Name: characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy
Uploaded: 2021-12-08T13:00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

우리는 Genethon의 "이미징 및 세포분석 핵심 시설"뿐만 아니라 Ile-de-France 지역, Conseil General de l' Essonne, Evry의 Genopole Recherche, University of Evry Val d' Essonne 및 INSERM의 장비 기금으로 부분적으로 지원되는 조직학 서비스에 감사드립니다. 또한 Smn 2B/2B 마우스 라인(캐나다 오타와 대학교)을 제공한 Rashmi Kothary 박사와 ColQDex2/+ 마우스 라인(미공개, 프랑스 파리 대학교)을 제공한 Eric Krejci 박사에게도 감사드립니다. 통계 분석에 대한 그의 지원에 대해 기욤 코레 (Guillaume Corre)에게 감사드립니다. 2H3 (Jessel, T.M. 및 Dodd, J.) 및 SV2 (Buckley, K.M.에 의해 개발됨) 모노클로날 항체는 NIH의 NICHD에 의해 생성되고 아이오와 대학교 생물학과, 아이오와 시티, IA 52242에서 유지되는 Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)로부터 수득하였다. 이 작업은 Française contre les Myopathies (AFM-Telethon), INSERM 및 University of Evry Val d' Essonne의 지원을 받았습니다.

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저자는이 작업과 관련된 이해 상충이 없음을 선언합니다.

설명된 비디오 프로토콜은 시냅스 전후 수준에서 병리학적 변화를 특성화하는 데 사용할 수 있는 컨포칼 및 STED 현미경을 결합하여 신경근 접합부의 3D 구조를 정량화하는 상세한 방법을 제공합니다. STED 현미경의 고분해능은 기존의 컨포칼 이미징으로는 식별할 수 없는 나노 구조의 시각화 및 형태 측정 분석을 가능하게 합니다. 이 절차를 통해 SMA 및 ColQ 관련 CMS 마우스의 두 충수 근육, 전방 경골 및 비복근에서 NMJ의 구조적 변화를 측정할 수 있었습니다.
이 기술로 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 근육을 적절하게 해부하고 애타게 하는 것이 중요하며, 근육을 둘러싼 근막과 근육 다발을 분리하기 위해 적용된 강도에 특히 주의를 기울이십시오. 그렇지 않으면 신경 분포 패턴이 중단되어 적절한 시냅스 전 NMJ 평가를 방해 할 수 있습니다. TA 및 GA로부터의 NMJ를 분석하기 위해 상세한 정보가 제공되지만, 원칙적으로, 이 프로토콜은 놀리는 단계를 필요로 하지 않는 횡격막 또는 횡복부(37)와 같은 편평한 근육을 포함하는 다른 근육에 적용될 수 있다. 조직 고정은 또한 양질의 염색을 보장하는 데 중요합니다. 따라서 고품질 PFA를 적절한 양 (근육의 15-20 배)으로 사용하는 것이 좋습니다. 또한, 정착액에 대한 노출 시간은 수축 및 응집과 같은 인공물이 과도한 고정으로 인해 나타날 수 있고 NMJ 기능에 영향을 미치기 때문에 중요한 단계입니다. 샘플의 크기 및 조직(38)에서의 파라 포름 알데히드 용액의 침투 속도를 감안할 때,이 유형의 근육에는 18-24 시간의 고정 시간이 권장된다. 염색 단계가 조직 수확 후 일주일 이상 계획되는 경우 박테리아 증식을 방지하기 위해 4 ° C에서 아 지드 화 나트륨이 보충 된 PBS에 PFA 고정 근육을 유지하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜은 컨포칼에 α-BTX-F488을 사용하고 STED 이미징에 α-BTX-F633을 사용하는 접근 방식을 제시합니다. 이러한 형광단은 설명된 실험 설계에 적합하도록 선택되었지만 사용 가능한 장비 및 재료에 따라 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 이미지 획득 및 정량화를 위해 STED CW 592nm 레이저를 사용할 때 α-BTX F488 라벨링을 선택할 수 있습니다. 그러나 본 연구에서 적용된 구성(펄스 여기 게이트 STED, 775nm 공핍)은 연속파 STED39와 같은 다른 접근 방식보다 더 높은 성능과 더 나은 분해능을 나타내어 현재 응용 분야에 더 적합한 것으로 보입니다. 또한 특히 STED(여기 및 고갈 모두)의 경우 레이저 출력 설정을 신중하게 선택하는 것이 중요한데, 이는 포화 시 강도 프로파일의 특성을 측정할 수 없으므로 NMJ 이미지의 포화 신호가 전체 분석을 위태롭게 할 수 있기 때문입니다.
현미경 소프트웨어 및 ImageJ 매크로를 사용한 이미지 획득 및 분석을 포함한 이 상세한 워크플로우는 단일 근육에서 컨포칼 및 STED 현미경으로 자율 NMJ 형태 분석을 용이하게 하기 위해 개발되었습니다. NMJ-morph2 또는 NMJ-Analyzerr14와 같은 NMJ 컨포칼 분석을 위한 이전에 설명한 워크플로우는 NMJ의 형태학적 분석 및 비교 연구를 용이하게 하는 반자동 분석법 설계를 위한 길을 열었습니다. NMJ-morph (및 업데이트 된 버전 aNMJ-morph15)는 최대 강도 투영을 사용하여 21 개의 형태 학적 특징을 측정하는 무료 ImageJ 기반 플랫폼이며 NMJ-Analyzerr는 전체 3D NMJ 구조에서 29 개의 관련 매개 변수를 생성하는 Python으로 개발 된 스크립트를 사용합니다. 수동 임계값은 사용자 분석이 필요한 이 두 가지 방법에서 이미지 처리 중 유일한 단계입니다. 이 통합 프로토콜은 조직 준비, 3D 컨포칼 이미지 획득 및 전체 골격근에서 NMJ의 ImageJ 기반 처리를 위한 단계를 자세히 설명하고 시냅스 후(부피, 최대 투영 영역 및 비틀림) 및 시냅스 전(축삭 말단 점유 및 뉴로필라멘트 축적) 말판의 5가지 중요한 매개변수에 대한 단순화된 개요를 제공합니다. 생물학적 관련성의 추가 매개 변수 인 시냅스 후 접합 주름의 AChR 조직 패턴은 초 분해능 STED 현미경 (분해능 20-30 nm)40에 의해 나노 스케일 수준에서 형태 측정 분석을 위해 통합되었습니다. 흥미롭게도 STED 이미징을 위한 조직 준비는 기존의 투과 전자 현미경(TEM)9과 같은 NMJ 미세 구조 연구에 사용되는 다른 방법보다 간단하며, 이는 적절한 근육 영역의 초박형 섹션을 얻기 위해 숙련된 조작자가 필요한 다소 복잡하고 시간 소모적인 절차입니다. 또한 STED 관련 소프트웨어를 사용하여 다중 접합 폴드의 정량적 데이터를 자동으로 얻을 수 있습니다.
이 프로토콜은 SMN 및 ColQ 결핍 근육 20,36,41,42에서 이전에 알려진 NMJ 결함을 설명하기 위해 적용되었습니다. 시냅스 후 종판 부피, MIP 면적 및 상대 비틀림 감소와 같은 컨포칼 현미경에 의한 두 마우스 모델에서 공통된 변화가 발견되었으며, 신경 섬유 축적 증가와 같은 반면, 일부 보다 구체적인 소견(NMJ 점유 감소)은 손상된 소포 트래피킹의 지표로서 SMA 마우스에서만 관찰되었습니다36. 마지막으로, STED 분석에 의해 ColQ-KO에서 AChR 스트라이프 거리와 폭의 증가가 감지되었으며, 이는 TEM20에 의해 이전에 관찰된 바와 같이 시냅스 후 접합 주름의 초구조적 결함의 징후입니다. 중요하게도, 이 프로토콜은 발달, 유지 및 다양한 병리학적 조건 하에서 신경근 접합부의 보다 심층적인 형태학적 특성화에 도움이 될 수 있습니다.

