Name: characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy
Uploaded: 2021-12-08T13:00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Ringraziamo la "Imaging and Cytometry Core Facility" di Genethon, così come il servizio di istologia, che sono supportati in parte dai fondi per le attrezzature della Regione Ile-de-France, del Conseil General de l'Essonne, della Genopole Recherche di Evry, dell'Università di Evry Val d'Essonne e dell'INSERM, Francia. Siamo anche grati al Dr. Rashmi Kothary per aver fornito la linea di mouse Smn 2B / 2B (Università di Ottawa, Canada) e al Dr. Eric Krejci per la linea di mouse ColQDex2 / + (non pubblicato, Università di Parigi, Francia). Ringraziamo Guillaume Corre per il suo sostegno nell'analisi statistica. Gli anticorpi monoclonali 2H3 (sviluppati da Jessel, T.M. e Dodd, J.) e SV2 (sviluppati da Buckley, K.M.) sono stati ottenuti dalla Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), creata dal NICHD del NIH e mantenuta presso l'Università dell'Iowa, Dipartimento di Biologia, Iowa City, IA 52242. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon), dall'INSERM e dall'Università di Evry Val d'Essonne.

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse relativi a questo lavoro.

Il protocollo video descritto fornisce un metodo dettagliato per quantificare la struttura 3D delle giunzioni neuromuscolari combinando microscopia confocale e STED che può essere utilizzata per caratterizzare i cambiamenti patologici a livello pre- e postsinaptico. L'alta risoluzione della microscopia STED consente la visualizzazione e l'analisi morfometrica di nanostrutture che non sono identificabili dall'imaging confocale convenzionale. Questa procedura ci ha permesso di misurare le alterazioni strutturali delle NMJ in due muscoli appendicolari, tibiale anteriore e gastrocnemio, di topi CMS correlati a SMA e ColQ.
Per ottenere risultati affidabili con questa tecnica, è fondamentale sezionare e stuzzicare correttamente i muscoli, prestando particolare attenzione alla fascia che circonda il muscolo e alla forza applicata per separare i fasci muscolari; in caso contrario, il modello di innervazione potrebbe essere interrotto impedendo una corretta valutazione presinaptica NMJ. Sebbene vengano fornite informazioni dettagliate per analizzare NMJ da TA e GA, in linea di principio, questo protocollo potrebbe essere adattato ad altri muscoli, compresi i muscoli piatti, come il diaframma o l'addome trasverso37, che non richiedono la fase di presa in giro. Anche la fissazione dei tessuti è fondamentale per garantire una colorazione di buona qualità; pertanto, si consiglia di utilizzare PFA di alta qualità ad un volume appropriato (15-20 volte quello del muscolo). Inoltre, il tempo di esposizione al fissativo è un passo importante perché artefatti, come il restringimento e l'aggregazione, possono apparire a causa della sovrafissazione e influenzare le caratteristiche NMJ. Date le dimensioni dei campioni e la velocità di penetrazione della soluzione di paraformaldeide nei tessuti38, si raccomanda un tempo di fissazione di 18-24 h per questo tipo di muscolo. Nel caso in cui la fase di colorazione sia pianificata più di una settimana dopo la raccolta dei tessuti, si suggerisce di mantenere i muscoli fissati con PFA in PBS integrati con azoturo di sodio a 4 ° C per prevenire la proliferazione batterica.
Questo protocollo presenta un approccio che utilizza α-BTX-F488 per l'imaging confocale e α-BTX-F633 per l'imaging STED. Questi fluorofori sono stati scelti per adattarsi al progetto sperimentale descritto, ma possono essere modificati in base alle attrezzature e ai materiali disponibili. Ad esempio, l'etichettatura α-BTX F488 può essere selezionata quando si utilizza un laser STED CW 592 nm per l'acquisizione e la quantificazione delle immagini. Tuttavia, sembra che la configurazione applicata nel presente studio (eccitazione pulsata dipendente STED, esaurimento di 775 nm) mostri prestazioni più elevate e una migliore risoluzione rispetto ad altri approcci, come STED39 ad onda continua, rendendolo più adatto per l'applicazione corrente. È inoltre importante selezionare attentamente le impostazioni di potenza del laser, in particolare per STED (sia eccitazione che esaurimento), poiché le caratteristiche di un profilo di intensità non possono essere misurate in caso di saturazione, e quindi qualsiasi segnale saturo in un'immagine NMJ potrebbe compromettere l'intera analisi.
