Name: characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy
Uploaded: 2021-12-08T13:00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Genethonの「イメージングおよびサイトメトリーコアファシリティ」と、イルドフランス地域、コンセイユジェネラルドレソンヌ、エブリーのジェノポールルシェルシュ、エブリーヴァルデソンヌ大学、フランスのINSERMからの機器資金によって部分的にサポートされている組織学サービスに感謝します。また、Smn 2B/2Bマウスラインを提供してくださったRashmi Kothary博士(カナダ、オタワ大学)とColQDex2/+マウスラインを提供してくださったEric Krejci博士(未発表、パリ大学、フランス)にも感謝しています。統計分析におけるギヨーム・コレの支援に感謝します。2H3(Jessel, T.M.およびDodd, J.によって開発された)およびSV2(Buckley, K.M.によって開発された)モノクローナル抗体は、NIHのNICHDによって作成され、アイオワ大学生物学部、アイオワシティ、IA 52242で維持されているDevelopmental Studies Hybridoma Bank(DSHB)から入手した。この研究は、フランセーズ・コントレ・レ・ミオパシー協会(AFM-Telethon)、INSERM、エヴリー・ヴァル・デソンヌ大学の支援を受けました。

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著者は、この作業に関連する利益相反を宣言しません。

記載されたビデオプロトコルは、シナプス前およびシナプス後レベルで病理学的変化を特徴付けるために使用できる共焦点顕微鏡およびSTED顕微鏡を組み合わせることによって、神経筋接合部の3D構造を定量化する詳細な方法を提供する。高解像度のSTED顕微鏡により、従来の共焦点イメージングでは識別できないナノ構造の視覚化と形態測定分析が可能になります。この手順により、SMAおよびColQ関連のCMSマウスの2つの虫垂筋( 前脛骨筋 と 腓腹筋)におけるNMJの構造変化を測定することができました。
この技術で信頼できる結果を得るには、筋肉を取り巻く筋膜と筋肉束を分離するための適用された強度に特に注意を払いながら、筋肉を適切に解剖していじめることが重要です。そうしないと、神経支配パターンが混乱し、シナプス前NMJの適切な評価が妨げられる可能性があります。TAおよびGAからのNMJを分析するための詳細な情報が提供されていますが、原則として、このプロトコルは、横隔膜や 腹横筋37など、からかいステップを必要としない扁平筋を含む他の筋肉に適応させることができます。組織固定は、高品質の染色を確実にするためにも重要です。したがって、適切な量(筋肉の15〜20倍)で高品質のPFAを使用することをお勧めします。さらに、固定液への暴露時間は、収縮や凝集などのアーチファクトが過剰固定によって現れ、NMJ機能に影響を与える可能性があるため、重要なステップです。サンプルのサイズと組織38へのパラホルムアルデヒド溶液の浸透速度を考えると、このタイプの筋肉には18〜24時間の固定時間が推奨されます。組織採取後1週間以上染色工程が計画されている場合は、細菌の増殖を防ぐために、アジ化ナトリウムを添加したPBS中のPFA固定筋肉を4°Cに保つことをお勧めします。
このプロトコルは、共焦点にα-BTX-F488を使用し、STEDイメージングにα-BTX-F633を使用するアプローチを提示します。これらの蛍光色素は、記載された実験デザインに適合するように選択されましたが、利用可能な機器や材料に応じて変更することができます。たとえば、画像の取得と定量にSTED CW 592 nmレーザーを使用する場合、α-BTX F488標識を選択できます。しかし、本研究で適用された構成(パルス励起ゲートSTED、775nmの枯渇)は、連続波STED39などの他のアプローチよりも高い性能と優れた分解能を示し、現在のアプリケーションにより適しているようです。また、特にSTED(励起と空乏の両方)の場合、強度プロファイルの特性は飽和状態の場合には測定できず、NMJ画像内の飽和信号は分析全体を危険にさらす可能性があるため、レーザー出力設定を慎重に選択することも重要です。
顕微鏡ソフトウェアとImageJマクロを使用した画像取得と分析を含むこの詳細なワークフローは、単一の筋肉からの共焦点およびSTED顕微鏡による自律的なNMJ形態測定分析を容易にするために開発されました。NMJモルフ2 やNMJアナライザー14など、NMJ共焦点分析のワークフローは、NMJの形態素解析と比較研究を容易にする半自動法の設計への道を開いた。NMJ-morph(およびその更新版aNMJ-morph15)は、最大強度投影を使用して21の形態学的特徴を測定する無料のImageJベースのプラットフォームであり、NMJ-Analyzerは、3D NMJ構造全体から29の関連パラメータを生成するPythonで開発されたスクリプトを使用します。手動閾値は、ユーザー分析を必要とするこれら2つの方法の画像処理中の唯一のステップです。この統合プロトコルは、組織調製、3D共焦点画像取得、および骨格筋全体からのNMJのImageJベースの処理の手順を詳述し、シナプス後(体積、最大投影面積、および曲がり角)およびシナプス前(軸索終末占有率およびニューロフィラメント蓄積)エンドプレートの5つの重要なパラメーターの簡単な概要を提供します。生物学的関連性の追加パラメータであるシナプス後接合襞のAChR組織パターンは、超解像STED顕微鏡(分解能20-30 nm)によるナノスケールレベルでの形態測定分析のために組み込まれました40。興味深いことに、STEDイメージングのための組織調製は、従来の透過型電子顕微鏡(TEM)9などのNMJ微細構造研究に使用される他の方法よりも単純であり、適切な筋肉領域の超薄切片を得るために熟練したマニピュレータを必要とするかなり複雑で時間のかかる手順です。さらに、STED関連ソフトウェアを使用して、複数の接合折り目からの定量データを自動的に取得できます。
このプロトコルは、SMNおよびColQ欠損筋における以前に知られているNMJの欠陥を説明するために適用されました20、36、41、42。共焦点顕微鏡検査によって、シナプス後終板体積、MIP面積、相対的な屈曲率の減少、ニューロフィラメント蓄積の増加など、2つのマウスモデルに共通の変化が見られましたが、いくつかのより具体的な所見(NMJ占有率の低下)は、小胞輸送障害の指標としてSMAマウスでのみ観察されました36。最後に、TEM20で以前に観察されたように、シナプス後接合襞の超微細構造欠陥の兆候であるSTED分析によってColQ-KOでAChRストライプの距離と幅の増加が検出されました。重要なことに、このプロトコルは、発生中、維持中、およびさまざまな病理学的条件下での神経筋接合部のより詳細な形態学的特徴付けに役立つ可能性があります。

