Name: characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy
Uploaded: 2021-12-08T13:00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Vi takker Genethons "Imaging and Cytometry Core Facility", samt histologitjenesten, som delvis støttes av utstyrsmidler fra Region Ile-de-France, Conseil General de l'Essonne, Genopole Recherche of Evry, University of Evry Val d'Essonne og INSERM, Frankrike. Vi er også takknemlige til Dr. Rashmi Kothary for å gi Smn 2B / 2B muselinjen (University of Ottawa, Canada) og Dr. Eric Krejci for ColQDex2 / + muselinjen (upublisert, Universitetet i Paris, Frankrike). Vi takker Guillaume Corre for hans støtte i statistisk analyse. 2H3 (utviklet av Jessel, TM og Dodd, J.) og SV2 (utviklet av Buckley, KM) monoklonale antistoffer ble hentet fra Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), opprettet av NICHD av NIH og vedlikeholdt ved University of Iowa, Institutt for biologi, Iowa City, IA 52242. Dette arbeidet ble støttet av Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon), INSERM og Universitetet i Evry Val d'Essonne.

<ol>
	<li>Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+nerve-muscle+junctions+in+hindlimb+muscles+of+the+mouse.">Postnatal maturation of nerve-muscle junctions in hindlimb muscles of the mouse.</a> Developmental Biology. 94 (1), 11-22 (1982).</li><li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMJ-morph+reveals+principal+components+of+synaptic+morphology+influencing+structure-function+relationships+at+the+neuromuscular+junction.">NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction.</a> Open Biology. 6 (12), (2016).</li><li>Willadt, S., Nash, M., Slater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+the+structure+and+function+of+mammalian+neuromuscular+junctions.">Age-related changes in the structure and function of mammalian neuromuscular junctions.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1412, 41-53 (2018).</li><li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li><li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease.">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li><li>Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+as+a+distal+axonopathy:+molecular+mechanisms+affecting+neuromuscular+junction+stability+in+the+presymptomatic+stages+of+the+disease.">ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, (2014).</li><li>Lovering, R. M., Iyer, S. R., Edwards, B., Davies, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+neuromuscular+junctions+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Alterations of neuromuscular junctions in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuroscience Letters. 737, 135304 (2020).</li><li>Koneczny, I., Herbst, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+Gravis:+Pathogenic+effects+of+autoantibodies+on+neuromuscular+architecture.">Myasthenia Gravis: Pathogenic effects of autoantibodies on neuromuscular architecture.</a> Cells. 8 (7), 671 (2019).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubular+myopathy+and+the+neuromuscular+junction:+a+novel+therapeutic+approach+from+mouse+models.">Myotubular myopathy and the neuromuscular junction: a novel therapeutic approach from mouse models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 5 (6), 852-859 (2012).</li><li>Gibbs, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+abnormalities+in+DNM2-related+centronuclear+myopathy.">Neuromuscular junction abnormalities in DNM2-related centronuclear myopathy.</a> Journal of Molecular Medicine. 91 (6), 727-737 (2013).</li><li>Swoboda, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+denervation+in+SMA:+Relation+to+age,+SMN2+copy+number,+and+function.">Natural history of denervation in SMA: Relation to age, SMN2 copy number, and function.</a> Annals of Neurology. 57 (5), 704-712 (2005).</li><li>Rodr&#237;guez Cruz, P. M., Palace, J., Beeson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction+and+wide+heterogeneity+of+congenital+myasthenic+syndromes.">The neuromuscular junction and wide heterogeneity of congenital myasthenic syndromes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1677 (2018).</li><li>Tse, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction:+Measuring+synapse+size,+fragmentation+and+changes+in+synaptic+protein+density+using+confocal+fluorescence+microscopy.">The neuromuscular junction: Measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52220 (2014).</li><li>Mejia Maza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMJ-Analyser+identifies+subtle+early+changes+in+mouse+models+of+neuromuscular+disease.">NMJ-Analyser identifies subtle early changes in mouse models of neuromuscular disease.</a> Scientific Reports. 11 (1), 12251 (2021).</li><li>Minty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aNMJ-morph:+a+simple+macro+for+rapid+analysis+of+neuromuscular+junction+morphology.">aNMJ-morph: a simple macro for rapid analysis of neuromuscular junction morphology.</a> Royal Society Open Science. 7 (4), 200128 (2020).</li><li>Modla, S., Mendonca, J., Czymmek, K. J., Akins, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neuromuscular+junctions+by+correlative+confocal+and+transmission+electron+microscopy.">Identification of neuromuscular junctions by correlative confocal and transmission electron microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 191 (2), 158-165 (2010).