Questo flusso di lavoro dettagliato, che include l'acquisizione e l'analisi delle immagini utilizzando il software del microscopio e le macro ImageJ, è stato sviluppato per facilitare l'analisi morfometrica NMJ autonoma mediante microscopia confocale e STED da un singolo muscolo. I flussi di lavoro precedentemente descritti per l'analisi confocale NMJ, come NMJ-morph2 o NMJ-Analyser14, hanno aperto la strada alla progettazione di metodi semiautomatici che facilitano l'analisi morfologica di NMJ e studi comparativi. NMJ-morph (e la sua versione aggiornata aNMJ-morph15) è una piattaforma gratuita basata su ImageJ che utilizza la proiezione di intensità massima per misurare 21 caratteristiche morfologiche, e NMJ-Analyser utilizza uno script sviluppato in Python che genera 29 parametri rilevanti dall'intera struttura NMJ 3D. La soglia manuale è l'unico passaggio durante l'elaborazione delle immagini in questi due metodi che richiedono l'analisi dell'utente. Questo protocollo integrato descrive in dettaglio i passaggi per la preparazione dei tessuti, le acquisizioni di immagini confocali 3D e l'elaborazione basata su ImageJ di NMJ da interi muscoli scheletrici e fornisce una panoramica semplificata di cinque importanti parametri delle piastre terminali postsinaptiche (volume, area di proiezione massima e tortuosità) e presinaptiche (occupazione terminale degli assoni e accumulo di neurofilamenti). Un ulteriore parametro di rilevanza biologica, il modello di organizzazione AChR delle pieghe giunzionali postsinaptiche, è stato incorporato per l'analisi morfometrica a livello nanometrico mediante microscopia STED a super-risoluzione (risoluzione 20-30 nm)40. È interessante notare che la preparazione dei tessuti per l'imaging STED è più semplice di altri metodi utilizzati per gli studi ultrastrutturali NMJ, come la microscopia elettronica a trasmissione convenzionale (TEM)9, che è una procedura piuttosto complessa e dispendiosa in termini di tempo che richiede un manipolatore esperto per ottenere sezioni ultrasottili della regione muscolare appropriata. Inoltre, i dati quantitativi da più pieghe giunzionali possono essere ottenuti automaticamente usando il software associato a STED.
Questo protocollo è stato applicato per illustrare difetti NMJ precedentemente noti nei muscoli carenti di SMN e ColQ 20,36,41,42. Cambiamenti comuni sono stati trovati nei due modelli murini mediante microscopia confocale, come la diminuzione del volume della placca terminale postsinaptica, l'area MIP e la tortuosità relativa e l'aumento dell'accumulo di neurofilamenti, mentre alcuni risultati più specifici (diminuzione dell'occupazione NMJ), sono stati osservati solo nei topi SMA, come indicatore del traffico di vescicole alterato36. Infine, un aumento della distanza e della larghezza della banda AChR è stato rilevato in ColQ-KO mediante analisi STED, che sono segni di difetti ultrastrutturali nelle pieghe giunzionali postsinaptiche, come precedentemente osservato da TEM20. È importante sottolineare che questo protocollo può aiutare in una caratterizzazione morfologica più approfondita delle giunzioni neuromuscolari durante lo sviluppo, il mantenimento e in varie condizioni patologiche.

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è una struttura complessa composta da un terminale assone motorio, una cellula di Schwann perisinaptica e una porzione di miofibra scheletrica coinvolta nella trasmissione di informazioni chimiche e nell'accoppiamento dell'attività del motoneurone inferiore alla contrazione muscolare. Nei mammiferi, la morfologia della giunzione neuromuscolare cambia durante lo sviluppo, adottando una tipica forma simile al pretzel dopo la maturazione, con differenze di forma e complessità tra le specie, e mostra un certo grado di plasticità in risposta a processi fisiologici come l'esercizio fisico o l'invecchiamento 1,2,3,4 . La piastra terminale motoria postsinaptica forma invaginazioni di membrana chiamate pieghe giunzionali, dove la parte superiore contenente i recettori dell'acetilcolina (AChR) è in stretto contatto con il ramo dell'assone terminale presinaptico5.
I cambiamenti morfologici e funzionali nelle giunzioni neuromuscolari contribuiscono alla fisiopatologia di diverse malattie neurodegenerative come l'atrofia muscolare spinale (SMA) e la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), miopatie come la distrofia muscolare di Duchenne (DMD), sindromi miasteniche congenite (CMS), miastenia grave (MG) e miopatie centronucleari (CNM) e sarcopenia associata all'invecchiamento 3,6,7,8,9, 10,11,12. In queste malattie si osservano alterazioni strutturali della NMJ come frammentazione della placca terminale, riduzione delle dimensioni della piega giunzionale postsinaptica e/o denervazione. La patologia delle NMJ può essere un evento primario o precoce durante la progressione della malattia o apparire più recentemente come un evento secondario che contribuisce alle manifestazioni cliniche. In ogni caso, il monitoraggio della morfologia delle NMJ in modelli animali di queste malattie rappresenta un parametro prezioso per studiare i cambiamenti patologici e valutare l'efficacia di potenziali trattamenti.