神経筋接合部(NMJ)は、運動軸索終末、シナプス周囲シュワン細胞、骨格筋線維部分からなる複雑な構造であり、化学情報の伝達と運動ニューロン活動の低下と筋肉収縮の結合に関与しています。哺乳類では、神経筋接合部の形態は発生中に変化し、成熟後に典型的なプレッツェルのような形状を採用し、種間で形状と複雑さに違いがあり、運動や老化などの生理学的プロセスに応じてある程度の可塑性を示します1,2,3,4 .シナプス後運動終板は、接合襞と呼ばれる膜陥入を形成し、アセチルコリン受容体(AChR)を含む上部がシナプス前末端軸索枝5と密接に接触している。
神経筋接合部の形態学的および機能的変化は、脊髄性筋萎縮症(SMA)および筋萎縮性側索硬化症(ALS)、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、先天性筋無力症候群(CMS)、重症筋無力症(MG)および中心核ミオパチー(CNM)、および加齢関連サルコペニアなどのいくつかの神経変性疾患の病態生理に寄与します3,6,7,8,9、10、11、12。これらの疾患では、エンドプレートの断片化、シナプス後接合襞サイズの減少、および/または除神経などのNMJ構造変化が観察されます。NMJの病理は、疾患進行中の一次的または初期のイベントであるか、臨床症状に寄与する二次的なイベントとしてより最近現れる可能性があります。いずれにせよ、これらの疾患の動物モデルにおけるNMJの形態をモニタリングすることは、病理学的変化を研究し、潜在的な治療の有効性を評価するための貴重なパラメータを表しています。
神経筋接合部の形態は、通常、共焦点顕微鏡2,13,14,15または電子顕微鏡5,16を使用する技術によって分析され、分解能や技術的困難などの固有の制限があります。最近では、電子顕微鏡による超微細構造解析の代替的または補完的なアプローチとして、シナプス前活性ゾーンやシナプス後膜上のAChR分布など、NMJの特定の領域を視覚化するために超解像顕微鏡法も使用されました16,17,18。
このプロトコルは、蛍光共焦点顕微鏡と誘導放出枯渇(STED)顕微鏡を組み合わせることにより、NMJ形態学的パラメータを評価するための詳細で再現性のある方法を提供することを目的としています。マウス腓腹筋および前脛骨筋の神経支配されたからかい筋線維における体積、面積、相対的屈曲率、AChRストライプ幅、軸索終末分布などのシナプス前およびシナプス後エンドプレートの重要な特徴は、正常および罹患状態の状況で定量化されました。特に、先天性筋無力症候群のモデルとして、SMN1遺伝子の変異によって引き起こされる運動ニューロン変性を伴う神経筋疾患である脊髄性筋萎縮症のSmn2B/-マウスモデル11,19、および不斉アセチルコリンエステラーゼノックアウト(ColQ Dex2/Dex2またはColQ-KO)マウスのコラーゲン様尾部サブユニットにおいて、NMJ欠損が例示されました20。21,22。