신경근 접합부 (NMJ)는 운동 축삭 말단, 시냅스 슈반 세포 및 화학 정보의 전달 및 하부 운동 뉴런 활동의 근육 수축에 관여하는 골격 근섬유 부분으로 구성된 복잡한 구조입니다. 포유류에서 신경근 접합부의 형태는 발달 중에 변화하여 성숙 후 전형적인 프레즐과 같은 모양을 채택하고 종마다 모양과 복잡성이 다르며 운동이나 노화와 같은 생리적 과정에 반응하여 어느 정도의 가소성을 보입니다 1,2,3,4 . 시냅스 후 모터 종판은 접합 주름이라는 막 침입을 형성하며, 여기서 아세틸 콜린 수용체 (AChR)를 포함하는 상부는 시냅스 전 말단 축삭 가지5와 밀접하게 접촉합니다.
신경근 접합부의 형태학적 및 기능적 변화는 척수성 근위축증(SMA) 및 근위축성 측삭 경화증(ALS)과 같은 여러 신경퇴행성 장애, 뒤셴 근이영양증(DMD)과 같은 근병증, 선천성 근무력증 증후군(CMS), 중증 근무력증(MG) 및 중핵 근병증(CNM), 및 노화 관련 근감소증 3,6,7,8,9, 10,11,12. 이러한 질병에서 종판 단편화, 감소된 시냅스 후 접합 접힘 크기 및/또는 탈신경과 같은 NMJ 구조적 변화가 관찰됩니다. NMJ의 병리학은 질병 진행 중 1 차 또는 초기 사건이거나 최근에는 임상 증상에 기여하는 2 차 사건으로 나타날 수 있습니다. 어쨌든 이러한 질병의 동물 모델에서 NMJ의 형태를 모니터링하는 것은 병리학 적 변화를 연구하고 잠재적 인 치료의 효능을 평가하는 데 중요한 매개 변수입니다.
신경근 접합부의 형태는 일반적으로 공초점 현미경 2,13,14,15 또는 전자 현미경 5,16을 사용하는 기술로 분석되며 각각 분해능 또는 기술적 어려움과 같은 고유 한 한계가 있습니다. 보다 최근에는 전자 현미경에 의한 미세 구조 분석에 대한 대안 또는 보완적인 접근 방식으로 시냅스 전 활성 영역 또는 시냅스 후 막16,17,18의 AChR 분포와 같은 NMJ의 특정 영역을 시각화하는 데 초 고해상도 현미경도 사용되었습니다.
이 프로토콜은 형광 공초점 및 유도 방출 고갈(STED) 현미경을 결합하여 NMJ 형태학적 매개변수를 평가하는 상세하고 재현 가능한 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다. 마우스 비복근 및 전방 경골의 신경분포된 괴로운 근육 섬유의 부피, 면적, 상대 비틀림, AChR 스트라이프 너비 및 축삭 말단 분포와 같은 시냅스 전 및 시냅스 후 말단판의 중요한 특징은 정상 및 질병 상태의 맥락에서 정량화되었습니다. 특히, NMJ 결함은 SMN1 유전자 11,19의 돌연변이에 의해 유발되는 운동 뉴런 변성을 갖는 신경근 질환인 척수성 근위축증의 Smn 2B/- 마우스 모델에서 예시되었으며, 비대칭 아세틸콜린에스테라아제 녹아웃(ColQ Dex2/Dex2 또는 ColQ-KO) 마우스의 콜라겐 유사 꼬리 서브유닛에서, 선천성 근무력증증후군 20의 모델로서 , 21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Buffers and Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 &#945;-bungarotoxin (F488-a-BTX)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>B13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATTO-633 &#945;-bungarotoxin (F633-a-BTX)</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-100-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS</td>
			<td>Gibco, Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol Absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion Oil, n = 1.518</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>MOIL-10LF&#160;</td>
			<td>Low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurofilament (NF-M) antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_531793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.04005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_2315387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alnico Button cylindrical magnets</td>
			<td>Farnell France</td>
			<td>E822</td>
			<td>diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >63x 1.4 NA magnitude oil immersion&#160; HCX Plan Apo CS objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Curved thin forceps-Moria iris forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra thin scissors - Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15-003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel loading tip round 1-200 &#181;L</td>
			<td>COSTAR</td>
			<td>4853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue&#160;</td>
			<td>Whatman (GE Healthcare)</td>
			<td>2105-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170&#177;5 &#181;m</td>
			<td>Marienfield</td>
			<td>107222</td>
			<td>High precision</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (12-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (24-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safeshield scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.40.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost plus slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GraphPad&#160;</td>
			<td>Prism, San Diego (US)</td>
			<td>Release N&#176;6.07</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Release N&#176; 1.53f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Release N&#176;3.7.2.2283</td>
			<td >Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy

신경근 접합부(NMJ)는 하부 운동 뉴런과 골격근 섬유 사이의 고도로 전문화된 시냅스로, 신경계에서 자발적인 근육으로 분자를 전달하여 수축을 유도하는 데 필수적인 역할을 합니다. 그들은 Duchenne 근이영양증 (DMD), 선천성 중증 증후군 (CMS), 척수성 근육 위축 (SMA) 및 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)과 같은 유전성 신경근 질환을 포함한 많은 인간 질병의 영향을받습니다. 따라서 신경근 접합부의 형태와 질병 마우스 모델의 변화를 모니터링하는 것은 병리학 적 연구 및 치료 접근법의 전임상 평가에 유용한 도구입니다. 여기에서는 쥐 놀림받은 근육 섬유로부터 모터 종판의 시냅스 전 및 시냅스 후 부분의 3차원(3D) 형태를 라벨링하고 분석하는 방법을 설명합니다. 샘플을 준비하고 컨포칼 이미징으로 NMJ 부피, 면적, 비틀림 및 축삭 말단 형태/점유를 측정하는 절차와 초고해상도 유도 방출 고갈(STED) 현미경으로 시냅스 후 접합 주름과 아세틸콜린 수용체(AChR) 스트라이프 너비 사이의 거리가 자세히 설명되어 있습니다. 이러한 NMJ 파라미터의 변화는 SMA 및 CMS의 영향을 받는 돌연변이 마우스에서 예시된다.