La morfologia delle giunzioni neuromuscolari viene solitamente analizzata mediante tecniche che utilizzano la microscopia confocale 2,13,14,15 o la microscopia elettronica 5,16, con le loro limitazioni intrinseche come la risoluzione o le difficoltà tecniche, rispettivamente. Più recentemente, la microscopia a super-risoluzione è stata utilizzata anche per visualizzare particolari regioni del NMJ, come le zone attive presinaptiche o la distribuzione AChR sulla membrana postsinaptica16,17,18, come approccio alternativo o complementare all'analisi ultrastrutturale mediante microscopia elettronica.
Questo protocollo mira a fornire un metodo dettagliato e riproducibile per valutare i parametri morfologici NMJ combinando la microscopia a fluorescenza confocale e STED (Stimulated emission depletion). Importanti caratteristiche delle placche terminali presinaptiche e postsinaptiche, come volume, area, tortuosità relativa, larghezza della banda AChR e distribuzione terminale degli assoni nelle fibre muscolari innervate di gastrocnemio di topo e tibiale anteriore sono state quantificate nel contesto di condizioni normali e patologiche. In particolare, i difetti NMJ sono stati esemplificati nel modello murino Smn 2B/- di atrofia muscolare spinale, una malattia neuromuscolare con degenerazione del motoneurone causata da mutazioni nel gene SMN1 11,19, e in una subunità della coda simile al collagene di topi asimmetrici knockout acetilcolinesterasi (ColQ Dex2/Dex2 o ColQ-KO), come modello della sindrome miastenica congenita 20, 21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Buffers and Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 &#945;-bungarotoxin (F488-a-BTX)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>B13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATTO-633 &#945;-bungarotoxin (F633-a-BTX)</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-100-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS</td>
			<td>Gibco, Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol Absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion Oil, n = 1.518</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>MOIL-10LF&#160;</td>
			<td>Low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurofilament (NF-M) antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_531793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.04005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_2315387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alnico Button cylindrical magnets</td>
			<td>Farnell France</td>
			<td>E822</td>
			<td>diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >63x 1.4 NA magnitude oil immersion&#160; HCX Plan Apo CS objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Curved thin forceps-Moria iris forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra thin scissors - Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15-003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel loading tip round 1-200 &#181;L</td>
			<td>COSTAR</td>
			<td>4853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue&#160;</td>
			<td>Whatman (GE Healthcare)</td>
			<td>2105-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170&#177;5 &#181;m</td>
			<td>Marienfield</td>
			<td>107222</td>
			<td>High precision</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (12-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (24-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safeshield scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.40.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost plus slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GraphPad&#160;</td>
			<td>Prism, San Diego (US)</td>
			<td>Release N&#176;6.07</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Release N&#176; 1.53f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Release N&#176;3.7.2.2283</td>
			<td >Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy

Le giunzioni neuromuscolari (NMJ) sono sinapsi altamente specializzate tra i motoneuroni inferiori e le fibre muscolari scheletriche che svolgono un ruolo essenziale nella trasmissione delle molecole dal sistema nervoso ai muscoli volontari, portando alla contrazione. Sono colpiti in molte malattie umane, tra cui disturbi neuromuscolari ereditari come la distrofia muscolare di Duchenne (DMD), sindromi miasteniche congenite (CMS), atrofia muscolare spinale (SMA) e sclerosi laterale amiotrofica (SLA). Pertanto, il monitoraggio della morfologia delle giunzioni neuromuscolari e delle loro alterazioni in modelli murini di malattia rappresenta un valido strumento per gli studi patologici e la valutazione preclinica degli approcci terapeutici. Qui vengono descritti i metodi per l'etichettatura e l'analisi della morfologia tridimensionale (3D) delle parti pre e postsinaptiche delle placche terminali del motore da fibre muscolari prese in giro murine. Le procedure per preparare i campioni e misurare il volume, l'area, la tortuosità e la morfologia/occupazione terminale degli assoni mediante imaging confocale e la distanza tra le pieghe giunzionali postsinaptiche e la larghezza della banda del recettore dell'acetilcolina (AChR) mediante microscopia STED (super-resolution stimulated emission depletion) sono dettagliate. Le alterazioni di questi parametri NMJ sono illustrate in topi mutanti affetti da SMA e CMS.

