Name: characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy
Uploaded: 2021-12-08T13:00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Agradecemos a la "Imaging and Cytometry Core Facility" de Genethon, así como al servicio de histología, que cuentan con el apoyo parcial de fondos de equipos de la Región Ile-de-France, el Conseil General de l'Essonne, el Genopole Recherche de Evry, la Universidad de Evry Val d'Essonne y el INSERM, Francia. También agradecemos al Dr. Rashmi Kothary por proporcionar la línea de ratón Smn 2B/2B (Universidad de Ottawa, Canadá) y al Dr. Eric Krejci por la línea de ratón ColQDex2/+ (inédito, Universidad de París, Francia). Agradecemos a Guillaume Corre por su apoyo en el análisis estadístico. Los anticuerpos monoclonales 2H3 (desarrollados por Jessel, T.M. y Dodd, J.) y SV2 (desarrollados por Buckley, K.M.) se obtuvieron del Banco de Hibridoma de Estudios del Desarrollo (DSHB), creado por el NICHD del NIH y mantenido en la Universidad de Iowa, Departamento de Biología, Iowa City, IA 52242. Este trabajo fue apoyado por la Asociación Francesa contra las Miopatías (AFM-Teletón), el INSERM y la Universidad de Evry Val d'Essonne.

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses relacionados con este trabajo.

El protocolo de video descrito proporciona un método detallado para cuantificar la estructura 3D de las uniones neuromusculares mediante la combinación de microscopía confocal y STED que se puede utilizar para caracterizar los cambios patológicos en los niveles pre y postsináptico. La alta resolución de la microscopía STED permite la visualización y el análisis morfométrico de nanoestructuras que no son identificables por imágenes confocales convencionales. Este procedimiento nos permitió medir las alteraciones estructurales de las NMJ en dos músculos apendiculares, tibial anterior y gastrocnemio, de ratones SMA y CMS relacionados con ColQ.
Para obtener resultados confiables con esta técnica, es fundamental diseccionar y burlarse de los músculos correctamente, prestando especial atención a la fascia que rodea el músculo y la fuerza aplicada para separar los haces musculares; de lo contrario, el patrón de inervación podría interrumpirse impidiendo una evaluación presináptica adecuada de la NMJ. Aunque se proporciona información detallada para analizar las NMJ de TA y GA, en principio, este protocolo podría adaptarse a otros músculos, incluidos los músculos planos, como el diafragma o el abdomen transverso37, que no requieren el paso de burla. La fijación de los tejidos también es crucial para garantizar una tinción de buena calidad; por lo tanto, se recomienda usar PFA de alta calidad a un volumen apropiado (15-20 veces el del músculo). Además, el tiempo de exposición al fijador es un paso importante porque los artefactos, como la contracción y la aglutinación, pueden aparecer debido a la sobrefijación e influir en las características de NMJ. Dado el tamaño de las muestras y la velocidad de penetración de la solución de paraformaldehído en los tejidos38, se recomienda un tiempo de fijación de 18-24 h para este tipo de músculo. En caso de que el paso de tinción se planifique más de una semana después de la recolección de tejido, se sugiere mantener los músculos fijados con PFA en PBS suplementados con azida de sodio a 4 ° C para evitar la proliferación bacteriana.
Este protocolo presenta un enfoque que utiliza α-BTX-F488 para imágenes confocales y α-BTX-F633 para imágenes STED. Estos fluoróforos fueron elegidos para encajar con el diseño experimental descrito, pero pueden modificarse de acuerdo con el equipo y los materiales disponibles. Por ejemplo, se puede seleccionar el etiquetado α-BTX F488 cuando se utiliza un láser STED CW 592 nm para la adquisición y cuantificación de imágenes. Sin embargo, parece que la configuración que se aplicó en el presente estudio (STED de excitación pulsada cerrada, agotamiento de 775 nm) exhibe un mayor rendimiento y mejor resolución que otros enfoques, como la onda continua STED39, lo que la hace más adecuada para la aplicación actual. También es importante seleccionar cuidadosamente los ajustes de potencia del láser, especialmente para STED (tanto excitación como agotamiento), ya que las características de un perfil de intensidad no se pueden medir en caso de saturación y, por lo tanto, cualquier señal saturada en una imagen NMJ podría poner en peligro todo el análisis.