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			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 &#945;-bungarotoxin (F488-a-BTX)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>B13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATTO-633 &#945;-bungarotoxin (F633-a-BTX)</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-100-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS</td>
			<td>Gibco, Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol Absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion Oil, n = 1.518</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>MOIL-10LF&#160;</td>
			<td>Low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurofilament (NF-M) antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_531793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.04005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_2315387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alnico Button cylindrical magnets</td>
			<td>Farnell France</td>
			<td>E822</td>
			<td>diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >63x 1.4 NA magnitude oil immersion&#160; HCX Plan Apo CS objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Curved thin forceps-Moria iris forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra thin scissors - Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15-003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel loading tip round 1-200 &#181;L</td>
			<td>COSTAR</td>
			<td>4853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue&#160;</td>
			<td>Whatman (GE Healthcare)</td>
			<td>2105-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170&#177;5 &#181;m</td>
			<td>Marienfield</td>
			<td>107222</td>
			<td>High precision</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (12-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (24-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safeshield scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.40.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost plus slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GraphPad&#160;</td>
			<td>Prism, San Diego (US)</td>
			<td>Release N&#176;6.07</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Release N&#176; 1.53f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Release N&#176;3.7.2.2283</td>
			<td >Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy

神経筋接合部(NMJ)は、下位運動ニューロンと骨格筋線維の間の高度に特殊化されたシナプスであり、神経系から随意筋への分子の伝達に不可欠な役割を果たし、収縮につながります。それらは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、先天性筋無力症候群(CMS)、脊髄性筋萎縮症(SMA)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの遺伝性神経筋障害を含む多くの人間の病気に罹患しています。したがって、疾患モデルマウスにおける神経筋接合部の形態とその変化を監視することは、病理学的研究および治療アプローチの前臨床評価のための貴重なツールとなります。ここでは、マウスからかわれた筋線維から運動エンドプレートのシナプス前およびシナプス後の部分の3次元(3D)形態を標識および解析する方法について説明する。共焦点イメージングによるNMJの体積、面積、曲がり角、軸索終末の形態/占有率、および超解像誘導放出枯渇(STED)顕微鏡によるシナプス後接合襞とアセチルコリン受容体(AChR)の縞幅間の距離をサンプルを準備して測定する手順を詳しく説明します。これらのNMJパラメータの変化は、SMAおよびCMSの影響を受けた変異マウスにおいて例示される。