Al fine di facilitare l'analisi morfologica delle giunzioni neuromuscolari a livello pre- e postsinaptico in modo riproducibile, è stato sviluppato un flusso di lavoro dal prelievo muscolare all'imaging e alla quantificazione utilizzando il software del microscopio e le macro personalizzate ImageJ (Figura 1). Per esemplificare l'utilità di questo protocollo, è stata valutata la morfologia delle NMJ in due modelli murini di malattie genetiche, topi Smn2B / - e ColQ Dex2 / Dex2 affetti da atrofia muscolare spinale (SMA) e una forma di sindrome miastenica congenita (CMS), rispettivamente, e i dati sono stati confrontati con compagni di controllo di pari età.
La struttura NMJ è stata valutata dai muscoli tibiale anteriore e gastrocnemio di topi Smn2B/- (sfondo C57Bl/6) e ColQ Dex2/Dex2 (sfondo B6D2F1/J) di 3 e 6 settimane, rispettivamente, quando i segni della malattia sono già presenti in questi animali. A 3 settimane di età, i topi Smn2B/- mostrano segni di ritardo nello sviluppo e nella denervazione del muscolo scheletrico, come atrofia NMJ e perdita35,36. I topi CMS hanno una patologia primaria nelle NMJ e manifestano una riduzione del peso corporeo dalla prima settimana di vita e una marcata debolezza muscolare20 (dati non mostrati). Come mostrato nella Figura 2A, la piastra terminale del motore postsinaptico marcata con α-bungarotoxina fluorescente è apparsa più piccola e/o frammentata nei mutanti delle due linee di topo mediante microscopia confocale. La quantificazione degli Z-stack NMJ utilizzando queste macro personalizzate di ImageJ ha rivelato marcate diminuzioni del volume della piastra terminale, della proiezione della massima intensità (MIP) e della tortuosità relativa nei topi SMA e CMS rispetto ai controlli, come segni di difetti di maturazione NMJ32 (Figura 2B-D). Il volume della placca terminale postsinaptica e la MIP sono diminuiti negli animali malati (variazione di piega di 2,7 e 2,0 per il volume e 2,5 e 2,0 per la MIP, rispettivamente nei topi Smn2B/- e ColQ Dex2/Dex2). La tortuosità relativa era anche inferiore nei muscoli carenti di SMN e ColQ rispetto alla WT (16,97% ± 1,33% nella SMA contro il 48,84% ± il 5,90% dei topi WT e il 13,29% ± 2,79% nei topi di controllo CMS rispetto al 30,20% ± 4,44% dei topi di controllo). Inoltre, la quantificazione della distribuzione dei rami terminali degli assoni presinaptici utilizzando la macro personalizzata ImageJ ha rivelato un pattern alterato nella distribuzione del neurofilamento M nei due modelli animali, con un aumento dell'immunomarcatura (84,65% ± 0,32% contro 16,57% ± 2,03% e 23,64% ± 2,78% rispetto al 18,77% ± 1,73% nei topi Smn2B/- e ColQ Dex2/Dex2 rispetto ai controlli, rispettivamente) (Figura 3A-D ). Con la colorazione SV2, è stata osservata anche una riduzione del 43% del rapporto di occupazione, cioè la percentuale di regioni contenenti AChR con zone attive adiacenti ai terminali nervosi, (topi Smn2B / - (49,36% ± 3,76% in SMA contro 85,69% ± 2,34% topi WT) (Figura 3E, F). Questo parametro NMJ è stato calcolato anche in GA di mutanti ColQ Dex2/Dex2, ma non è stata trovata alcuna differenza statisticamente significativa rispetto ai compagni di cucciolata di controllo (dati non mostrati).