재현 가능한 방식으로 시냅스 전후 수준에서 신경근 접합부의 형태학적 분석을 용이하게 하기 위해 현미경 소프트웨어와 ImageJ 맞춤형 매크로를 사용하여 근육 적출에서 이미징 및 정량화에 이르는 워크플로가 개발되었습니다(그림 1). 이 프로토콜의 유용성을 예시하기 위해, 척수성 근위축증(SMA) 및 선천성 근무력증(CMS) 형태에 의해 각각 영향을 받은 유전 질환의 두 마우스 모델인 Smn2B/- 및 ColQ Dex2/Dex2 마우스에서 NMJ의 형태를 평가하고 데이터를 연령 일치 대조군 리터메이트와 비교했습니다.
NMJ 구조는 3주 및 6주령 Smn2B/-(C57Bl/6 배경) 및 ColQ Dex2/Dex2(B6D2F1/J 배경) 마우스의 경골 전방 및 비복근에서 각각 평가되었습니다. 3주령에 Smn2B/- 마우스는 NMJ 위축 및 손실35,36과 같은 골격근 발달 지연 및 탈신경의 징후를 보입니다. CMS 마우스는 NMJ에서 1 차 병리를 가지며 생후 첫 주부터 체중이 감소하고 근육 약화가 현저합니다20 (데이터는 표시되지 않음). 도 2A에 도시된 바와 같이, 형광 α-붕가로톡신으로 표지된 시냅스후 모터 말단판은 공초점 현미경에 의해 2개의 마우스 라인의 돌연변이체에서 더 작거나 단편화된 것으로 나타났다. 이 맞춤형 ImageJ 매크로를 사용한 NMJ Z-스택의 정량화는 NMJ성숙 결함의 징후로 대조군에 비해 SMA 및 CMS 마우스 모두에서 종판 부피, 최대 강도 투영(MIP) 및 상대 비틀림의 현저한 감소를 나타냈습니다(그림 2B-D). 시냅스 후 말단 부피 및 MIP는 병든 동물에서 감소하였다 (각각 Smn2B /- 및 ColQ Dex2 / Dex2 마우스에서 부피에 대해 2.7 및 2.0, MIP에 대해 2.5 및 2.0의 배-변화). 상대 비틀림은 또한 WT보다 SMN 및 ColQ 결핍 근육에서 더 작았습니다 (SMA에서 16.97 % ± 1.33 % 대 WT 마우스±에서 48.84 %, CMS에서 13.29 % 대 CMS에서 2.79 % ± 4.44 % 대조군 마우스 13.2±9 %). 또한, ImageJ 맞춤형 매크로를 사용하여 시냅스 전 축삭 말단 가지의 분포를 정량화한 결과, 면역표지가 증가한 두 동물 모델에서 신경섬유 M 분포의 변경된 패턴이 나타났으며±±(대조군에 비해 각각 대조군에 비해 Smn2B/- 및 ColQDex2/Dex2 마우스에서 각각 2.03% 및 23.64% ± 2.78% 대 18.77% ± 1.73%)(그림 3A-D ). SV2 염색에 의해, 점유 비율의 43% 감소, 즉 인접한 신경 말단 활성 영역을 갖는 AChR-함유 영역의 퍼센트가 또한 Smn2B/- 마우스에서 관찰되었다(SMA에서 49.36% ± 3.76% 대 WT 마우스±에서 85.69% 대 2.34% WT 마우스) (그림 3E,F). 이 NMJ 파라미터는 ColQ Dex2/Dex2 돌연변이체의 GA에서도 계산되었지만, 대조군 새끼와 비교하여 통계적으로 유의한 차이는 발견되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
우리는 초고해상도 유도 방출 고갈(STED) 현미경을 사용하여 ColQ 결핍 근육에서 접합 주름 사이의 거리와 이러한 주름의 꼭대기에 위치한 AChR 줄무늬의 너비를 정량화하여 시냅스 후 막 특성을 추가로 분석했습니다. 도 4에 도시된 바와 같이, 이들 구조의 양상은 형광 α-붕가로톡신 표지 및 강도 프로파일 분석에 의해 명확하게 시각화될 수 있다. 우리는 이러한 NMJ 매개 변수를 평가하고 돌연변이 체의 비복근에서 AChR 줄무늬의 접합 접힘 거리 (d) 및 폭 (w)의 증가를 발견했습니다 (358.3 nm ± 11.97 nm 및 320.8 nm ± 10.90 nm±, 야생형 마우스와 비교하여 ColQ Dex2 / Dex2에서 너비에 대해 10.51 nm 및 186.3 nm ± 7.015 nm, 각각, p < 0.05) (그림 4C, D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig01.jpg"> 그림 1: 컨포칼 및 STED 현미경을 이용한 3D 멀티스케일 NMJ 특성 분석을 위한 비디오 프로토콜의 순서도. 마우스로부터 전경골(TA) 및 비복근(GA) 근육을 수집하고, 근육 섬유를 놀리기 전에 α-붕가로톡신-F488 또는 α-붕가로톡신-F633, DAPI, 신경섬유 M(NF-M) 및 시냅스 소포 당단백질 2(SV2) 및 형광단(F488 또는 F594)-접합된 2차 항체에 대한 1차 항체로 표지했습니다. 이미지 스택은 컨포칼 현미경으로 획득하고 시냅스 후 NMJ 부피, 시냅스 전 NF-M 축적, NMJ 축삭 말단 점유, 시냅스 후 최대 강도 투영(MIP) 종판 면적 및 비틀림(d Obj(AB)은 물체의 둘레를 따라 A와 B 사이의 거리(빨간색 선)인 반면 dEuc(AB) 는 A와 B 사이의 유클리드 거리(녹색 선)입니다. STED 현미경 분석을 위해, 아세틸콜린 수용체(AChR) 줄무늬의 폭 및 접합 주름 사이의 거리를 α-BTX-F633 염색의 강도 프로파일로부터 정량화하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig02.jpg"> 그림 2: 척수성 근위축증(SMA) 및 ColQ 관련 선천성 근무력증 증후군(CMS)의 마우스 모델에서 다중 매개변수 시냅스 후 NMJ 특성화. (A) α-bungarotoxin-F488 (α-BTX)로 표지 된 TA 및 GA 근육의 시냅스 후 운동 엔드 플레이트의 대표 이미지. (B) NMJ 시냅스 후 말판 부피, (C) 최대 강도 투영 (MIP) 면적 및 (D) 3 주령 야생형 (WT) 및 Smn2B / - 마우스의 TA에서의 상대 비틀림 (왼쪽 그래프, 유전자형 당 N = 3 동물, n = 37 및 n = 56 NMJs) 및 6 주령 WT 및 ColQ Dex2 / Dex2 의 정량화 마우스 (오른쪽 그래프, 유전자형 당 N = 5 마우스, n = 89 및 n = 97 NMJs). 데이터는 SEM± 마우스당 평균(dot)으로 표현된다. 군간의 차이는 만-휘트니 검정(*p < 0.05)에 의해 분석하였다. 스케일 바는 10 μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig03.jpg"> 그림 3 : WT 및 돌연변이 마우스의 근육에서 시냅스 전 축삭 말단 분포의 형태 측정 분석. 