Este flujo de trabajo detallado, que incluye adquisiciones y análisis de imágenes utilizando software de microscopio y macros ImageJ, se desarrolló para facilitar el análisis morfométrico autónomo de NMJ mediante microscopía confocal y STED de un solo músculo. Los flujos de trabajo descritos anteriormente para el análisis confocal de NMJ, como NMJ-morph2 o NMJ-Analyser14, allanaron el camino para el diseño de métodos semiautomáticos que facilitan el análisis morfológico de NMJ y estudios comparativos. NMJ-morph (y su versión actualizada aNMJ-morph15) es una plataforma gratuita basada en ImageJ que utiliza la proyección de intensidad máxima para medir 21 características morfológicas, y NMJ-Analyser utiliza un script desarrollado en Python que genera 29 parámetros relevantes a partir de toda la estructura 3D NMJ. El umbral manual es el único paso durante el procesamiento de imágenes en estos dos métodos que requieren análisis del usuario. Este protocolo integrado detalla los pasos para la preparación de tejidos, las adquisiciones de imágenes confocales 3D y el procesamiento basado en ImageJ de NMJ de músculos esqueléticos completos y proporciona una visión general simplificada de cinco parámetros importantes de las placas terminales postsinápticas (volumen, área de proyección máxima y tortuosidad) y presinápticas (ocupación terminal del axón y acumulación de neurofilamentos). Un parámetro adicional de relevancia biológica, el patrón de organización AChR de los pliegues de unión postsinápticos, fue incorporado para el análisis morfométrico a nivel nanométrico por microscopía STED de superresolución (resolución 20-30 nm)40. Curiosamente, la preparación del tejido para imágenes STED es más simple que otros métodos utilizados para estudios ultraestructurales de NMJ, como la microscopía electrónica de transmisión convencional (TEM)9, que es un procedimiento bastante complejo y lento que requiere un manipulador experto para obtener secciones ultrafinas de la región muscular apropiada. Además, los datos cuantitativos de múltiples pliegues de unión se pueden obtener automáticamente utilizando el software asociado a STED.
Este protocolo se aplicó para ilustrar defectos NMJ previamente conocidos en músculos deficientes en SMN y ColQ 20,36,41,42. Se encontraron cambios comunes en los dos modelos de ratón por microscopía confocal, como disminución del volumen de la placa terminal postsináptica, área MIP y tortuosidad relativa, y aumento de la acumulación de neurofilamentos, mientras que algunos hallazgos más específicos (disminución de la ocupación de NMJ), se observaron solo en ratones SMA, como un indicador de tráfico de vesículas deterioradas36. Finalmente, se detectó un aumento en la distancia y anchura de la franja AChR en ColQ-KO mediante análisis STED, que son signos de defectos ultraestructurales en los pliegues de unión postsinápticos, como se observó previamente en TEM20. Es importante destacar que este protocolo puede ayudar en una caracterización morfológica más profunda de las uniones neuromusculares durante el desarrollo, el mantenimiento y bajo diversas condiciones patológicas.

La unión neuromuscular (NMJ) es una estructura compleja compuesta por un terminal del axón motor, una célula de Schwann perisináptica y una porción de miofibra esquelética involucrada en la transmisión de información química y el acoplamiento de la actividad de la neurona motora inferior a la contracción muscular. En los mamíferos, la morfología de la unión neuromuscular cambia durante el desarrollo, adoptando una forma típica similar a un pretzel después de la maduración, con diferencias de forma y complejidad entre especies, y muestra cierto grado de plasticidad en respuesta a procesos fisiológicos como el ejercicio o el envejecimiento 1,2,3,4 . La placa terminal motora postsináptica forma invaginaciones de membrana llamadas pliegues de unión, donde la parte superior que contiene receptores de acetilcolina (AChR) está en estrecho contacto conla rama 5 del axón terminal presináptico.