Abbiamo ulteriormente analizzato le caratteristiche della membrana postsinaptica quantificando la distanza tra le pieghe giunzionali e la larghezza delle strisce AChR, che si trovano sulla cresta di queste pieghe, nel muscolo carente di ColQ utilizzando la microscopia STED (super-resolution stimulated emission depletion). Come mostrato nella Figura 4, l'aspetto di queste strutture può essere chiaramente visualizzato mediante marcatura fluorescente α-bungarotoxin e analisi del profilo di intensità. Abbiamo valutato questi parametri NMJ e abbiamo trovato un aumento della distanza di piega giunzionale (d) e della larghezza (w) delle strisce AChR nel muscolo gastrocnemio dei mutanti (358,3 nm ± 11,97 nm e 320,8 nm ± 10,90 nm per la distanza e 216,9 nm ± 10,51 nm e 186,3 nm ± 7,015 nm per la larghezza, in ColQ Dex2 / Dex2 rispetto ai topi wild-type, rispettivamente, p < 0,05) (Figura 4C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig01.jpg"> Figura 1: Diagramma di flusso del protocollo video per la caratterizzazione 3D multiscala NMJ mediante microscopia confocale e STED. I muscoli tibiale anteriore (TA) e gastrocnemio (GA) sono stati raccolti dai topi e le fibre muscolari sono state prese in giro prima della marcatura con α-bungarotoxin-F488 o α-bungarotoxin-F633, DAPI, anticorpi primari diretti contro il neurofilamento M (NF-M) e la glicoproteina della vescicola sinaptica 2 (SV2) e anticorpi secondari coniugati con fluoroforo (F488 o F594). Le pile di immagini sono state acquisite mediante microscopia confocale ed elaborate per misurare il volume NMJ postsinaptico, l'accumulo presinaptico di NF-M, l'occupazione terminale degli assoni NMJ, l'area della piastra terminale della proiezione della massima intensità postsinaptica (MIP) e la tortuosità (d Obj (AB) è la distanza tra A e B lungo il perimetro dell'oggetto (linea rossa), mentre dEuc (AB) è la distanza euclidea tra A e B (linea verde)). Per l'analisi al microscopio STED, la larghezza delle strisce del recettore dell'acetilcolina (AChR) e la distanza tra le pieghe giunzionali sono state quantificate dai profili di intensità della colorazione α-BTX-F633. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig02.jpg"> Figura 2: Caratterizzazione multiparametrica della NMJ postsinaptica in modelli murini di atrofia muscolare spinale (SMA) e sindrome miastenica congenita (CMS) correlata a ColQ. (A) Immagini rappresentative di endplate motorie postsinaptiche da muscoli TA e GA marcate con α-bungarotoxin-F488 (α-BTX). (B) Quantificazione del volume della placca terminale postsinaptica NMJ, (C) area di proiezione di intensità massima (MIP) e (D) tortuosità relativa in TA di topi wild-type (WT) e Smn2B/- di 3 settimane (grafici a sinistra, N = 3 animali per genotipo, n = 37 e n = 56 NMJ, rispettivamente) e 6 WT e ColQ Dex2/Dex2 di 6 settimane di età topi (grafici a destra, N = 5 topi per genotipo, n = 89 e n = 97 NMJ, rispettivamente). I dati sono espressi come media per topo (punto) ± SEM. Le differenze tra i gruppi sono state analizzate mediante test di Mann-Whitney (* p < 0,05). La barra della scala è di 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig03.jpg"> Figura 3: Analisi morfometrica della distribuzione terminale degli assoni presinaptici nei muscoli di topi WT e mutanti. Modello di innervazione NMJ nei muscoli tibiale anteriore (TA) e gastrocnemio (GA) di topi CMS wild-type, SMA e ColQ-correlati. (A, B) Giunzioni neuromuscolari rappresentative da TA di topi WT e Smn2B/- a 21 giorni di età marcati con anticorpi contro il neurofilamento M (NF-M, rosso) e α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, verde) (A), e risultati dell'analisi quantitativa dell'accumulo di neurofilamenti (B); (C, D) Giunzioni neuromuscolari rappresentative da GA di topi WT e ColQ Dex2/Dex2 di 6 settimane marcati con anticorpi contro il neurofilamento M (NF-M, rosso) e α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, verde), che mostrano placche terminali postsinaptiche frammentate e immature (C) e risultati di accumulo di neurofilamenti nei due gruppi di animali (D). N = 4 (n = 34 NMJs) (B) e N = 3 (n = 54 NMJs) (D) WT animali e N=3 (n = 36 NMJs) Smn2B/- e N = 3 (n = 55 NMJs) ColQDex2/Dex2 topi sono stati analizzati negli esperimenti (B, D). (E, F) Immagini rappresentative dell'occupazione terminale degli assoni nelle NMJ da TA di topi WT e Smn2B/- di 3 settimane marcati con anticorpi contro la glicoproteina 2 della vescicola sinaptica (SV2, rosso) e la α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, verde) (E) e risultati dell'occupazione NMJ (rapporto volume SV2/AChR) (F). Sono stati analizzati muscoli di N = 3 (n = 50 NMJ) wild-type e N = 4 (n = 62 NMJ) topi Smn2B / -. I dati sono espressi come valore medio per topo (punto) ± SEM. Le differenze tra i gruppi sono state analizzate mediante test di Mann-Whitney (* p < 0,05). Le barre della scala sono 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig04.jpg"> Figura 