シナプス前およびシナプス後レベルでの神経筋接合部の形態学的解析を再現可能な方法で容易にするために、筋肉の収穫から顕微鏡ソフトウェアとImageJカスタムマクロを使用したイメージングおよび定量化までのワークフローが開発されました(図1)。このプロトコルの有用性を例示するために、脊髄性筋萎縮症(SMA)および先天性筋萎縮症候群(CMS)形態にそれぞれ影響を受けた遺伝性疾患の2つのマウスモデル、Smn2B /-およびColQ Dex2 / Dex2マウスにおけるNMJの形態を評価し、データを年齢を一致させた対照同腹仔と比較した。
NMJ構造は、3週齢および6週齢のSmn2B/-(C57Bl/6バックグラウンド)およびColQ Dex2/Dex2(B6D2F1/Jバックグラウンド)マウスの前脛骨筋および腓腹筋から、これらの動物に疾患の兆候がすでに存在する場合に評価されました。3週齢で、Smn2B /-マウスは、NMJ萎縮や喪失などの骨格筋の発達と除神経の遅延の兆候を示します35,36。CMSマウスは、NMJsにおいて主要な病理を有し、生後1週目からの体重の減少および顕著な筋力低下20を示す(データは示さず)。図2Aに示すように、蛍光α-ブンガロトキシンで標識されたシナプス後運動終板は、共焦点顕微鏡検査によって2つのマウス系統の変異体でより小さく、および/または断片化して見えました。このカスタマイズされたImageJマクロを使用してNMJ Zスタックを定量化すると、NMJ成熟欠陥の兆候として、コントロールと比較して、SMAマウスとCMSマウスの両方でエンドプレート体積、最大強度投影(MIP)、および相対的な曲がりくねりの顕著な減少が明らかになりました32(図2B-D)。シナプス後終板体積とMIPは、罹患動物で減少しました(Smn2B /-およびColQ Dex2 / Dex2マウスでは、体積でそれぞれ2.7および2.0、MIPで2.5および2.0の倍増変化)。相対的な屈曲も、SMNおよびColQ欠損筋ではWTよりも小さかった(SMAで16.97%±1.33%対5.90%WTマウス±48.84%、CMSで13.29%±2.79%対対照マウス±30.20%4.44%)。さらに、ImageJカスタムマクロを使用してシナプス前軸索末端枝の分布を定量化したところ、2つの動物モデルでニューロフィラメントM分布のパターンが変化し、免疫標識が増加していることが明らかになりました(対照と比較して、Smn2B/-マウス±それぞれ2.03%±84.65%0.32%対16.57%、23.64%±2.78%対18.77%±1.73%)(図3A-D).SV2染色により、占有率の43%の減少、すなわち隣接する神経終末活動ゾーンを有するAChR含有領域の割合もSmn2B/-マウスで観察された(SMAで49.36%±3.76%対2.34%WTマウスで85.69%±2.34%)(図3E、F)。このNMJパラメータは、ColQ Dex2/Dex2変異体のGAでも計算されましたが、対照の同腹仔と比較して統計的に有意な差は見られませんでした(データは示されていません)。
さらに、超解像誘導放出枯渇(STED)顕微鏡を用いて、ColQ欠損筋における接合襞間の距離と、その襞の頂部に位置するAChRストライプの幅を定量化することにより、シナプス後膜の特徴を解析しました。図4に示すように、これらの構造の様相は、蛍光α-ブンガロトキシン標識および強度プロファイル解析によって明確に可視化することができる。これらのNMJパラメータを評価し、野生型マウスと比較して、変異体の腓腹筋におけるAChRストライプの接合襞距離(d)と幅(11.97 nm±±320.8 nm、幅10.90 nm±216.9 nm、幅186.3 nm、幅±7.015 nm)の増加を見出した。 それぞれ、p < 0.05)(図4C、D)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig01.jpg"> 図1:共焦点顕微鏡およびSTED顕微鏡による3DマルチスケールNMJ特性評価のためのビデオプロトコルのフローチャート。 前脛骨筋(TA)および腓腹筋(GA)をマウスから採取し、筋線維をからかってから、α-ブンガロトキシン-F488またはα-ブンガロトキシン-F633、DAPI、ニューロフィラメントM(NF-M)およびシナプス小胞糖タンパク質2(SV2)に対する一次抗体、およびフルオロフォア(F488またはF594)結合二次抗体で標識しました。