Los cambios morfológicos y funcionales en las uniones neuromusculares contribuyen a la fisiopatología de varios trastornos neurodegenerativos como la atrofia muscular espinal (AME) y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), miopatías como la distrofia muscular de Duchenne (DMD), los síndromes miasténicos congénitos (CMS), la miastenia gravis (MG) y las miopatías centronucleares (CNM), y la sarcopenia asociada al envejecimiento 3,6,7,8,9, 10,11,12. En estas enfermedades, se observan alteraciones estructurales de NMJ como fragmentación de la placa terminal, reducción del tamaño del pliegue de la unión postsináptica y/o denervación. La patología de las NMJ puede ser un evento primario o temprano durante la progresión de la enfermedad o aparecer más recientemente como un evento secundario que contribuye a las manifestaciones clínicas. En cualquier caso, el seguimiento de la morfología de las NMJ en modelos animales de estas enfermedades representa un parámetro valioso para estudiar los cambios patológicos y evaluar la eficacia de los posibles tratamientos.
La morfología de las uniones neuromusculares suele analizarse mediante técnicas que utilizan microscopía confocal 2,13,14,15 o microscopía electrónica 5,16, con sus limitaciones inherentes como resolución o dificultades técnicas, respectivamente. Más recientemente, la microscopía de superresolución también se utilizó para visualizar regiones particulares de la NMJ, como las zonas activas presinápticas o la distribución de AChR en la membrana postsináptica16,17,18, como un enfoque alternativo o complementario al análisis ultraestructural por microscopía electrónica.
Este protocolo tiene como objetivo proporcionar un método detallado y reproducible para evaluar los parámetros morfológicos de NMJ mediante la combinación de microscopía de agotamiento por emisión estimulada y confocal de fluorescencia (STED). Las características importantes de las placas terminales presinápticas y postsinápticas, como el volumen, el área, la tortuosidad relativa, el ancho de la franja AChR y la distribución terminal axonal en las fibras musculares inervadas de gastrocnemio y tibial anterior de ratón se cuantificaron en el contexto de condiciones normales y enfermas. En particular, los defectos de NMJ se ejemplificaron en el modelo de ratón Smn2B / - de atrofia muscular espinal, una enfermedad neuromuscular con degeneración de la neurona motora causada por mutaciones en el gen SMN1 11,19, y en una subunidad de cola similar al colágeno de ratones con acetilcolinesterasa asimétrica (ColQ Dex2 / Dex2 o ColQ-KO), como modelo del síndrome miasténico congénito20, 21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Buffers and Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 &#945;-bungarotoxin (F488-a-BTX)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>B13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATTO-633 &#945;-bungarotoxin (F633-a-BTX)</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-100-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS</td>
			<td>Gibco, Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol Absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion Oil, n = 1.518</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>MOIL-10LF&#160;</td>
			<td>Low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurofilament (NF-M) antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_531793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.04005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_2315387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alnico Button cylindrical magnets</td>
			<td>Farnell France</td>
			<td>E822</td>
			<td>diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >63x 1.4 NA magnitude oil immersion&#160; HCX Plan Apo CS objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Curved thin forceps-Moria iris forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra thin scissors - Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15-003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel loading tip round 1-200 &#181;L</td>
			<td>COSTAR</td>
			<td>4853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue&#160;</td>
			<td>Whatman (GE Healthcare)</td>
			<td>2105-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170&#177;5 &#181;m</td>
			<td>Marienfield</td>
			<td>107222</td>
			<td>High precision</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (12-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (24-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safeshield scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.40.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost plus slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GraphPad&#160;</td>
			<td>Prism, San Diego (US)</td>
			<td>Release N&#176;6.07</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Release N&#176; 1.53f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Release N&#176;3.7.2.2283</td>
			<td >Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy

Las uniones neuromusculares (NMJ) son sinapsis altamente especializadas entre las neuronas motoras inferiores y las fibras musculares esqueléticas que desempeñan un papel esencial en la transmisión de moléculas del sistema nervioso a los músculos voluntarios, lo que lleva a la contracción. Se ven afectados en muchas enfermedades humanas, incluidos los trastornos neuromusculares hereditarios como la distrofia muscular de Duchenne (DMD), los síndromes miasténicos congénitos (CMS), la atrofia muscular espinal (AME) y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Por lo tanto, el monitoreo de la morfología de las uniones neuromusculares y sus alteraciones en modelos de ratón enfermos representa una herramienta valiosa para estudios patológicos y evaluación preclínica de enfoques terapéuticos. Aquí, se describen métodos para etiquetar y analizar la morfología tridimensional (3D) de las partes pre y postsinápticas de las placas terminales motoras a partir de fibras musculares murinas. Se detallan los procedimientos para preparar muestras y medir el volumen, el área, la tortuosidad y la morfología/ocupación terminal del axón por imágenes confocales, y la distancia entre los pliegues de la unión postsináptica y el ancho de la banda del receptor de acetilcolina (AChR) mediante microscopía de agotamiento por emisión estimulada de súper resolución (STED). Las alteraciones en estos parámetros NMJ se ilustran en ratones mutantes afectados por SMA y CMS.