4: Imaging STED delle endplate postsinaptiche NMJ. (A) Immagine STED rappresentativa di un NMJ marcato con α-bungarotoxin-F633 (α-BTX) da gastrocnemio di un topo wild-type di 6 settimane che mostra strisce AChR postgiunzioni (la barra della scala è 5 μm). (B) Maggiore ingrandimento di una regione con strisce AChR (pannello inferiore) utilizzata per generare il profilo di intensità. La larghezza (w) delle strisce AChR e la distanza tra due strisce adiacenti (d) di questa regione sono state quantificate e presentate nel grafico a barre. Rappresentazione schematica della piastra terminale postsinaptica per illustrare la larghezza della banda AChR (w) e la distanza (d). Questi parametri, (C) AChR distanza di banda e (D) larghezza, sono stati misurati nei topi ColQ Dex2 / Dex2 e compagni di cucciolata di controllo a 6 settimane di età. NMJ di 5 WT (totale n = 29 NMJ) e 6 ColQ Dex2/Dex2 (totale n = 43 NMJ) animali sono stati analizzati alla cieca. I dati sono espressi come media per topo (punto) ± SEM. Le differenze statistiche tra i gruppi sono state analizzate utilizzando il test di Mann-Whitney (* p < 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Lancio del software LAS X e dei parametri per le acquisizioni confocali. Le varie fasi per acquisire immagini confocali sono descritte nelle sezioni da 3.1.2 a 3.1.7 del protocollo. Per ogni acquisizione di stack NMJ, viene aperto un progetto (passo 3.1.4) e vengono selezionati i parametri di dimensione dell'immagine, velocità di acquisizione, assi X, Y e Z (passo 3.1.7), con ogni scansione sequenziale indicata (Seq.1, laser 405 per DAPI; Seq.2, laser 488 per α-BTX-F488; e Seq.3, laser 552 per anticorpi secondari coniugati F594). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare 2: Lancio del software LAS X e dei parametri per le acquisizioni STED. I passaggi per acquisire le immagini STED sono descritti nelle sezioni da 3.2.2 a 3.2.8 del protocollo. Il microscopio viene avviato in modalità di configurazione STED ON (passo 3.2.2) e viene aperto un progetto (passo 3.2.3). I parametri per l'acquisizione delle immagini (passo 3.2.7) (dimensione dell'immagine, velocità di acquisizione, fattore di zoom, asse X), con ogni scansione sequenziale sono indicati (Seq.1 per α-BTX-F633; Seq.2 per anticorpi secondari coniugati F488). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%202.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura 3: Immagini di pieghe giunzionali colorate con α-BTX ottenute mediante microscopia STED. Esempi di immagini di una piastra terminale postsinaptica etichettata con α-BTX-F633 da un mouse wild-type di 6 settimane che sono stati acquisiti con una messa a fuoco corretta (a sinistra) o errata (a destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%203.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura 4 supplementare: popup di Windows per descrivere i dati di input e output ottenuti dalle macro ImageJ personalizzate. Esempi di dati di input (file .tif e .lif) di immagini NMJ sono mostrati nella colonna di sinistra. I dati di output delle macro (colonna di destra) vengono salvati in cartelle (Save_Volume, Save_Accu) che contengono immagini della giunzione (.tif) e schede tecniche contenenti i risultati (file .csv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%204.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura 5 supplementare: Analisi della distanza e della larghezza dello stripe AChR da un'acquisizione STED utilizzando il software LAS X. I passaggi per analizzare le immagini STED NMJ sono descritti nella sezione 5 del protocollo. A) Immagine di una regione marcata della placca terminale postsinaptica contenente strisce AChR. La regione di interesse per l'analisi delle strisce viene selezionata disegnando una linea perpendicolare (linea verde, per la distanza della striscia) o un rettangolo perpendicolare (rettangolo viola, per la larghezza della striscia). (B, C) Vengono mostrati i profili di intensità delle regioni selezionate e le misurazioni per calcolare la distanza tra le strisce AChR (B) e la larghezza della banda AChR (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%205.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File di codifica supplementare 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. Macro personalizzata ImageJ per estrarre le misure dei parametri NMJ (volume NMJ, area endplate MIP e tortuosità NMJ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File di codifica supplementare 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. ImageJ macro personalizzata per estrarre l'accumulo NF-M e la colorazione SV2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Questo protocollo descrive un metodo per l'analisi morfometrica delle giunzioni neuromuscolari mediante microscopia combinata confocale e STED che viene utilizzata per quantificare i cambiamenti patologici in modelli murini di SMA e CMS correlati a ColQ.