</li><li>Kittel, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+promotes+active+zone+assembly,+Ca2++channel+clustering,+and+vesicle+release.">Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release.</a> Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).</li><li>York, A. L., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+a+nanoscale+organization+of+acetylcholine+receptors+for+trans-synaptic+alignment+at+neuromuscular+synapses.">Super-resolution microscopy reveals a nanoscale organization of acetylcholine receptors for trans-synaptic alignment at neuromuscular synapses.</a> eNeuro. 4 (4), (2017).</li><li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology.">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (3), 263-276 (2012).</li><li>Feng, G., Krejci, E., Molgo, J., Cunningham, J. M., Massouli&#233;, J., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+collagen+Q:+Roles+in+acetylcholinesterase+and+butyrylcholinesterase+assembly+and+in+synaptic+structure+and+function.">Genetic analysis of collagen Q: Roles in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase assembly and in synaptic structure and function.</a> Journal of Cell Biology. 144 (6), 1349-1360 (1999).</li><li>Sigoillot, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+immaturity+and+muscle+atrophy+are+hallmarks+of+the+ColQ-deficient+mouse,+a+model+of+congenital+myasthenic+syndrome+with+acetylcholinesterase+deficiency.">Neuromuscular junction immaturity and muscle atrophy are hallmarks of the ColQ-deficient mouse, a model of congenital myasthenic syndrome with acetylcholinesterase deficiency.</a> The FASEB Journal. 30 (6), 2382-2399 (2016).</li><li>Vanhaesebrouck, A. E., Beeson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+congenital+myasthenic+syndromes:+expanding+genetic+and+phenotypic+spectrums+and+refining+treatment+strategies.">The congenital myasthenic syndromes: expanding genetic and phenotypic spectrums and refining treatment strategies.</a> Current Opinion in Neurology. 32 (5), 696-703 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Legland, D., Beaugrand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+clustering+of+lignocellulosic+fibres+based+on+morphometric+features+and+using+clustering+of+variables.">Automated clustering of lignocellulosic fibres based on morphometric features and using clustering of variables.</a> Industrial Crops and Products. 45, 253-261 (2013).</li><li>. GitHUb Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/Genethon/ImCy">https://github.com/Genethon/ImCy</a> (2021)</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">A Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction,+assembly,+maturation+and+maintenance+of+a+postsynaptic+apparatus.">Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus.</a> Nature Reviews Neuroscience. 2 (11), 791-805 (2001).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+synaptic+vesicle+release+and+immaturity+of+neuromuscular+junctions+in+spinal+muscular+atrophy+mice.">Impaired synaptic vesicle release and immaturity of neuromuscular junctions in spinal muscular atrophy mice.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (3), 842-851 (2009).</li><li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Human Molecular Genetics. 11 (12), 1439-1447 (2002).</li><li>Murray, L. M., Comley, L. H., Thomson, D., Parkinson, N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 17 (7), 949-962 (2008).</li><li>Boyer, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+program+dysregulation+is+contributory+to+disease+pathogenesis+in+spinal+muscular+atrophy.">Myogenic program dysregulation is contributory to disease pathogenesis in spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 23 (16), 4249-4259 (2014).</li><li>Ling, K. K. Y., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 21 (1), 185-195 (2012).</li><li>Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+transversus+abdominis+muscle+for+whole-mount+neuromuscular+junction+analysis.">Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51162 (2014).</li><li>Baker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , (1958).</li><li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+Nanoscopy+with+time-gated+detection:+Theoretical+and+experimental+aspects.">STED Nanoscopy with time-gated detection: Theoretical and experimental aspects.</a> PLoS ONE. 8 (1), 054421 (2013).</li><li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses.">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).</li><li>Thomson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characteristics+of+motor+neurons+do+not+determine+their+relative+susceptibility+to+degeneration+in+a+mouse+model+of+severe+spinal+muscular+atrophy.">Morphological characteristics of motor neurons do not determine their relative susceptibility to degeneration in a mouse model of severe spinal muscular atrophy.</a> PLoS ONE. 7 (12), 052605 (2012).</li><li>McMacken, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salbutamol+modifies+the+neuromuscular+junction+in+a+mouse+model+of+ColQ+myasthenic+syndrome.">Salbutamol modifies the neuromuscular junction in a mouse model of ColQ myasthenic syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 28 (14), 2339-2351 (2019).</li></ol>