Con el fin de facilitar el análisis morfológico de las uniones neuromusculares a nivel pre y postsináptico de una manera reproducible, se desarrolló un flujo de trabajo desde la recolección muscular hasta la obtención de imágenes y la cuantificación utilizando el software de microscopio y macros personalizadas ImageJ (Figura 1). Para ejemplificar la utilidad de este protocolo, se evaluó la morfología de las NMJ en dos modelos de ratón de trastornos genéticos, ratones Smn2B / - y ColQ Dex2 / Dex2 afectados por atrofia muscular espinal (AME) y una forma de síndrome miasténico congénito (CMS), respectivamente, y los datos se compararon con compañeros de camada de control de la misma edad.
La estructura de la NMJ se evaluó a partir de los músculos tibial anterior y gastrocnemio de ratones Smn2B/- (fondo C57Bl/6) y ColQ Dex2/Dex2 (fondo B6D2F1/J) de 3 y 6 semanas de edad, respectivamente, cuando los signos de la enfermedad ya están presentes en estos animales. A las 3 semanas de edad, los ratones Smn2B/- muestran signos de retraso en el desarrollo y denervación del músculo esquelético, como atrofia y pérdida de NMJ35,36. Los ratones CMS tienen una patología primaria en las NMJ y manifiestan una reducción del peso corporal desde la primera semana de vida y una marcada debilidad muscular20 (datos no mostrados). Como se muestra en la Figura 2A, la placa terminal motora postsináptica marcada con α-bungarotoxina fluorescente apareció más pequeña y/o fragmentada en mutantes de las dos líneas de ratón por microscopía confocal. La cuantificación de las pilas Z de NMJ utilizando estas macros ImageJ personalizadas reveló disminuciones marcadas en el volumen de la placa terminal, la proyección de intensidad máxima (MIP) y la tortuosidad relativa en ratones SMA y CMS en comparación con los controles, como signos de defectos de maduración de NMJ32 (Figura 2B-D). El volumen de la placa terminal postsináptica y la MIP disminuyeron en animales enfermos (cambio de pliegue de 2.7 y 2.0 para el volumen, y 2.5 y 2.0 para MIP, en ratones Smn2B / - y ColQ Dex2 / Dex2, respectivamente). La tortuosidad relativa también fue menor en los músculos deficientes de SMN y ColQ que en WT (16,97% ± 1,33% en SMA frente a 48,84% ± 5,90% ratones WT, y 13,29% ± 2,79% en CMS frente a 30,20% ± 4,44% ratones control). Además, la cuantificación de la distribución de las ramas terminales del axón presináptico utilizando la macro personalizada ImageJ reveló un patrón alterado en la distribución de neurofilamentos M en los dos modelos animales, con un aumento del inmunomarcaje (84,65% ± 0,32% frente a 16,57% ± 2,03% y 23,64% ± 2,78% frente a 18,77% ± 1,73% en ratones Smn2B/- y ColQ Dex2/Dex2 en comparación con los controles, respectivamente) (Figura 3A-D ). Mediante la tinción SV2, también se observó una reducción del 43% en la razón de ocupación, es decir, el porcentaje de regiones que contienen AChR con zonas activas terminales nerviosas adyacentes, en ratones Smn2B / - (49.36% ± 3.76% en SMA versus 85.69% ± 2.34% ratones WT) (Figura 3E, F). Este parámetro NMJ también se calculó en GA de los mutantes ColQ Dex2 / Dex2, pero no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en comparación con los compañeros de camada de control (datos no mostrados).