Caratterizzazione delle giunzioni neuromuscolari nei topi mediante microscopia combinata confocale e super-risoluzione

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Questo protocollo aiuta ad analizzare quantitativamente la struttura 3D delle giunzioni neuromuscolari con una risoluzione vicina alla microscopia elettronica utilizzando una semplice procedura. Il vantaggio principale di questo protocollo è che i campioni muscolari vengono elaborati in modo simile e immunomarcati per la microscopia confocale e STED, riducendo il tempo per un'accurata valutazione della struttura della giunzione neuromuscolare nei modelli animali. La quantificazione morfologica che abbiamo sviluppato può essere facilmente adattata per analizzare altre strutture subcellulari.Ho il piacere di presentarvi la dottoressa Martina Marinello, una scienziata del mio team che mostrerà come vengono eseguite le prese in giro muscolari e le immunocolorazioni e darà alcune raccomandazioni per l'applicazione di successo di questo protocollo. Sono lieto di presentare il Dr.Jeremie Cosette della piattaforma di imaging di Genethon che mostrerà l'acquisizione e l'analisi delle immagini utilizzando microscopi confocali e STED. Dopo l'eutanasia, iniziare a stuzzicare i muscoli tibiali anteriori in piccoli fasci di fibre larghi circa un millimetro usando due pinze seghettate sottili.Quindi, trasferire questi fasci muscolari in una piastra a 24 pozzetti contenente 1% Triton X-100 preparato in PBS e lasciarlo agitare delicatamente per un'ora a temperatura ambiente o cinque ore a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato i campioni tre volte per cinque minuti con PBS a temperatura ambiente, incubare i campioni con una soluzione bloccante composta da 4% BSA preparata in PBS con 1% Triton X-100 per quattro ore a quattro gradi Celsius sotto delicata agitazione. Quindi, incubare i campioni durante la notte con la stessa soluzione bloccante contenente anticorpi monoclonali primari contro il neurofilamento M o la glicoproteina 2 della vescicola sinaptica per marcare rispettivamente i terminali degli assoni presinaptici o le zone attive.Il giorno seguente, lavare i fasci muscolari etichettati tre volte per cinque minuti con PBS sotto delicata agitazione. Quindi, incubarli con anticorpi secondari appropriati mettendoli su uno shaker per due ore a temperatura ambiente. Dopo aver lavato nuovamente i fasci muscolari, posizionarli su un vetrino con mezzo di montaggio.Quindi, posizionare una linguetta di copertura in vetro di grado 1,5 sulla parte superiore, seguita da magneti cilindrici su entrambi i lati della diapositiva per applicare pressione e appiattire i muscoli. Per acquisire immagini utilizzando il microscopio confocale, avviare il software del microscopio e scegliere la macchina come modalità di configurazione e raccogliere pile di immagini delle giunzioni neuromuscolari in ciascun gruppo sperimentale secondo le impostazioni menzionate nel manoscritto di testo. Al termine della sessione, cliccare su Apri in visualizzatore 3D e scegliere una giunzione neuromuscolare rappresentativa di un gruppo sperimentale per visualizzare l'etichettatura 3D.Per calcolare la giunzione neuromuscolare post-sinaptica e il volume della piastra, l'area di proiezione della massima intensità e la tortuosità relativa, trascinare e rilasciare la macro per la quantificazione del volume della giunzione neuromuscolare nella finestra Immagine J e, quando la macro si apre in una seconda finestra, fare clic su Macro ed esegui macro. Selezionare la cartella nativa contenente le sottocartelle di giunzione da analizzare e cliccare su Seleziona. Quindi, nel menu a comparsa della cartella di salvataggio, selezionare la cartella di archiviazione e fare clic su Seleziona.Nel nuovo menu a comparsa chiamato Tipo immagine, seleziona il formato delle acquisizioni dello stack Z. Selezionare il canale RGB corrispondente alla colorazione di interesse e indicare X, dimensione pixel Y e passo Z. Se sono selezionati formati di file proprietari, la macro legge direttamente la dimensione dei pixel e il passo Z.Per quantificare l'accumulo di neurofilamenti presinaptici, trascinare e rilasciare la macro per la quantificazione dell'accumulo della giunzione neuromuscolare nella finestra Immagine J e fare clic su Macro e Esegui macro. Selezionare le sottocartelle di giunzione, la cartella di archiviazione e il formato delle acquisizioni dello stack Z, come illustrato in precedenza. Quindi, nel