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter knyttet til dette arbeidet.

Den beskrevne videoprotokollen gir en detaljert metode for å kvantifisere 3D-strukturen av nevromuskulære veikryss ved å kombinere konfokal og STED-mikroskopi som kan brukes til å karakterisere patologiske forandringer på pre- og postsynaptiske nivåer. Den høye oppløsningen til STED-mikroskopi tillater visualisering og morfometrisk analyse av nanostrukturer som ikke kan identifiseres ved konvensjonell konfokal avbildning. Denne prosedyren gjorde det mulig for oss å måle strukturelle endringer av NMJ i to appendikulære muskler, tibialis anterior og gastrocnemius, av SMA- og ColQ-relaterte CMS-mus.
For å oppnå pålitelige resultater med denne teknikken, er det viktig å dissekere og erte muskler riktig, spesielt oppmerksom på fascia som omgir muskelen og den påførte styrken for å skille muskelbunter; Ellers kan innerveringsmønsteret forstyrres og hindre riktig presynaptisk NMJ-vurdering. Selv om detaljert informasjon er gitt for å analysere NMJ fra TA og GA, kan denne protokollen i prinsippet tilpasses andre muskler, inkludert flate muskler, for eksempel membranen eller tverrgående abdominis37, som ikke krever ertende trinn. Vevsfiksering er også avgjørende for å sikre god kvalitet på farging; Derfor anbefales det å bruke PFA av høy kvalitet med et passende volum (15-20 ganger muskelen). I tillegg er eksponeringstiden for fikseringsmiddelet et viktig skritt fordi artefakter, for eksempel krymping og klumping, kan oppstå på grunn av overfiksering og påvirkning av NMJ-funksjoner. Gitt størrelsen på prøvene og penetrasjonshastigheten til paraformaldehydoppløsningen i vev38, anbefales en fikseringstid på 18-24 timer for denne typen muskel. I tilfelle fargingstrinnet er planlagt mer enn en uke etter vevshøsting, anbefales det å holde PFA-faste muskler i PBS supplert med natriumazid ved 4 ° C for å forhindre bakteriell spredning.
Denne protokollen presenterer en tilnærming ved bruk av α-BTX-F488 for konfokal og α-BTX-F633 for STED-avbildning. Disse fluoroforene ble valgt for å passe med det beskrevne eksperimentelle designet, men kan modifiseres i henhold til tilgjengelig utstyr og materialer. For eksempel kan α-BTX F488-merking velges når du bruker en STED CW 592 nm-laser for bildeopptak og kvantifisering. Det ser imidlertid ut til at konfigurasjonen som ble brukt i denne studien (pulserende eksitasjonsgated STED, 775 nm uttømming) viser høyere ytelse og bedre oppløsning enn andre tilnærminger, for eksempel kontinuerlig bølge STED39, noe som gjør den mer egnet for den nåværende applikasjonen. Det er også viktig å velge lasereffektinnstillingene nøye, spesielt for STED (både eksitasjon og uttømming), siden egenskapene til en intensitetsprofil ikke kan måles ved metning, og derfor kan ethvert mettet signal i et NMJ-bilde sette hele analysen i fare.
Denne detaljerte arbeidsflyten, inkludert bildeinnhenting og analyse ved hjelp av mikroskopprogramvare og ImageJ-makroer, ble utviklet for å lette autonom NMJ-morfometrisk analyse ved konfokal og STED-mikroskopi fra en enkelt muskel. Tidligere beskrevne arbeidsflyter for NMJ konfokal analyse, som NMJ-morph2 eller NMJ-Analyser14, banet vei for design av halvautomatiske metoder som letter morfologisk analyse av NMJ og komparative studier. NMJ-morph (og den oppdaterte versjonen aNMJ-morph15) er en gratis ImageJ-basert plattform som bruker maksimal intensitetsprojeksjon for å måle 21 morfologiske funksjoner, og NMJ-Analyser bruker et skript utviklet i Python som genererer 29 relevante parametere fra hele 3D NMJ-strukturen. Manuell terskelverdi er det eneste trinnet under bildebehandling i disse to metodene som krever brukeranalyse. Denne integrerte protokollen beskriver trinn for vevsforberedelse, 3D-konfokale bildeoppkjøp og ImageJ-basert behandling av NMJ-er fra hele skjelettmuskler og gir en forenklet oversikt over fem viktige parametere for endplatene postsynaptisk (volum, maksimalt projeksjonsområde og tortuositet) og presynaptisk (aksonterminalbelegg og nevrofilamentakkumulering). En tilleggsparameter av biologisk relevans, AChR-organisasjonsmønsteret til de postsynaptiske kryssfoldene, ble innlemmet for morfometrisk analyse på nanoskalanivå ved superoppløsning STED-mikroskopi (oppløsning 20-30 nm) 40. Interessant nok er vevsforberedelse for STED-avbildning enklere enn andre metoder som brukes til NMJ ultrastrukturelle studier, for eksempel konvensjonell transmisjonselektronmikroskopi (TEM)9, som er en ganske kompleks og tidkrevende prosedyre som krever en dyktig manipulator for å oppnå ultratynne seksjoner av riktig muskelregion. I tillegg kan kvantitative data fra flere koblingsfolder hentes automatisk ved hjelp av den STED-tilknyttede programvaren.
Denne protokollen ble brukt for å illustrere tidligere kjente NMJs defekter i SMN og ColQ mangelfulle muskler 20,36,41,42. Vanlige endringer ble funnet i de to musemodellene ved konfokal mikroskopi, som redusert postsynaptisk endeplatevolum, MIP-område og relativ tortuositet, og økt nevrofilamentakkumulering, mens noen mer spesifikke funn (redusert NMJ-belegg), ble observert bare hos SMA-mus, som en indikator på nedsatt vesikler som handler36. Endelig ble det oppdaget en økning i AChR-stripeavstand og bredde i ColQ-KO ved STED-analyse, som er tegn på ultrastrukturelle defekter i de postsynaptiske kryssfoldene, som tidligere observert av TEM20. Det er viktig at denne protokollen kan bidra til en mer grundig morfologisk karakterisering av nevromuskulære veikryss under utvikling, vedlikehold og under ulike patologiske forhold.