画像スタックを共焦点顕微鏡で取得し、シナプス後NMJ体積、シナプス前NF-M蓄積、NMJ軸索終末占有率、シナプス後最大強度投影(MIP)エンドプレート面積、および曲がり角を測定するために処理しました(d Obj(AB)は物体の周囲に沿ったAとBの間の距離(赤い線)ですが、dEuc(AB) はAとBの間のユークリッド距離(緑の線)です)。STED顕微鏡分析では、アセチルコリン受容体(AChR)ストライプの幅と接合部のひだ間の距離をα-BTX-F633染色の強度プロファイルから定量化しました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig02.jpg"> 図2:脊髄性筋萎縮症(SMA)およびColQ関連先天性筋萎縮症候群(CMS)のマウスモデルにおけるマルチパラメーターシナプス後NMJの特性評価。 (A)α-ブンガロトキシン-F488(α-BTX)で標識されたTAおよびGA筋のシナプス後運動エンドプレートの代表的な画像。(B)NMJシナプス後終板体積の定量化、(C)最大強度投影(MIP)面積、および(D)3週齢の野生型(WT)およびSmn2B /-マウス(左のグラフ、遺伝子型ごとにN = 3匹の動物、それぞれn = 37およびn = 56 NMJ)および6週齢のWTおよびColQ Dex2 / Dex2のTAにおける相対的な曲がり角マウス(右のグラフ、遺伝子型あたりN=5匹のマウス、それぞれn=89およびn=97NMJ)。データは、SEM±マウス当たりの平均(dot)として表す。 群間の差は、マン・ホイットニー検定により解析した(*p<0.05)。スケールバーは10μmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig03.jpg"> 図3:WTおよび変異マウスの筋肉におけるシナプス前軸索終末分布の形態測定解析。野生型、SMAおよびColQ関連CMSマウスの前脛骨筋(TA)および腓腹筋(GA)におけるNMJ神経支配パターン。(A、B)ニューロフィラメントM(NF-M、赤)およびα-ブンガロトキシン-F488(α-BTX、緑)に対する抗体で標識された21日齢のWTおよびSmn2B /-マウスのTAからの代表的な神経筋接合部(A)、およびニューロフィラメント蓄積の定量分析の結果(B);(C, D)ニューロフィラメントM(NF-M、赤)およびα-ブンガロトキシン-F488(α-BTX、緑)に対する抗体で標識された6週齢WTおよびColQ Dex2/Dex2マウスのGAからの代表的な神経筋接合部、断片化された未熟なシナプス後エンドプレート(C)、および2群の動物におけるニューロフィラメント蓄積の結果(D)。N=4(n = 34NMJs)(B)およびN = 3(n = 54NMJs)(D)WT動物、ならびにN=3(n = 36NMJs)Smn2B/-およびN = 3(n = 55NMJs)ColQ Dex2/Dex2マウスを実験(B、D)で分析した。(E, F)シナプス小胞糖タンパク質2(SV2、赤)およびα-ブンガロトキシン-F488(α-BTX、緑)に対する抗体で標識した3週齢のWTおよびSmn2B/-マウスのTA由来のNMJにおける軸索終末占有率の代表的な画像(E)、およびNMJ占有率(SV2/AChR体積比)の結果(F)。野生型のN = 3(n = 50 NMJs)およびN = 4(n = 62 NMJs)Smn2B/-マウスの筋肉を分析した。データはSEM±マウス当たりの平均値(dot)で表す。 群間の差はマン・ホイットニー検定により解析した(*p<0.05)。スケールバーは20μmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig04.jpg"> 図4:NMJシナプス後エンドプレートのSTEDイメージング。 (A)接合後AChRストライプを示す6週齢野生型マウスの腓腹筋由来のα-ブンガロトキシン-F633(α-BTX)で標識したNMJの代表的なSTED画像(スケールバーは5μm)。(B)強度プロファイルの生成に使用されたAChRストライプのある領域(下のパネル)の高倍率。AChRストライプの幅(w)とこの領域の2つの隣接するストライプ間の距離(d)を定量化し、棒グラフに表示しました。AChRストライプ幅(w)および距離(d)を説明するためのシナプス後終板の概略図。これらのパラメータ、(C)AChRストライプ距離および(D)幅は、6週齢のColQ Dex2/Dex2マウスおよび対照同腹仔において測定された。5 WT(合計n = 29 NMJ)および6 ColQ Dex2/Dex2(合計n = 43 NMJ)の動物からのNMJを盲目的に分析しました。データは、マウス当たりの平均(ドット)±SEMとして表す。 