Además, analizamos las características de la membrana postsináptica cuantificando la distancia entre los pliegues de unión y el ancho de las rayas de AChR, que se encuentran en la cresta de estos pliegues, en el músculo deficiente en ColQ utilizando microscopía de agotamiento por emisión estimulada de súper resolución (STED). Como se muestra en la Figura 4, el aspecto de estas estructuras se puede visualizar claramente mediante el etiquetado fluorescente de α-bungarotoxina y el análisis del perfil de intensidad. Evaluamos estos parámetros NMJ y encontramos un aumento en la distancia del pliegue de unión (d) y el ancho (w) de las rayas AChR en el músculo gastrocnemio de los mutantes (358.3 nm ± 11.97 nm y 320.8 nm ± 10.90 nm para la distancia, y 216.9 nm ± 10.51 nm y 186.3 nm ± 7.015 nm para el ancho, en ColQ Dex2 / Dex2 en comparación con ratones de tipo salvaje, respectivamente, p < 0,05) (Figura 4C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama de flujo del protocolo de video para la caracterización 3D multiescala de NMJ mediante microscopía confocal y STED. Los músculos tibial anterior (TA) y gastrocnemio (GA) se recolectaron de ratones, y las fibras musculares se burlaron antes de etiquetar con α-bungarotoxina-F488 o α-bungarotoxina-F633, DAPI, anticuerpos primarios dirigidos contra el neurofilamento M (NF-M) y la glicoproteína de vesícula sináptica 2 (SV2), y los anticuerpos secundarios conjugados fluoróforos (F488 o F594). Las pilas de imágenes se adquirieron mediante microscopía confocal y se procesaron para medir el volumen de NMJ postsináptico, la acumulación presináptica de NF-M, la ocupación terminal del axón NMJ, el área de la placa terminal de proyección de intensidad máxima postsináptica (MIP) y la tortuosidad (d Obj (AB) es la distancia entre A y B a lo largo del perímetro del objeto (línea roja), mientras que dEuc (AB) es la distancia euclidiana entre A y B (línea verde)). Para el análisis de microscopía STED, el ancho de las rayas del receptor de acetilcolina (AChR) y la distancia entre los pliegues de unión se cuantificaron a partir de perfiles de intensidad de tinción α-BTX-F633. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig02.jpg"> Figura 2: Caracterización multiparamétrica postsináptica de NMJ en modelos murinos de atrofia muscular espinal (AME) y síndrome miasténico congénito (CMS) relacionado con ColQ. (A) Imágenes representativas de las placas terminales motoras postsinápticas de los músculos TA y GA marcadas con α-bungarotoxina-F488 (α-BTX). (B) Cuantificación del volumen de la placa terminal postsináptica de NMJ, (C) área de proyección de intensidad máxima (MIP) y (D) tortuosidad relativa en TA de ratones de tipo salvaje (WT) y Smn2B/- de 3 semanas de edad (gráficos de la izquierda, N = 3 animales por genotipo, n = 37 y n = 56 NMJ, respectivamente) y WT de 6 semanas y ColQ Dex2/Dex2 ratones (gráficos de la derecha, N = 5 ratones por genotipo, n = 89 y n = 97 NMJ, respectivamente). Los datos se expresan como la media por ratón (punto) ± SEM. Las diferencias entre los grupos fueron analizadas por la prueba de Mann-Whitney (* p < 0,05). La barra de escala es de 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig03.jpg"> Figura 3: Análisis morfométrico de la distribución terminal del axón presináptico en músculos de ratones WT y mutantes. Patrón de inervación de NMJ en los músculos tibial anterior (TA) y gastrocnemio (GA) de ratones CMS de tipo salvaje, SMA y ColQ. (A, B) Uniones neuromusculares representativas de TA de ratones WT y Smn2B/- a los 21 días de edad marcados con anticuerpos contra el neurofilamento M (NF-M, rojo) y α-bungarotoxina-F488 (α-BTX, verde) (A), y resultados del análisis cuantitativo de la acumulación de neurofilamentos (B); (C, D) Uniones neuromusculares representativas de GA de ratones WT y ColQ Dex2/Dex2 de 6 semanas de edad marcados con anticuerpos