Det nevromuskulære veikrysset (NMJ) er en kompleks struktur sammensatt av en motorisk aksonterminal, en perisynaptisk Schwann-celle og en skjelettmyofiberdel involvert i overføring av kjemisk informasjon og kobling av lavere motornevronaktivitet til muskelkontraksjon. Hos pattedyr endres morfologien til det nevromuskulære krysset under utvikling, vedtar en typisk pretzel-lignende form etter modning, med forskjeller i form og kompleksitet mellom arter, og viser en viss grad av plastisitet som svar på fysiologiske prosesser som trening eller aldring 1,2,3,4 . Den postsynaptiske motoriske endeplaten danner membraninvaginasjoner kalt junctional folds, hvor den øvre delen som inneholder acetylkolinreseptorer (AChR) er i nær kontakt med den presynaptiske terminale aksongrenen5.
Morfologiske og funksjonelle endringer i nevromuskulære veikryss bidrar til patofysiologien til flere nevrodegenerative lidelser som spinal muskelatrofi (SMA) og amyotrofisk lateral sklerose (ALS), myopatier som Duchenne muskeldystrofi (DMD), medfødte myastheniske syndromer (CMS), myasthenia gravis (MG) og sentronukleære myopatier (CNM) og aldringsassosiert sarkopeni 3,6,7,8,9, 10,11,12. Ved disse sykdommene observeres NMJ-strukturelle endringer som endplatefragmentering, redusert postsynaptisk kryssfoldestørrelse og/eller denervering. Patologien til NMJ kan være en primær eller tidlig hendelse under sykdomsprogresjon eller vises mer i det siste som en sekundær hendelse som bidrar til de kliniske manifestasjonene. I alle fall representerer overvåking av morfologien til NMJ i dyremodeller av disse sykdommene en verdifull parameter for å studere patologiske endringer og vurdere effekten av potensielle behandlinger.
Morfologien til nevromuskulære veikryss analyseres vanligvis ved teknikker ved bruk av konfokalmikroskopi 2,13,14,15 eller elektronmikroskopi 5,16, med deres iboende begrensninger som henholdsvis oppløsning eller tekniske vanskeligheter. Mer nylig ble superoppløsningsmikroskopi også brukt til å visualisere bestemte regioner i NMJ, for eksempel presynaptiske aktive soner eller AChR-fordeling på den postsynaptiske membranen16,17,18, som en alternativ eller komplementær tilnærming til ultrastrukturell analyse ved elektronmikroskopi.
Denne protokollen tar sikte på å gi en detaljert og reproduserbar metode for å vurdere NMJ morfologiske parametere ved å kombinere fluorescens konfokal og stimulert utslippsuttømming (STED) mikroskopi. Viktige trekk ved presynaptiske og postsynaptiske endeplater, som volum, areal, relativ tortuositet, AChR stripebredde og aksonterminalfordeling i innerverte ertemuskelfibre av mus gastrocnemius og tibialis anterior ble kvantifisert i sammenheng med normale og syke forhold. Spesielt ble NMJ-defekter eksemplifisert i Smn2B/- musemodellen for spinal muskelatrofi, en nevromuskulær sykdom med motornevrondegenerasjon forårsaket av mutasjoner i SMN1-genet11,19, og i en kollagenlignende haleunderenhet av asymmetrisk acetylkolinesterase knockout (ColQ Dex2/Dex2 eller ColQ-KO) mus, som en modell av det medfødte myasteniske syndromet20, 21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Buffers and Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 &#945;-bungarotoxin (F488-a-BTX)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>B13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATTO-633 &#945;-bungarotoxin (F633-a-BTX)</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-100-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS</td>
			<td>Gibco, Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol Absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion Oil, n = 1.518</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>MOIL-10LF&#160;</td>
			<td>Low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurofilament (NF-M) antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_531793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.04005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_2315387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alnico Button cylindrical magnets</td>
			<td>Farnell France</td>
			<td>E822</td>
			<td>diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >63x 1.4 NA magnitude oil immersion&#160; HCX Plan Apo CS objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Curved thin forceps-Moria iris forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra thin scissors - Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15-003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel loading tip round 1-200 &#181;L</td>
			<td>COSTAR</td>
			<td>4853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue&#160;</td>
			<td>Whatman (GE Healthcare)</td>
			<td>2105-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170&#177;5 &#181;m</td>
			<td>Marienfield</td>
			<td>107222</td>
			<td>High precision</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (12-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (24-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safeshield scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.40.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost plus slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GraphPad&#160;</td>
			<td>Prism, San Diego (US)</td>
			<td>Release N&#176;6.07</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Release N&#176; 1.53f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Release N&#176;3.7.2.2283</td>
			<td >Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy

Nevromuskulære veikryss (NMJs) er høyt spesialiserte synapser mellom lavere motorneuroner og skjelettmuskulaturfibre som spiller en viktig rolle i overføringen av molekyler fra nervesystemet til frivillige muskler, noe som fører til sammentrekning. De påvirkes i mange menneskelige sykdommer, inkludert arvelige nevromuskulære lidelser som Duchenne muskeldystrofi (DMD), medfødte myastheniske syndromer (CMS), spinal muskelatrofi (SMA) og amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Derfor representerer overvåking av morfologien til nevromuskulære veikryss og deres endringer i sykdomsmusemodeller et verdifullt verktøy for patologiske studier og preklinisk vurdering av terapeutiske tilnærminger. Her beskrives metoder for merking og analyse av den tredimensjonale (3D) morfologien til de pre- og postsynaptiske delene av motoriske endeplater fra murine ertet muskelfibre. Prosedyrene for å klargjøre prøver og måle NMJ-volum, areal, tortuositet og aksonterminalmorfologi/belegg ved konfokal avbildning, og avstanden mellom postsynaptiske kryssfolder og acetylkolinreseptor (AChR) stripebredde ved superoppløsning stimulert emisjonsdeplesjon (STED) mikroskopi er detaljert. Endringer i disse NMJ-parametrene er illustrert hos mutante mus påvirket av SMA og CMS.