야생형, SMA 및 ColQ 관련 CMS 마우스의 전경골(TA) 및 비복근(GA) 근육의 NMJ 신경 분포 패턴. (ᄀ, ᄂ) 뉴로필라멘트 M (NF-M, 적색) 및 α-붕가로톡신-F488 (α-BTX, 녹색)에 대한 항체로 표지된 21일령의 WT 및 Smn2B/- 마우스의 TA로부터의 대표적인 신경근 접합부 (A), 및 뉴로필라멘트 축적의 정량적 분석으로부터의 결과(B); (다, 디) 뉴로필라멘트 M (NF-M, 빨간색) 및 α-붕가로톡신-F488(α-BTX, 녹색)에 대한 항체로 표지된 6주령 WT 및 ColQ Dex2/Dex2 마우스의 GA로부터의 대표적인 신경근 접합부, 단편화되고 미성숙 시냅스 후 말판(C) 및 두 그룹의 동물에서 뉴로필라멘트 축적 결과(D). N=4 (n=34 NMJs) (B) 및 N=3 (n=54 NMJs) (D) WT 동물, 및 N=3 (n=36 NMJs) Smn2B/- 및 N=3 (n=55 NMJs) ColQ Dex2/Dex2 마우스 (B, D)를 실험에서 분석하였다. (E, F) 시냅스 소포 당단백질 2 (SV2, 빨간색) 및 α-붕가로톡신-F488 (α-BTX, 녹색)에 대한 항체로 표지된 3주령 WT 및 Smn2B/- 마우스의 TA로부터의 NMJ에서 축삭 말단 점유의 대표적인 이미지(E) 및 NMJ 점유 결과(SV2/AChR 부피비)(F). N=3(n=50 NMJs) 야생형 및 N=4(n=62 NMJs) Smn2B/-마우스로부터의 근육을 분석하였다. 데이터는 SEM± 마우스(dot) 당 평균값으로 나타내었다. 군간의 차이는 만-휘트니 검정(*p < 0.05)에 의해 분석하였다. 스케일 바는 20μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig04.jpg"> 그림 4: NMJ 시냅스 후 말단판의 STED 이미징. (A) 접합 후 AChR 줄무늬를 보이는 6주령 야생형 마우스의 비복근에서 α-붕가로톡신-F633(α-BTX)으로 표지된 NMJ의 대표적인 STED 이미지(스케일 바는 5μm). (B) 강도 프로파일을 생성하는 데 사용된 AChR 줄무늬(하단 패널)가 있는 영역의 더 높은 배율. AChR 스트라이프의 폭(w)과 이 영역의 인접한 두 스트라이프 사이의 거리(d)를 정량화하여 막대 그래프에 표시하였다. AChR 스트라이프 너비(w)와 거리(d)를 설명하기 위한 시냅스 후 종판의 개략적인 표현. 이러한 매개 변수 (C) AChR 스트라이프 거리 및 (D) 너비는 6 주령에 ColQ Dex2 / Dex2 마우스 및 대조군 새끼에서 측정되었습니다. 5 WT(총 n = 29 NMJ) 및 6 ColQ Dex2/Dex2(총 n = 43 NMJ) 동물로부터의 NMJ를 맹목적으로 분석하였다. 데이터는 SEM± 마우스당 평균(dot)으로 나타내었다. 그룹 간의 통계적 차이는 Mann-Whitney 검정(*p < 0.05)을 사용하여 분석하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: LAS X 소프트웨어 출시 및 컨포칼 획득을 위한 매개변수. 컨포칼 이미지를 획득하는 다양한 단계는 프로토콜의 섹션 3.1.2에서 3.1.7에 설명되어 있습니다. 각 NMJ 스택 획득에 대해 프로젝트가 열리고 (단계 3.1.4) 이미지 크기, 획득 속도, X, Y 및 Z 축의 매개 변수가 선택되고 (단계 3.1.7), 각 순차 스캔이 표시됩니다 (Seq.1, DAPI 용 레이저 405; Seq.2, α-BTX-F488용 레이저 488; 및 Seq.3, F594 접합된 2차 항체를 위한 레이저 552). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: STED 획득을 위한 LAS X 소프트웨어 및 매개변수 출시. STED 이미지를 획득하는 단계는 프로토콜의 섹션 3.2.2에서 3.2.8에 설명되어 있습니다. 현미경이 STED ON 구성 모드로 시작되고(단계 3.2.2) 프로젝트가 열립니다(단계 3.2.3). 이미지 획득(단계 3.2.7)을 위한 매개변수(이미지 크기, 획득 속도, 줌 팩터, X축)가 각 순차 스캔과 함께 표시됩니다(α-BTX-F633의 경우 Seq.1; F488 접합된 2차 항체에 대한 Seq.2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%202.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 3: STED 현미경으로 얻은 α-BTX 염색 접합부 주름의 이미지. 올바른 초점(왼쪽) 또는 잘못된 초점(오른쪽)으로 획득한 6주 된 야생형 마우스의 α-BTX-F633으로 표지된 시냅스 후 종판의 이미지 예. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%203.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
추가 그림 4: 사용자 지정 ImageJ 매크로로 얻은 입력 및 출력 데이터를 설명하는 Windows 팝업. NMJ 이미지의 입력 데이터 예(.tif 및 .lif 파일)가 왼쪽 열에 표시됩니다. 매크로(오른쪽 열)의 출력 데이터는 교차점(.tif)의 이미지가 포함된 폴더(Save_Volume, Save_Accu)와 결과가 포함된 데이터시트(.csv 파일)에 저장됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%204.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 5: LAS X 소프트웨어를 사용한 STED 획득의 AChR 스트라이프 거리 및 폭 분석. NMJ STED 이미지를 분석하는 단계는 프로토콜의 섹션 5에 설명되어 있습니다. A) AChR 줄무늬를 포함하는 표지된 시냅스 후 종판 영역의 이미지. 스트라이프 분석의 관심 영역은 수직선(녹색 선, 스트라이프 거리) 또는 수직 직사각형(자주색 사각형, 스트라이프 너비)을 그려 선택합니다. (ᄂ, ᄃ) 선택한 영역의 강도 프로파일과 AChR 스트라이프(B)와 AChR 스트라이프 너비(C) 사이의 거리를 계산하기 위한 측정값이 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%205.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 코딩 파일 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. NMJ 매개변수 측정값(NMJ 볼륨, MIP 엔드플레이트 영역 및 NMJ 비틀림)을 추출하는 ImageJ 사용자 지정 매크로입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 코딩 파일 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. ImageJ 사용자 지정 매크로는 NF-M 축적 및 SV2 염색을 추출합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