群間の統計学的差は、マン・ホイットニー検定(*p<0.05)を用いて解析した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:LAS Xソフトウェアと共焦点取得用のパラメータの発売。 共焦点画像を取得するためのさまざまな手順は、プロトコルのセクション3.1.2から3.1.7で説明されています。NMJスタック取得ごとに、プロジェクトが開かれ(ステップ3.1.4)、画像サイズ、取得速度、X、Y、Z軸のパラメータが選択され(ステップ3.1.7)、各シーケンシャルスキャンが示されます(Seq.1、DAPIのレーザー405;シーケンス2、α-BTX-F488用のレーザー488。Seq.3、F594結合二次抗体用のレーザー552)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:LAS XソフトウェアとSTED取得用のパラメータの発売。 STED画像を取得する手順は、プロトコルのセクション3.2.2から3.2.8で説明されています。顕微鏡がコンフィギュレーションモードSTED ONで起動され(ステップ3.2.2)、プロジェクトが開きます(ステップ3.2.3)。各シーケンシャルスキャンで画像取得(ステップ3.2.7)のパラメータ(画像サイズ、取得速度、ズーム係数、X軸)が示されます(α-BTX-F633の場合はSeq.1;F488結合二次抗体についてはSeq.2)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%202.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図3:STED顕微鏡で得られたα-BTX染色された接合部のひだの画像。 正しい焦点(左)または誤った焦点(右)のいずれかで取得された6週齢の野生型マウスからのα-BTX-F633で標識されたシナプス後エンドプレートの画像例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%203.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図 4: カスタム ImageJ マクロによって取得された入力データと出力データを説明する Windows ポップアップ。 NMJ画像の入力データ例(.tifファイルと.lifファイル)を左の列に示します。マクロからの出力データ (右側の列) は、ジャンクション (.tif) のイメージと結果を含むデータシート (.csv ファイル) を含むフォルダー (Save_Volume、Save_Accu) に保存されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%204.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図5:LAS Xソフトウェアを使用したSTED取得からのAChRストライプ距離と幅の解析。 NMJ STED画像を解析する手順は、プロトコルのセクション5で説明されています。 A)AChRストライプを含む標識されたシナプス後エンドプレート領域の画像。ストライプ解析の対象領域は、垂線 (緑の線、ストライプ距離) または垂直な四角形 (紫色の四角形、ストライプ幅) を描画することによって選択されます。(B, C)選択された領域の強度プロファイルおよびAChRストライプ(B)とAChRストライプ幅(C)との間の距離を計算するための測定値が示される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%205.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディング ファイル 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. NMJパラメータ測定値(NMJボリューム、MIPエンドプレート面積、NMJ曲がり角度)を抽出するためのImageJカスタムマクロ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディング ファイル 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal.NF-M蓄積とSV2染色を抽出するためのImageJカスタムマクロ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