contra el neurofilamento M (NF-M, rojo) y α-bungarotoxina-F488 (α-BTX, verde), mostrando placas terminales postsinápticas fragmentadas e inmaduras (C), y resultados de acumulación de neurofilamentos en los dos grupos de animales (D). En los experimentos se analizaron N= 4 (n = 34 NMJs) (B) y N = 3 (n = 54 NMJs) (D) animales WT, y N=3 (n = 36 NMJs) Smn2B/- y N = 3 (n = 55 NMJs) en los experimentos se analizaron ratones ColQ Dex2/Dex2 (B, D). (E, F) Imágenes representativas de la ocupación terminal del axón en NMJ de TA de ratones WT y Smn2B/- de 3 semanas de edad marcados con anticuerpos contra la glicoproteína de vesícula sináptica 2 (SV2, rojo) y α-bungarotoxina-F488 (α-BTX, verde) (E), y resultados de ocupación de NMJ (relación de volumen SV2/AChR) (F). Se analizaron los músculos de N = 3 (n = 50 NMJs) de tipo salvaje y N = 4 (n = 62 NMJs) Smn2B/- ratones. Los datos se expresan como el valor medio por ratón (punto) ± SEM. Las diferencias entre los grupos fueron analizadas por la prueba de Mann-Whitney (* p < 0,05). Las barras de escala son de 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig04.jpg"> Figura 4: Imágenes STED de las placas terminales postsinápticas de la NMJ. (A) Imagen STED representativa de una NMJ marcada con α-bungarotoxin-F633 (α-BTX) de gastrocnemio de un ratón de tipo salvaje de 6 semanas de edad que muestra rayas AChR postjuncionales (la barra de escala es de 5 μm). (B) Mayor aumento de una región con rayas AChR (panel inferior) que se utilizó para generar el perfil de intensidad. El ancho (w) de las franjas AChR y la distancia entre dos franjas adyacentes (d) de esta región fueron cuantificadas y presentadas en el gráfico de barras. Representación esquemática de la placa final postsináptica para ilustrar el ancho de banda AChR (w) y la distancia (d). Estos parámetros, (C) distancia de la franja AChR y (D) ancho, se midieron en ratones ColQ Dex2 / Dex2 y compañeros de camada de control a las 6 semanas de edad. Se analizaron a ciegas NMJ de 5 WT (n total = 29 NMJ) y 6 animales ColQ Dex2/Dex2 (total n = 43 NMJ). Los datos se expresan como la media por ratón (punto) ± SEM. Las diferencias estadísticas entre los grupos se analizaron mediante la prueba de Mann-Whitney (* p < 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Lanzamiento del software LAS X y parámetros para adquisiciones confocales. Los distintos pasos para adquirir imágenes confocales se describen en las secciones 3.1.2 a 3.1.7 del protocolo. Para cada adquisición de pila NMJ, se abre un proyecto (paso 3.1.4) y se seleccionan los parámetros de tamaño de imagen, velocidad de adquisición, ejes X, Y y Z (paso 3.1.7), con cada escaneo secuencial indicado (Seq.1, láser 405 para DAPI; Seq.2, láser 488 para α-BTX-F488; y Seq.3, láser 552 para anticuerpos secundarios conjugados F594). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 2: Lanzamiento del software LAS X y parámetros para adquisiciones STED. Los pasos para adquirir imágenes STED se describen en las secciones 3.2.2 a 3.2.8 del protocolo. El microscopio se inicia en modo de configuración STED ON (paso 3.2.2) y se abre un proyecto (paso 3.2.3). Se indican los parámetros para la adquisición de imágenes (paso 3.2.7) (tamaño de imagen, velocidad de adquisición, factor de zoom, eje X), con cada escaneo secuencial (Seq.1 para α-BTX-F633; Seq.2 para anticuerpos secundarios conjugados F488). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%202.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 3: Imágenes de pliegues de unión teñidos con α-BTX obtenidos por microscopía STED. Ejemplos de imágenes de una placa terminal postsináptica etiquetada con α-BTX-F633 de un ratón de tipo salvaje de 6 semanas de edad que se adquirieron con un enfoque correcto (izquierda) o incorrecto (derecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%203.