이 프로토콜은 SMA 및 ColQ 관련 CMS의 마우스 모델에서 병리학 적 변화를 정량화하는 데 사용되는 컨 포칼 및 STED 현미경을 결합하여 신경근 접합부의 형태 측정 분석 방법을 설명합니다.

결합된 공초점 및 초분해능 현미경에 의한 마우스의 신경근 접합부 특성 분석

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

이 프로토콜은 간단한 절차를 사용하여 전자 현미경에 가까운 분해능으로 신경근 접합부의 3D 구조를 정량적으로 분석하는 데 도움이 됩니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 근육 샘플이 컨포칼 및 STED 현미경을 위해 유사하게 처리되고 면역 표지되어 동물 모델에서 정확한 신경근 접합 구조 평가 시간을 단축한다는 것입니다. 우리가 개발 한 형태 학적 정량화는 다른 세포 하 구조를 분석하는 데 쉽게 적용 할 수 있습니다.근육 놀림과 면역 염색이 어떻게 수행되는지 보여주고 이 프로토콜의 성공적인 적용을 위한 몇 가지 권장 사항을 제공할 우리 팀의 과학자인 Martina Marinello 박사를 소개하게 되어 기쁩니다. 공초점 및 STED 현미경을 사용한 이미지 획득 및 분석을 보여줄 Genethon의 이미징 플랫폼의 Jeremie Cosette 박사를 소개하게 된 것을 기쁘게 생각합니다. 안락사 후, 두 개의 미세한 톱니 모양의 집게를 사용하여 약 1mm 너비의 작은 섬유 다발로 경골 전방 근육을 놀리기 시작합니다.그런 다음 이 근육 다발을 PBS로 준비된 1%Triton X-100이 포함된 24웰 플레이트에 옮기고 실온에서 1시간 또는 섭씨 4도에서 5시간 동안 부드럽게 교반합니다. 샘플을 실온에서 PBS로 5분 동안 3회 세척한 후, PBS에서 1%Triton X-100으로 제조된 4%BSA로 구성된 블로킹 용액으로 샘플을 부드러운 교반 하에 섭씨 4도에서 4시간 동안 배양합니다. 그런 다음 신경 섬유 M 또는 시냅스 소포 당 단백질 2에 대한 1 차 단일 클론 항체를 포함하는 동일한 차단 용액으로 샘플을 밤새 배양하여 시냅스 전 축삭 말단 또는 활성 영역을 각각 표지합니다.다음날, 라벨이 붙은 근육 다발을 부드러운 교반하에 PBS로 5 분 동안 3 번 씻으십시오. 그런 다음 실온에서 2 시간 동안 쉐이커에 올려 적절한 2 차 항체와 함께 배양하십시오. 근육 번들을 다시 씻은 후 장착 매체가있는 슬라이드에 놓습니다.그런 다음 상단에 1.5 등급 유리 커버 슬립을 놓은 다음 슬라이드 양쪽에 원통형 자석을 놓아 압력을 가하고 근육을 평평하게합니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 획득하려면 현미경 소프트웨어를 실행하고 구성 모드로 기계를 선택하고 텍스트 원고에 언급된 설정에 따라 각 실험 그룹에서 신경근 접합부의 이미지 스택을 수집합니다. 세션이 끝나면 3D 뷰어에서 열기를 클릭하고 실험 그룹을 대표하는 신경근 접합부를 선택하여 3D 라벨링을 시각화합니다.시냅스 후 신경근 접합부 및 플레이트 부피, 최대 강도 투영 영역 및 상대 비틀림을 계산하려면 신경근 접합부 부피 정량화를 위한 매크로를 이미지 J 창으로 끌어다 놓고 매크로가 두 번째 창에서 열리면 매크로 및 매크로 실행을 클릭합니다. 분석할 접합 하위 폴더가 포함된 기본 폴더를 선택하고 선택을 클릭합니다. 그런 다음 폴더 저장 팝업 메뉴에서 저장 폴더를 선택하고 선택을 클릭합니다.이미지 유형이라는 새로운 팝업 메뉴에서 Z 스택 획득의 형식을 선택합니다. 관심 염색에 해당하는 RGB 채널을 선택하고 X, Y 픽셀 크기 및 Z 단계를 나타냅니다. 독점 파일 형식을 선택한 경우 매크로는 픽셀 크기와 Z 단계를 직접 읽습니다.시냅스 전 신경 섬유 축적을 정량화하려면 신경근 접합부 축적 정량화를 위한 매크로를 Image J 창으로 끌어다 놓고 매크로 및 매크로 실행을 클릭합니다. 접합 하위 폴더, 스토리지 폴더 및 앞에서 설명한 대로 Z 스택 획득 형식을 선택합니다. 