このプロトコルは、SMAおよびColQ関連のCMSのマウスモデルの病理学的変化を定量化するために使用される共焦点顕微鏡とSTED顕微鏡の組み合わせによる神経筋接合部の形態測定分析の方法を説明しています。

共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部のキャラクタリゼーション

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

このプロトコルは、簡単な手順で電子顕微鏡に近い分解能で神経筋接合部の3D構造を定量的に分析するのに役立ちます。このプロトコルの主な利点は、筋肉サンプルが同様に処理され、共焦点顕微鏡およびSTED顕微鏡用に免疫標識されるため、動物モデルでの正確な神経筋接合部構造評価の時間が短縮されることです。私たちが開発した形態定量は、他の細胞内構造の解析に容易に適応させることができます。私のチームの科学者であるマルティナ・マリネッロ博士を紹介し、筋肉のからかいと免疫染色がどのように行われるかを示し、このプロトコルの適用を成功させるための推奨事項をいくつか紹介できることを嬉しく思います。Genethonのイメージングプラットフォームからジェレミー・コゼット博士を紹介し、共焦点顕微鏡とSTED顕微鏡を使用した画像の取得と分析を展示します。安楽死後、2つの細かい鋸歯状の鉗子を使用して、幅約1ミリメートルの小さな繊維束で前脛骨筋をからかい始めます。次に、これらの筋肉束をPBSで調製した1%Triton X-100を含む24ウェルプレートに移し、室温で1時間、または摂氏4度で5時間穏やかに攪拌します。室温でPBSでサンプルを3回5分間洗浄した後、穏やかな攪拌下で摂氏4度で4時間、1%Triton X-100を含むPBSで調製した4%BSAからなるブロッキング溶液でサンプルをインキュベートします。次に、ニューロフィラメントMまたはシナプス小胞糖タンパク質2のいずれかに対する一次モノクローナル抗体を含む同じブロッキング溶液でサンプルを一晩インキュベートし、シナプス前軸索末端または活性ゾーンをそれぞれ標識します。翌日、ラベルを付けた筋肉束を穏やかな攪拌下でPBSで5分間3回洗浄します。次に、それらを適切な二次抗体とともに、室温で2時間シェーカーに置いてインキュベートします。筋肉の束をもう一度洗った後、封入剤を入れたスライドの上に置きます。次に、上部に1.5グレードのガラスカバースリップを置き、続いてスライドの両側に円筒形の磁石を置いて圧力をかけ、筋肉を平らにします。共焦点顕微鏡を使用して画像を取得するには、顕微鏡ソフトウェアを起動し、構成モードとしてマシンを選択し、テキスト原稿に記載されている設定に従って、各実験グループの神経筋接合部の画像スタックを収集します。セッションの最後に、[3Dビューアで開く]をクリックし、実験グループを代表する神経筋接合部を選択して、3Dラベリングを視覚化します。シナプス後神経筋接合部とプレートの体積、最大強度投影面積、および相対的な曲がり角を計算するには、神経筋接合部の体積を定量化するためのマクロを画像Jウィンドウにドラッグアンドドロップし、マクロが2番目のウィンドウで開いたら、[マクロ]と[マクロの実行]をクリックします。分析するジャンクション サブフォルダーを含むネイティブ フォルダーを選択し、[選択] をクリックします。次に、保存フォルダのポップアップメニューで、ストレージフォルダを選択し、[選択]をクリックします。「画像タイプ」という新しいポップアップメニューで、Z スタック取得のフォーマットを選択します。目的の染色に対応するRGBチャンネルを選択し、X、Yピクセルサイズ、Zステップを示します。独自のファイル形式が選択されている場合、マクロはピクセルサイズとZステップを直接読み取ります。シナプス前神経フィラメントの蓄積を定量化するには、神経筋接合部の蓄積を定量化するためのマクロを画像Jウィンドウにドラッグアンドドロップし、[マクロ]と[マクロの実行]をクリックします。ジャンクション サブフォルダー、ストレージ フォルダー、および前述のように Z スタック取得の形式を選択します。次に、染色情報ポップアップで、シナプス前およびシナプス後のラベルと色を指定し、[ピクセルサイズ]ポップアップ OK.In をクリックして、X、Yピクセルサイズを0.072マイクロメートル、Zステップを0.5マイクロメートルとして示し、[OK]をクリックします。独自のファイル形式が選択されている場合、マクロはピクセルサイズとZステップを直接読み取ります。アセチルコリン受容体ストライプ間の距離を計算するには、中央ウィンドウの上部にある定量メニューを選択します。[ツール]タブをクリックし、強度を選択して、ラインプロファイルアイコンをクリックします。[オーバーサンプリング] を 1 に設定し、[チャネルの並べ替え] にチェックマークを付けます。[プロジェクトを開く]タブをクリックし、分析するフィルタリングされた画像を選択します。