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 4: Ventanas emergentes de Windows para describir los datos de entrada y salida obtenidos por las macros personalizadas de ImageJ. Los ejemplos de datos de entrada (archivos .tif y .lif) de imágenes NMJ se muestran en la columna izquierda. Los datos de salida de las macros (columna derecha) se guardan en carpetas (Save_Volume, Save_Accu) que contienen imágenes de la unión (.tif) y hojas de datos que contienen los resultados (archivos .csv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%204.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 5: Análisis de distancia y anchura de bandas AChR a partir de una adquisición STED utilizando el software LAS X. Los pasos para analizar imágenes NMJ STED se describen en la sección 5 del protocolo. A) Imagen de una región de placa terminal postsináptica marcada que contiene rayas de AChR. La región de interés para el análisis de franjas se selecciona dibujando una línea perpendicular (línea verde, para la distancia de la raya) o un rectángulo perpendicular (rectángulo púrpura, para el ancho de la banda). (B, C) Se muestran los perfiles de intensidad de las regiones seleccionadas y las medidas para calcular la distancia entre las franjas de AChR (B) y el ancho de banda de AChR (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%205.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo de codificación suplementario 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. Macro personalizada de ImageJ para extraer mediciones de parámetros NMJ (volumen NMJ, área de placa final MIP y tortuosidad NMJ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo de codificación complementario 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. Macro personalizada de ImageJ para extraer la acumulación de NF-M y la tinción SV2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Este protocolo describe un método para el análisis morfométrico de uniones neuromusculares mediante microscopía combinada confocal y STED que se utiliza para cuantificar cambios patológicos en modelos de ratón de SMA y CMS relacionados con ColQ.

Caracterización de uniones neuromusculares en ratones mediante microscopía combinada confocal y de superresolución

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Este protocolo ayuda a analizar cuantitativamente la estructura 3D de las uniones neuromusculares a una resolución cercana a la microscopía electrónica mediante un procedimiento simple. La principal ventaja de este protocolo es que las muestras musculares se procesan de manera similar y se inmunomarcan para microscopía confocal y STED, lo que reduce el tiempo para la evaluación precisa de la estructura de la unión neuromuscular en modelos animales. La cuantificación morfológica que desarrollamos se puede adaptar fácilmente para analizar otras estructuras subcelulares.Martina Marinello, una científica de mi equipo que mostrará cómo se realizan las burlas musculares y las inmunotinciones y dará algunas recomendaciones para la aplicación exitosa de este protocolo. Me complace presentar al Dr. Jeremie Cosette de la plataforma de imágenes de Genethon, quien mostrará la adquisición y el análisis de imágenes utilizando microscopios confocales y STED. Después de la eutanasia, comience a burlarse de los músculos tibiales anteriores en pequeños haces de fibras de aproximadamente un milímetro de ancho usando dos pinzas dentadas finas.Luego, transfiera estos haces musculares a una placa de 24 pocillos que contenga 1% de Triton X-100 preparado en PBS y deje que se agite suavemente durante una hora a temperatura ambiente o cinco horas a cuatro grados centígrados. Después de lavar las muestras tres veces durante cinco minutos con PBS a temperatura ambiente, incubar las muestras con una solución de bloqueo compuesta de 4% BSA preparada en PBS con 1% Triton X-100 durante cuatro horas a cuatro