For å lette den morfologiske analysen av nevromuskulære veikryss på pre- og postsynaptisk nivå på en reproduserbar måte, ble det utviklet en arbeidsflyt fra muskelhøsting til avbildning og kvantifisering ved hjelp av mikroskopprogramvaren og ImageJ tilpassede makroer (figur 1). For å eksemplifisere nytten av denne protokollen ble morfologien til NMJ i to musemodeller av genetiske lidelser, henholdsvis Smn2B/- og ColQ Dex2/Dex2-mus påvirket av spinal muskelatrofi (SMA) og en medfødt myastenisk syndrom (CMS) -form, evaluert og data ble sammenlignet med aldersmatchede kontrollkull.
NMJ-strukturen ble vurdert fra tibialis anterior og gastrocnemius muskler av henholdsvis 3- og 6 uker gamle Smn2B/- (C57Bl/6 bakgrunn) og ColQ Dex2/Dex2 (B6D2F1/J bakgrunn) mus når tegn på sykdommen allerede er tilstede hos disse dyrene. Ved 3 ukers alder viser Smn2B/- mus tegn på forsinket skjelettmuskelutvikling og denervering, som NMJ-atrofi og tap35,36. CMS-mus har en primær patologi hos NMJ og manifesterer en reduksjon i kroppsvekt fra første leveuke og markert muskelsvakhet20 (data ikke vist). Som vist i figur 2A, virket den postsynaptiske motorendeplaten merket med fluorescerende α-bungarotoxin mindre og/eller fragmentert i mutanter av de to muselinjene ved konfokal mikroskopi. Kvantifisering av NMJ Z-stabler ved hjelp av disse tilpassede ImageJ-makroene viste markerte reduksjoner i endeplatevolum, maksimal intensitetsprojeksjon (MIP) og relativ tortuositet hos både SMA- og CMS-mus sammenlignet med kontroller, som tegn på NMJ-modningsdefekter32 (figur 2B-D). Postsynaptisk endeplatevolum og MIP var redusert hos syke dyr (foldeendring på 2,7 og 2,0 for volum, og 2,5 og 2,0 for MIP, henholdsvis hos Smn2B/- og ColQ Dex2/Dex2 mus). Den relative tortuositeten var også mindre i SMN- og ColQ-mangelfulle muskler enn WT (16,97 % ± 1,33 % i SMA versus 48,84 % ± 5,90 % WT-mus og 13,29 % ± 2,79 % i CMS versus 30,20 % ± 4,44 % kontrollmus). I tillegg viste kvantifiseringen av fordelingen av presynaptiske aksonterminale grener ved hjelp av den tilpassede makroen ImageJ et endret mønster i nevrofilament M-fordeling i de to dyremodellene, med økt immunmerking (84,65 % ± 0,32 % versus 16,57 % ± 2,03 % og 23,64 % ± 2,78 % versus 18,77 % ± 1,73 % i Smn2B/- og ColQ Dex2/Dex2-mus sammenlignet med kontroller) (figur 3A-D ). Ved SV2-farging ble det også observert en 43 % reduksjon i beleggsforholdet, dvs. prosent av AChR-holdige regioner med tilstøtende nerveterminale aktive soner, hos Smn2B/- mus (49,36 % ± 3,76 % i SMA versus 85,69 % ± 2,34 % WT-mus) (figur 3E,F). Denne NMJ-parameteren ble også beregnet i GA for ColQ Dex2/Dex2 mutanter, men det ble ikke funnet noen statistisk signifikant forskjell sammenlignet med kontrollerte kullkamerater (data ikke vist).
Vi analyserte videre postsynaptiske membranegenskaper ved å kvantifisere avstanden mellom koblingsfolder og bredden på AChR-striper, som ligger på toppen av disse brettene, i ColQ-mangelfull muskel ved hjelp av superoppløsning stimulert utslippsuttømming (STED) mikroskopi. Som vist i figur 4, kan aspektet av disse strukturene tydelig visualiseres ved fluorescerende α-bungarotoksinmerking og intensitetsprofilanalyse. Vi evaluerte disse NMJ-parametrene og fant en økning i kryssfoldavstanden (d) og bredden (w) av AChR-striper i gastrocnemiusmuskelen til mutanter (358,3 nm ± 11,97 nm og 320,8 nm ± 10,90 nm for avstanden, og 216,9 nm ± 10,51 nm og 186,3 nm ± 7,015 nm for bredden, i ColQ Dex2/Dex2 sammenlignet med villtypemus, henholdsvis p < 0,05) (figur 4C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig01.jpg"> Figur 1: Flytskjema for videoprotokollen for 3D multiscale NMJ-karakterisering ved konfokal og STED-mikroskopi. Tibialis anterior (TA) og gastrocnemius (GA) muskler ble samlet fra mus, og muskelfibre ble ertet før merking med α-bungarotoxin-F488 eller α-bungarotoxin-F633, DAPI, primære antistoffer rettet mot nevrofilament M (NF-M) og synaptisk vesikkelglykoprotein 2 (SV2), og fluorofor (F488 eller F594)-konjugerte sekundære antistoffer. Bildestabler ble anskaffet ved konfokal mikroskopi og behandlet for å måle postsynaptisk NMJ-volum, presynaptisk NF-M-akkumulering, NMJ-aksonterminalbelegg, postsynaptisk maksimal intensitetsprojeksjon (MIP) endeplateområde og tortuositet (d Obj (AB) er avstanden mellom A og B langs omkretsen av objektet (rød linje), mens dEuc (AB) er den euklidske avstanden mellom A og B (grønn linje)). For STED-mikroskopianalyse ble bredden på acetylkolinreseptorstriper (AChR) og avstanden mellom kryssfolder kvantifisert fra intensitetsprofiler av α-BTX-F633-farging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig02.jpg"> Figur 2: Multiparameter postsynaptisk NMJ-karakterisering i musemodeller av spinal muskelatrofi (SMA) og ColQ-relatert medfødt myastenisk syndrom (CMS). (A) Representative bilder av postsynaptiske motoriske endeplater fra TA- og GA-muskler merket med α-bungarotoxin-F488 (α-BTX). (B) Kvantifisering av NMJ postsynaptisk endeplatevolum, (C) maksimal intensitetsprojeksjon (MIP) areal og (D) relativ tortuositet i TA på 3 uker gammel villtype (WT) og Smn2B/- mus (venstre grafer, N = 3 dyr per genotype, n = 37 og n = 56 NMJs, henholdsvis) og 6 uker gamle WT og ColQ Dex2/Dex2 mus (høyre grafer, N = 5 mus per genotype, n = 89 og n = 97 NMJs, henholdsvis). Data uttrykkes som gjennomsnitt per mus (prikk) ± SEM. Forskjeller mellom gruppene ble analysert med Mann-Whitney-test (* p < 0,05). Skala bar er 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig03.jpg"> Figur 3: Morfometrisk analyse av presynaptisk aksonterminalfordeling i muskler hos WT og mutante mus. NMJ innerveringsmønster i tibialis anterior (TA) og gastrocnemius (GA) muskler av villtype, SMA og ColQ-relaterte CMS-mus. (A, B) Representative