그런 다음 염색 정보 팝업에서 시냅스 전 및 시냅스 후 레이블과 색상을 표시하고 픽셀 크기 팝업 OK.In 클릭하고 X, Y 픽셀 크기를 0.072 마이크로 미터로, Z 단계를 0.5 마이크로 미터로 표시 한 다음 확인을 클릭합니다. 독점 파일 형식을 선택한 경우 매크로는 픽셀 크기와 Z 단계를 직접 읽습니다.아세틸콜린 수용체 줄무늬 사이의 거리를 계산하려면 중앙 창 상단의 정량화 메뉴를 선택합니다. 도구 탭을 클릭하고 강도를 선택한 다음 선 프로파일 아이콘을 클릭합니다. 오버샘플링을 1로 설정하고 채널 정렬을 선택합니다.프로젝트 열기 탭을 클릭하고 분석할 필터링된 이미지를 선택합니다. 그런 다음 선 그리기 아이콘을 클릭하고 여러 줄무늬 또는 접합 접힘을 수직으로 교차하는 선을 추적합니다. 첫 번째 피크의 상단을 클릭하고 다음 최대 피크에 도달할 때까지 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태에서 마우스 포인터를 이동합니다.두 피크 사이의 거리에 해당하는 DX 값에 유의하십시오. 오른쪽 창의 이미지에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 ROI 저장을 선택합니다. 화살표 아이콘을 클릭한 후 ROI를 클릭하고 휴지통 아이콘을 클릭하여 삭제합니다.아세틸콜린 수용체 스트라이프의 너비를 계산하려면 도구 탭 아래의 왼쪽 상단 패널에서 강도를 선택하고 FWHM 결정 아이콘을 클릭한 다음 채널 정렬을 선택합니다. 그런 다음 프로젝트 열기 탭을 클릭하고 분석할 필터링된 이미지를 선택합니다. 그런 다음 오른쪽 창의 상단 메뉴에서 사각형 그리기 아이콘을 클릭합니다.가로 또는 세로인 줄무늬를 선택하고 줄무늬에 수직으로 사각형을 그립니다. 중앙 창에 프로파일이 나타납니다. 왼쪽 패널에 있는 평균 투영 메뉴의 수직 또는 수평을 클릭합니다(스트라이프 방향이 수직 또는 수평인지에 따라 다름).중앙 창에서 통계를 클릭하여 FWHM 값을 읽은 다음 이전에 설명한 대로 ROI를 저장하고 삭제합니다. 형광 알파-붕가로톡신으로 표지된 시냅스 후 모터 종판은 두 마우스 계통의 돌연변이체에서 더 작고 단편화된 것으로 나타났습니다. 맞춤형 Image J 매크로를 사용한 신경근 접합부 Z 스택의 정량화는 대조군과 비교하여 두 질병 마우스 모델에서 엔드 플레이트 부피, 최대 강도 투영 및 상대 비틀림의 현저한 감소를 나타냈으며, 이는 신경근 접합부 성숙 결함을 나타냅니다.Image J 커스텀 매크로를 사용하여 시냅스 전 축삭 말단 가지 분포를 정량화한 결과, 면역표지가 증가한 두 동물 모델에서 신경섬유 M 분포의 변경된 패턴이 밝혀졌습니다. 시냅스 소포 당단백질 2 염색을 통해 Smn 2B/마우스에서 인접한 신경 말단 활성 영역을 갖는 아세틸콜린 수용체 함유 영역의 점유 비율이 43% 감소하는 것이 관찰되었습니다. 신경근 접합부 시냅스 후 말단 플레이트의 측면은 형광 알파-붕가로톡신 표지 및 강도 프로파일 분석에 의해 명확하게 시각화되었습니다.신경근 접합 매개 변수를 평가 한 결과 돌연변이 체의 비복근 근육에서 접합 접힘 거리와 아세틸 콜린 수용체 줄무늬의 폭이 증가한 것으로 나타났습니다. 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 근육을 적절하게 애타게 하는 것이 중요하며, 근육 다발을 분리하기 위해 적용된 강도에 특히 주의를 기울이십시오. 이 프로토콜은 이전에는 투과 전자 현미경과 같은 복잡하고 시간이 많이 소요되는 절차에 의해서만 설명되었던 신경근 접합부의 보다 심층적인 형태학적 특성을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.STED 영상 절차는 신경근 접합부에 영향을 미치는 질병의 병태생리학에 기여하는 시냅스 전후 마커에 관한 새로운 통찰력을 조사할 수 있는 길을 열었습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