popup Informazioni sulla colorazione, indica l'etichetta e il colore pre-sinaptico e post-sinaptico e fai clic su OK.In popup Dimensione pixel, indica la dimensione X, Y pixel come 0,072 micrometri, il passo Z come 0,5 micrometri e fai clic su OK. Se sono selezionati formati di file proprietari, la macro legge direttamente la dimensione dei pixel e il passo Z.Per calcolare la distanza tra le strisce del recettore dell'acetilcolina, selezionare il menu Quantifica nella parte superiore della finestra centrale. Fare clic sulla scheda Strumenti, selezionare l'intensità e fare clic sull'icona del profilo della linea. Imposta Oversampling su uno e seleziona Ordina canali.Fare clic sulla scheda Apri progetti e selezionare l'immagine filtrata da analizzare. Quindi, fai clic sull'icona della linea di disegno e traccia una linea che attraversa perpendicolarmente diverse strisce o pieghe giunzionali. Fare clic sulla parte superiore del primo picco e spostare il puntatore del mouse mentre si preme il pulsante sinistro del mouse fino a raggiungere il picco massimo successivo.Notate il valore DX, che corrisponde alla distanza tra i due picchi. Fare clic con il pulsante destro del mouse mentre si è nell'immagine della finestra di destra e selezionare Salva ROI. Dopo aver fatto clic sull'icona della freccia, fai clic sul ROI ed eliminalo facendo clic sull'icona del cestino.Per calcolare la larghezza della striscia del recettore dell'acetilcolina, selezionare l'intensità nel pannello in alto a sinistra sotto la scheda strumenti, fare clic sull'icona determina FWHM e selezionare i canali di ordinamento. Clicca quindi sulla scheda Apri Progetti e seleziona l'immagine filtrata da analizzare. Quindi, fai clic sull'icona del rettangolo di disegno nel menu in alto della finestra di destra.Selezionare una striscia orizzontale o verticale e disegnare un rettangolo perpendicolarmente alla striscia. Nella finestra centrale viene visualizzato un profilo. Fare clic su verticale o orizzontale del menu Proiezione media situato nel pannello di sinistra, a seconda che l'orientamento della striscia sia verticale o orizzontale.Fare clic su Statistiche nella finestra centrale per leggere il valore FWHM e quindi salvare ed eliminare i ROI come dimostrato in precedenza. La piastra terminale del motore post-sinaptico, marcata con alfa-bungarotoxina fluorescente, appariva più piccola e frammentata nei mutanti di due linee di topo. La quantificazione delle pile Z della giunzione neuromuscolare utilizzando le macro personalizzate Image J ha rivelato una marcata diminuzione del volume della piastra terminale, della proiezione di massima intensità e della tortuosità relativa in entrambi i modelli murini di malattia rispetto ai controlli, indicando difetti di maturazione della giunzione neuromuscolare.La quantificazione della distribuzione del ramo terminale dell'assone presinaptico utilizzando la macro personalizzata Image J ha rivelato un modello alterato nella distribuzione del neurofilamento M nei due modelli animali con un aumento dell'immunomarcatura. Attraverso la colorazione della glicoproteina 2 della vescicola sinaptica, è stata osservata una riduzione del 43% del rapporto di occupazione delle regioni contenenti il recettore dell'acetilcolina con zone attive adiacenti del terminale nervoso nei topi Smn 2B. L'aspetto delle piastre terminali postsinaptiche della giunzione neuromuscolare è stato chiaramente visualizzato mediante marcatura fluorescente di alfa-bungarotoxin e analisi del profilo di intensità.La valutazione dei parametri della giunzione neuromuscolare ha rivelato un aumento della distanza della piega giunzionale e della larghezza delle strisce del recettore dell'acetilcolina nel muscolo gastrocnemio dei mutanti. Per ottenere risultati affidabili, è fondamentale stuzzicare correttamente i muscoli, prestando particolare attenzione alla forza applicata per separare i fasci muscolari. Questo protocollo può aiutare a ottenere una caratterizzazione morfologica più approfondita della giunzione neuromuscolare, che in precedenza era spiegata solo da procedure complesse e dispendiose in termini di tempo, come la microscopia elettronica a trasmissione.La procedura di imaging STED ha aperto la strada allo studio di nuove intuizioni riguardanti i marcatori pre e post-sinaptici, che contribuiscono alla fisiopatologia delle malattie che colpiscono la giunzione neuromuscolare.

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