nevromuskulære veikryss fra TA av WT og Smn2B/- mus ved 21 dagers alder merket med antistoffer mot nevrofilament M (NF-M, rød) og α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, grønn) (A), og resultater fra kvantitativ analyse av nevrofilamentakkumulering (B); (C, D) Representative nevromuskulære veikryss fra GA hos 6 uker gamle WT- og ColQ Dex2/Dex2-mus merket med antistoffer mot nevrofilament M (NF-M, rød) og α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, grønn), som viser fragmenterte og umodne postsynaptiske endeplater (C), og resultater av nevrofilamentakkumulering i de to dyregruppene (D). N= 4 (n = 34 NMJs) (B) og N = 3 (n = 54 NMJs) (D) WT dyr, og N=3 (n = 36 NMJs) Smn2B/- og N = 3 (n = 55 NMJs) ColQ Dex2/Dex2 mus ble analysert i forsøkene (B, D). (E, F) Representative bilder av aksonterminalbelegg i NMJ fra TA av 3 uker gamle WT og Smn2B/- mus merket med antistoffer mot synaptisk vesikkelglykoprotein 2 (SV2, rød) og α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, grønn) (E), og resultater av NMJ-belegg (SV2/AChR volumforhold) (F). Muskler fra N = 3 (n = 50 NMJs) villtype og N = 4 (n = 62 NMJs) Smn2B/- mus ble analysert. Data uttrykkes som middelverdi per mus (prikk) ± SEM. Forskjeller mellom gruppene ble analysert med Mann-Whitney-test (* p < 0,05). Vektstenger er 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig04.jpg"> Figur 4: STED-avbildning av NMJ postsynaptiske endeplater. (A) Representativt STED-bilde av en NMJ merket med α-bungarotoxin-F633 (α-BTX) fra gastrocnemius av en 6 uker gammel villtype mus som viser postjunksjonelle AChR-striper (skalalinjen er 5 μm). (B) Høyere forstørrelse av en region med AChR-striper (bunnpanel) som ble brukt til å generere intensitetsprofilen. Bredden (w) på AChR-striper og avstanden mellom to tilstøtende striper (d) i denne regionen ble kvantifisert og presentert i søylediagrammet. Skjematisk fremstilling av den postsynaptiske endeplaten for å illustrere AChR stripebredde (w) og avstand (d). Disse parametrene, (C) AChR stripeavstand og (D) bredde, ble målt i ColQ Dex2/Dex2 mus og kontroll av kullkamerater ved 6 ukers alder. NMJ fra 5 WT (totalt n = 29 NMJs) og 6 ColQ Dex2/Dex2 (totalt n = 43 NMJs) dyr ble analysert blindt. Data uttrykkes som gjennomsnitt per mus (prikk) ± SEM. Statistiske forskjeller mellom gruppene ble analysert med Mann-Whitney-testen (* p < 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Supplerende figur 1: Lansering av LAS X-programvare og parametere for konfokale oppkjøp. De ulike trinnene for å skaffe konfokale bilder er beskrevet i avsnitt 3.1.2 til 3.1.7 i protokollen. For hver NMJ-stakkinnsamling åpnes et prosjekt (trinn 3.1.4), og parametrene for bildestørrelse, innsamlingshastighet, X-, Y- og Z-akser velges (trinn 3.1.7), med hver sekvensiell skanning angitt (Seq.1, laser 405 for DAPI; Seq.2, laser 488 for α-BTX-F488; og Seq.3, laser 552 for F594 konjugerte sekundære antistoffer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 2: Lansering av LAS X-programvare og parametere for STED-anskaffelser. Fremgangsmåten for å skaffe STED-bilder er beskrevet i avsnittene 3.2.2 til 3.2.8 i protokollen. Mikroskopet startes i konfigurasjonsmodus STED ON (trinn 3.2.2), og et prosjekt åpnes (trinn 3.2.3). Parametrene for bildeinnhenting (trinn 3.2.7) (bildestørrelse, innhentingshastighet, zoomfaktor, X-akse), med hver sekvensiell skanning er angitt (Seq.1 for α-BTX-F633; Seq.2 for F488 konjugerte sekundære antistoffer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%202.pdf" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 3: Bilder av α-BTX-fargede kryssfolder oppnådd ved STED-mikroskopi. Bildeeksempler på en postsynaptisk endeplate merket med α-BTX-F633 fra en 6 uker gammel villtypemus som ble anskaffet med enten riktig (venstre) eller feil fokus (høyre). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%203.pdf" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 4: Popup-vinduer i Windows for å beskrive inndata og utdata innhentet av de egendefinerte ImageJ-makroene. Eksempler på inndata (.tif- og LIF-filer) for NMJ-bilder vises i venstre kolonne. Utdataene fra makroene (høyre kolonne) lagres i mapper (Save_Volume, Save_Accu) som inneholder bilder av krysset (.tif) og dataark som inneholder resultatene (.csv filer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%204.pdf" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende figur 5: AChR stripeavstand og breddeanalyse fra et STED-oppkjøp ved hjelp av LAS X-programvaren. Fremgangsmåten for å analysere NMJ STED-bilder er beskrevet i avsnitt 5 i protokollen. A) Bilde av et merket postsynaptisk endeplateområde som inneholder AChR-striper. Interesseområdet for stripeanalyse velges ved å tegne en vinkelrett linje (grønn linje, for stripeavstand) eller et vinkelrett rektangel (lilla rektangel, for stripebredde). (B, C) Intensitetsprofiler for de valgte regionene og målene for å beregne avstanden mellom AChR-striper (B) og AChR-stripebredden (C) vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%205.pdf" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggskodingsfil 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. ImageJ tilpasset makro for å trekke ut NMJ-parametermålinger (NMJ-volum, MIP-sluttplateområde og NMJ-tortuositet). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggskodingsfil 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. ImageJ tilpasset makro for å trekke ut NF-M-akkumulering og SV2-farging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Denne protokollen beskriver en metode for morfometrisk analyse av nevromuskulære veikryss ved kombinert konfokal og STED-mikroskopi som brukes til å kvantifisere patologiske endringer i musemodeller av SMA og ColQ-relatert CMS.

