ष पर क्लिक करें और बाएं माउस बटन को दबाते हुए माउस पॉइंटर को तब तक स्थानांतरित करें जब तक कि अगली अधिकतम चोटी तक नहीं पहुंच जाता।डीएक्स मान पर ध्यान दें, जो दो चोटियों के बीच की दूरी से मेल खाता है। दाईं विंडो की छवि में माउस पर राइट-क्लिक करें और ROIs सहेजें का चयन करें। तीर आइकन पर क्लिक करने के बाद, ROI पर क्लिक करें और बिन आइकन पर क्लिक करके इसे हटा दें।एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर पट्टी की चौड़ाई की गणना करने के लिए, टूल टैब के तहत शीर्ष बाएं पैनल में तीव्रता का चयन करें, निर्धारित एफडब्ल्यूएचएम आइकन पर क्लिक करें, और सॉर्ट चैनलों को टिक करें। फिर ओपन प्रोजेक्ट्स टैब पर क्लिक करें और विश्लेषण की जाने वाली फ़िल्टर की गई छवि का चयन करें। इसके बाद, दाईं विंडो के शीर्ष मेनू में ड्रॉ आयत आइकन पर क्लिक करें।एक पट्टी का चयन करें जो या तो क्षैतिज या ऊर्ध्वाधर है और पट्टी के लंबवत एक आयत खींचें। केंद्रीय विंडो में एक प्रोफ़ाइल प्रकट होती है। बाएं पैनल में स्थित औसत प्रक्षेपण मेनू के ऊर्ध्वाधर या क्षैतिज पर क्लिक करें, यह इस बात पर निर्भर करता है कि पट्टी अभिविन्यास ऊर्ध्वाधर या क्षैतिज है या नहीं।FWHM मान को पढ़ने के लिए केंद्रीय विंडो में सांख्यिकी पर क्लिक करें और फिर पहले दिखाए गए अनुसार ROIs को सहेजें और हटाएं। फ्लोरोसेंट अल्फा-बंगारोटॉक्सिन के साथ लेबल की गई पोस्ट-सिनैप्टिक मोटर एंड प्लेट, दो माउस लाइनों के उत्परिवर्ती में छोटी और खंडित दिखाई दी। अनुकूलित इमेज जे मैक्रोज़ का उपयोग करके न्यूरोमस्कुलर जंक्शन जेड स्टैक्स की मात्रा का परिमाणीकरण नियंत्रण की तुलना में दोनों रोग माउस मॉडल में अंतिम प्लेट वॉल्यूम, अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण और सापेक्ष टॉर्टुओसिटी में उल्लेखनीय कमी का खुलासा करता है, जो न्यूरोमस्कुलर जंक्शन परिपक्वता दोषों का संकेत देता है।इमेज जे कस्टम मैक्रो का उपयोग करके प्रीसिनेप्टिक एक्सॉन टर्मिनल शाखा वितरण की मात्रा निर्धारित करने से दो पशु मॉडल में न्यूरोफिलामेंट एम वितरण में एक परिवर्तित पैटर्न का पता चला, जिसमें इम्यूनोलेबलिंग में वृद्धि हुई थी। सिनैप्टिक पुटिका ग्लाइकोप्रोटीन 2 धुंधला होने के माध्यम से, एसएमएन 2 बी / चूहों में आसन्न तंत्रिका टर्मिनल सक्रिय क्षेत्रों के साथ एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर युक्त क्षेत्रों के अधिभोग अनुपात में 43% की कमी देखी गई थी। न्यूरोमस्कुलर जंक्शन पोस्टसिनेप्टिक एंड प्लेट्स के पहलू को फ्लोरोसेंट अल्फा-बंगारोटॉक्सिन लेबलिंग और तीव्रता प्रोफ़ाइल विश्लेषण द्वारा स्पष्ट रूप से देखा गया था।न्यूरोमस्कुलर जंक्शन मापदंडों का मूल्यांकन करने से उत्परिवर्ती के गैस्ट्रोकेनेमस मांसपेशी में एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर धारियों की जंक्शन फोल्ड दूरी और चौड़ाई में वृद्धि का पता चला। विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, मांसपेशियों को ठीक से छेड़ना महत्वपूर्ण है, मांसपेशियों के बंडलों को अलग करने के लिए लागू ताकत पर विशेष ध्यान देना। यह प्रोटोकॉल न्यूरोमस्कुलर जंक्शन के अधिक गहन रूपात्मक लक्षण वर्णन को प्राप्त करने में मदद कर सकता है, जिसे पहले केवल जटिल और समय लेने वाली प्रक्रियाओं, जैसे ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा जिम्मेदार ठहराया गया था।एसटीईडी इमेजिंग प्रक्रिया ने पूर्व और पोस्ट-सिनैप्टिक मार्करों से संबंधित नई अंतर्दृष्टि की जांच के लिए मार्ग प्रशस्त किया, जो न्यूरोमस्कुलर जंक्शन को प्रभावित करने वाले रोगों के पैथोफिज़ियोलॉजी में योगदान करते हैं।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

लगातार निकोटीन प्रशासन के साथ चूहे तोड़े fluorescently टैग निकोटिनिक रिसेप्टर्स की वर्णक्रमीय इमेजिंग confocal

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Neuronal घने कोर vesicles के सुपर संकल्प इमेजिंग

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Neuromuscular जंक्शन: माप Synapse आकार, confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग Synaptic प्रोटीन घनत्व में विखंडन और परिवर्तन

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes की तीन आयामी Confocal morphometric विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

क्यों मात्रा मामला: phenotypes की विशेषता पर<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; लारवल neuromuscular जंक्शन

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Neuronal गतिविधि के बाह्य रिकॉर्डिंग जाग चूहों में neuroactive पदार्थों के Microiontophoretic आवेदन के साथ संयुक्त

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

अनुजंघास्थिक तंत्रिका चोट विधि: एक विश्वसनीय परख की पहचान करने और टेस्ट कि मरम्मत neuromuscular जंक्शनों कारक

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

ट्रिगर सेल तनाव और मौत पारंपरिक यूवी लेजर confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

दृश्य और Organotypic मस्तिष्क Adeno-जुड़े वायरस और फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग स्लाइस में Oligodendrocyte Organelles के लाइव इमेजिंग

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

प्राथमिक न्यूरॉन्स में प्रोटीन और सिनैप्टिक मार्कर के सह-स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...