次に、描画ラインアイコンをクリックして、複数のストライプまたはジャンクションフォールドを垂直に交差するラインをトレースします。最初のピークの上部をクリックし、マウスの左ボタンを押しながらマウスポインタを動かし、次の最大ピークに達するまで移動します。2 つのピーク間の距離に対応する DX 値に注意してください。右側のウィンドウの画像でマウスを右クリックし、[ROIの保存]を選択します。矢印アイコンをクリックした後、ROIをクリックし、ビンアイコンをクリックして削除します。アセチルコリン受容体ストライプの幅を計算するには、左上のパネルの[ツール]タブで強度を選択し、[FWHMの決定]アイコンをクリックして、ソートチャネルにチェックマークを付けます。次に、[プロジェクトを開く]タブをクリックし、分析するフィルタリングされた画像を選択します。次に、右側のウィンドウのトップメニューにある長方形の描画アイコンをクリックします。水平または垂直のストライプを選択し、ストライプに対して垂直に長方形を描画します。中央のウィンドウにプロファイルが表示されます。左側のパネルにある[平均投影]メニューの垂直または水平のいずれかをクリックし、ストライプの向きが垂直か水平かによって異なります。中央のウィンドウの統計をクリックしてFWHM値を読み取り、前に示したようにROIを保存および削除します。蛍光α-ブンガロトキシンで標識されたシナプス後運動エンドプレートは、2つのマウス系統の変異体でより小さく、断片化して現れました。カスタマイズされたImage Jマクロを使用して神経筋接合部Zスタックを定量化したところ、対照と比較して、両方の疾患モデルでエンドプレート体積、最大強度投影、および相対的な曲がり角が著しく減少し、神経筋接合部の成熟障害が示されました。Image Jカスタムマクロを使用してシナプス前軸索末端分岐分布を定量化すると、免疫標識が増加した2つの動物モデルでニューロフィラメントM分布のパターンが変化していることが明らかになりました。シナプス小胞糖タンパク質2染色により、Smn 2B/マウスにおいて、隣接する神経終末活動ゾーンを有するアセチルコリン受容体含有領域の占有率の43%低下が観察された。神経筋接合部シナプス後終末板の様相は、蛍光α-ブンガロトキシン標識および強度プロファイル解析によって明確に視覚化された。神経筋接合部パラメータを評価すると、変異体の腓腹筋におけるアセチルコリン受容体ストライプの接合部襞距離と幅の増加が明らかになりました。信頼できる結果を得るには、筋肉の束を分離するために適用される強度に特に注意を払いながら、筋肉を適切にいじめることが重要です。このプロトコルは、以前は透過型電子顕微鏡などの複雑で時間のかかる手順によってのみ説明されていた神経筋接合部のより詳細な形態学的特徴付けを取得するのに役立ちます。STEDイメージング手順は、神経筋接合部に影響を与える疾患の病態生理に寄与するシナプス前後のマーカーに関する新しい洞察の調査への道を開いた。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

慢性ニコチン投与によるマウスノックインで蛍光標識ニコチン性受容体のスペクトル共焦点イメージング

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

神経高密度コア小胞の超解像イメージング

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経筋接合部

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

覚醒マウスにおける神経活性物質のMicroiontophoreticアプリケーションと組み合わせることで神経活動の細胞外記録

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

腓骨神経損傷方法：神経筋接合部を修復信頼性の高い同定するためのアッセイおよびテスト要因

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

従来のUVレーザー共焦点顕微鏡を用いて細胞ストレスと死のトリガ

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

可視化とアデノ随伴ウイルスと共焦点顕微鏡を用いた脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト オルガネラのライブ イメージング

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

一次ニューロンにおけるタンパク質とシナプスマーカーの共局在化を研究する超分解能イメージング

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...