Karakterisering av nevromuskulære veikryss hos mus ved kombinert konfokal og superoppløsningsmikroskopi

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Denne protokollen hjelper kvantitativt å analysere 3D-strukturen av nevromuskulære veikryss ved en oppløsning nær elektronmikroskopi ved hjelp av en enkel prosedyre. Den største fordelen med denne protokollen er at muskelprøver behandles på samme måte og immunmerket for konfokal og STED-mikroskopi, noe som reduserer tiden for nøyaktig nevromuskulær kryssstrukturevaluering i dyremodeller. Den morfologiske kvantifiseringen som vi utviklet, kan enkelt tilpasses for å analysere andre subcellulære strukturer.Det er min glede å introdusere Dr.Martina Marinello, en forsker fra teamet mitt som vil vise hvordan muskelerting og immunostainings utføres og gi noen anbefalinger for vellykket anvendelse av denne protokollen. Jeg er glad for å introdusere Dr.Jeremie Cosette fra Genethons bildebehandlingsplattform som vil vise bildeoppkjøp og analyse ved hjelp av konfokale og STED-mikroskoper. Etter avlivning begynner du å erte tibialis fremre muskler i små fiberbunter på omtrent en millimeter brede ved hjelp av to fine taggete tang.Overfør deretter disse muskelbuntene til en 24-brønns plate som inneholder 1% Triton X-100 tilberedt i PBS og la den forsiktig agitere i en time ved romtemperatur eller fem timer ved fire grader Celsius. Etter å ha vasket prøvene tre ganger i fem minutter med PBS ved romtemperatur, inkuber prøvene med en blokkeringsløsning sammensatt av 4% BSA fremstilt i PBS med 1% Triton X-100 i fire timer ved fire grader Celsius under mild omrøring. Inkuber deretter prøvene over natten med den samme blokkeringsoppløsningen som inneholder primære monoklonale antistoffer mot enten nevrofilament M eller synaptisk vesikkelglykoprotein 2 for å merke henholdsvis presynaptiske aksonterminaler eller aktive soner.Neste dag vasker du de merkede muskelbuntene tre ganger i fem minutter med PBS under mild omrøring. Deretter inkuberer du dem med passende sekundære antistoffer ved å plassere dem på en shaker i to timer ved romtemperatur. Etter å ha vasket muskelbuntene igjen, legg dem på et lysbilde med monteringsmedium.Plasser deretter en 1,5-graders glassdeksel på toppen, etterfulgt av sylindriske magneter på begge sider av lysbildet for å legge press og flate musklene. For å skaffe bilder ved hjelp av konfokalmikroskopet, start mikroskopprogramvaren og velg maskin som konfigurasjonsmodus og samle bildestabler av de nevromuskulære kryssene i hver eksperimentell gruppe i henhold til innstillingene nevnt i tekstmanuskriptet. På slutten av økten klikker du på Åpne i 3D-visning og velger et nevromuskulært veikryss som representerer en eksperimentell gruppe for å visualisere 3D-merkingen.For å beregne postsynaptisk nevromuskulært kryss og platevolum, maksimalt intensitetsprojeksjonsområde og relativ tortuositet, dra og slipp makroen for nevromuskulær kryssvolumkvantifisering til Image J-vinduet, og når makroen åpnes i et annet vindu, klikker du på Makroer og Kjør makro. Velg den opprinnelige mappen som inneholder kryssundermappene som skal analyseres, og klikk på Velg. Velg deretter lagringsmappen i popup-menyen for lagringsmappen og klikk på Velg.I den nye lokalmenyen kalt Image Type velger du formatet for anskaffelsene av Z-stakken. Velg RGB-kanalen som tilsvarer fargen av interesse, og angi X, Y-bildepunktstørrelse og Z-trinn. Hvis proprietære filformater er valgt, leser makroen direkte pikselstørrelse og Z-trinn.For å kvantifisere presynaptisk neurofilamentakkumulering, dra og slipp makroen for nevromuskulær kryssakkumuleringskvantifisering til Image J-vinduet, og klikk på Makroer og Kjør makro. Velg koblingsundermapper, lagringsmappe og formatet for Z-stakkanskaffelsene som vist tidligere. Deretter, i popup-vinduet Staining Infos, angir du den presynaptiske og postsynaptiske etiketten og fargen og klikker på OK.In popup-vinduet Pixel Size, angir X, Y-pikselstørrelsen som 0,072 mikrometer, Z-trinnet som 0,5 mikrometer, og klikker OK. Hvis proprietære filformater er valgt, leser makroen direkte pikselstørrelse og Z-trinn.For å beregne avstanden mellom acetylkolinreseptorstripene, velg Kvantifiser-menyen øverst i det sentrale vinduet. Klikk på Verktøy-fanen, velg intensitet og klikk på linjeprofilikonet. Sett Overallampling til én, og merk av for Sorter kanaler.Klikk på fanen Åpne prosjekter og velg det filtrerte bildet som skal analyseres. Klikk deretter på tegnelinjeikonet og spor en linje som krysser vinkelrett flere striper eller kryssfeller. Klikk