만성 니코틴 관리와 마우스 노크 인의 Fluorescently 태그를 Nicotinic 수용체의 분광 공촛점 이미징

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

연구

신경과학

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

신경 밀도 코어 소체의 수퍼 - 해상도 이미징

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

신경 근육 접합 : 측정 시냅스 크기, 공 초점 형광 현미경을 사용하여 시냅스 단백질 농도의 분열 및 변경

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

성상의 3 차원 공 촛점 형태 학적 분석을위한 프로토콜

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

상기 표현형의 특성을 : 정량이 중요한 이유<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 신경 근육 학 분기점

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

깨어 마우스의 신경 활성 물질의 Microiontophoretic 응용 프로그램과 결합하여 신경 활동의 세포 외 기록

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

비골 신경 손상 방법 : 신뢰할 수있는 분석은 확인하고 테스트 즉, 수리 신경 근육 학 접합 요인

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

기존의 UV 레이저 공 초점 현미경을 사용하여 트리거 세포 스트레스와 죽음

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

시각화 및 Adeno 관련 바이러스 및 Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 Organotypic 뇌 조각에서 Oligodendrocyte 세포의 라이브 영상

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

1차 뉴런에서 단백질과 시냅스 마커의 공동 국소화를 연구하는 초해상도 이미징

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...