på toppen av den første toppen og flytt musepekeren mens du trykker på venstre museknapp til neste maksimale topp er nådd.Legg merke til DX-verdien, som tilsvarer avstanden mellom de to toppene. Høyreklikk på musen mens du er i bildet av høyre vindu og velg Lagre avkastning. Etter å ha klikket på pilikonet, klikk på avkastningen og slett den ved å klikke på bin-ikonet.For å beregne bredden på acetylkolinreseptorstripen, velg intensitet øverst til venstre under verktøyfanen, klikk på bestem FWHM-ikonet og merk av for sorteringskanalene. Klikk deretter på fanen Åpne prosjekter og velg det filtrerte bildet som skal analyseres. Deretter klikker du på tegnerektangelikonet i toppmenyen i høyre vindu.Velg en stripe som er enten horisontal eller vertikal, og tegn et rektangel vinkelrett på stripen. En profil vises i det sentrale vinduet. Klikk på enten vertikal eller horisontal av Gjennomsnittlig projeksjon menyen i venstre panel, avhengig av om striperetningen er vertikal eller horisontal.Klikk på statistikken i det sentrale vinduet for å lese FWHM-verdien og deretter lagre og slette avkastningen som vist tidligere. Den postsynaptiske motoriske endeplaten, merket med fluorescerende alfa-Bungarotoxin, virket mindre og fragmentert i mutantene til to muselinjer. Kvantifisering av de nevromuskulære kryss Z-stablene ved hjelp av de tilpassede Image J-makroene viste en markert reduksjon i sluttplatevolumet, maksimal intensitetsprojeksjon og relativ tortuositet i begge sykdomsmusmodellene sammenlignet med kontroller, noe som indikerer nevromuskulære kryssmodningsdefekter.Kvantifisering av den presynaptiske aksonterminale grenfordelingen ved hjelp av Image J tilpasset makro viste et endret mønster i nevrofilament M-fordeling i de to dyremodellene med økt immunmerking. Gjennom synaptisk vesikkeldlykoprotein 2-farging ble det observert en 43 % reduksjon i beleggsforholdet mellom acetylkolinreseptorholdige regioner med tilstøtende nerveterminale aktive soner i Smn 2B/mus. Aspektet ved de nevromuskulære krysspostsynaptiske endeplatene ble tydelig visualisert ved fluorescerende alfa-Bungarotoksin-merking og intensitetsprofilanalyse.Evaluering av de nevromuskulære koblingsparametrene viste en økning i kryssfoldavstanden og bredden av acetylkolinreseptorstriper i gastrocnemiusmuskelen til mutantene. For å oppnå pålitelige resultater er det avgjørende å erte musklene ordentlig, og være spesielt oppmerksom på den påførte styrken for å skille muskelbunter. Denne protokollen kan bidra til å oppnå en mer grundig morfologisk karakterisering av nevromuskulært veikryss, som tidligere bare ble redegjort for av komplekse og tidkrevende prosedyrer, for eksempel transmisjonselektronmikroskopi.STED-bildebehandlingsprosedyren banet vei for undersøkelse av ny innsikt om pre- og postsynaptiske markører, som bidrar til patofysiologien av sykdommer som påvirker nevromuskulær veikryss.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Spectral confocal Imaging av fluorescently tagget nikotinreseptorene i Knock-in Mus med kronisk Nikotin Administrasjon

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-oppløsning Imaging nevrale Dense-core Blemmer

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Nevromuskulære krysset: Måling Synapse Størrelse, fragmentering og endringer i Synaptic Protein Tetthet Bruke Confocal Fluorescensmikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll for Tredimensjonal Confocal Morfometrisk Analyse av Astrocytter

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Hvorfor Kvantifisering Matters: Karakterisering av fenotyper på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Nevromuskulær Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Ekstracellulære opptak av neuronal aktivitet kombinert med Microiontophoretic Bruk av neuroaktive stoffer i Awake Mus

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

Fibular Nerve Injury Metode: En pålitelig analyse for å identifisere og Test faktorer som Repair nevromuskulære veikryss

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Utløsende Cell Stress og død ved bruk av konvensjonell UV Laser konfokalmikroskopi

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisering og Live bildebehandling av Oligodendrocyte Organelles i Organotypic hjernen skiver Adeno-assosiert Virus og AC Confocal mikroskopi

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Superoppløsningsavbildning for å studere samtidig lokalisering av proteiner og synaptiske markører i primære nevroner

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...