grados centígrados bajo agitación suave. Luego, incubar las muestras durante la noche con la misma solución bloqueante que contiene anticuerpos monoclonales primarios contra el neurofilamento M o la glicoproteína 2 de la vesícula sináptica para marcar terminales axónicos presinápticos o zonas activas, respectivamente.Al día siguiente, lave los haces musculares etiquetados tres veces durante cinco minutos con PBS bajo agitación suave. Luego, incubarlos con anticuerpos secundarios apropiados colocándolos en un agitador durante dos horas a temperatura ambiente. Después de lavar los haces musculares nuevamente, colóquelos en un portaobjetos con medio de montaje.Luego, coloque un deslizamiento de cubierta de vidrio de 1.5 grados en la parte superior, seguido de imanes cilíndricos a ambos lados de la diapositiva para aplicar presión y aplanar los músculos. Para adquirir imágenes utilizando el microscopio confocal, inicie el software del microscopio y elija la máquina como modo de configuración y recopile pilas de imágenes de las uniones neuromusculares en cada grupo experimental según los ajustes mencionados en el manuscrito de texto. Al final de la sesión, haga clic en Abrir en el visor 3D y elija una unión neuromuscular representativa de un grupo experimental para visualizar el etiquetado 3D.Para calcular la unión neuromuscular postsináptica y el volumen de la placa, el área de proyección de intensidad máxima y la tortuosidad relativa, arrastre y suelte la macro para la cuantificación del volumen de la unión neuromuscular en la ventana Imagen J y, cuando la macro se abra en una segunda ventana, haga clic en Macros y Ejecutar macro. Seleccione la carpeta nativa que contiene las subcarpetas de unión a analizar y haga clic en Seleccionar. Luego, en el menú emergente de guardar carpeta, seleccione la carpeta de almacenamiento y haga clic en Seleccionar.En el nuevo menú emergente denominado Tipo de imagen, seleccione el formato de las adquisiciones de la pila Z. Seleccione el canal RGB correspondiente a la tinción de interés e indique X, tamaño de píxel Y y paso Z. Si se seleccionan formatos de archivo propietarios, la macro lee directamente el tamaño del píxel y el paso Z.Para cuantificar la acumulación de neurofilamentos presinápticos, arrastre y suelte la macro para la cuantificación de la acumulación de la unión neuromuscular a la ventana Imagen J y haga clic en Macros y Ejecutar macro. Seleccione las subcarpetas de unión, la carpeta de almacenamiento y el formato de las adquisiciones de la pila Z como se demostró anteriormente. Luego, en la ventana emergente Información de tinción, indique la etiqueta y el color presinápticos y postsinápticos y haga clic en OK.In la ventana emergente Tamaño de píxel, indique el tamaño de píxel X, Y como 0.072 micrómetros, el paso Z como 0.5 micrómetros y haga clic en Aceptar. Si se seleccionan formatos de archivo propietarios, la macro lee directamente el tamaño del píxel y el paso Z.Para calcular la distancia entre las franjas del receptor de acetilcolina, seleccione el menú Cuantificar en la parte superior de la ventana central. Haga clic en la pestaña Herramientas, seleccione intensidad y haga clic en el icono de perfil de línea. Establezca Sobremuestreo en uno y marque Ordenar canales.Haga clic en la pestaña Abrir proyectos y seleccione la imagen filtrada a analizar. A continuación, haga clic en el icono de línea de dibujo y trace una línea que cruce perpendicularmente varias franjas o pliegues de unión. Haga clic en la parte superior del primer pico y mueva el puntero del ratón mientras pulsa el botón izquierdo del ratón hasta que se alcance el siguiente pico máximo.Tenga en cuenta el valor DX, que corresponde a la distancia entre los dos picos. Haga clic derecho en el ratón mientras está en la imagen de la ventana derecha y seleccione Guardar ROIs. Después de hacer clic en el icono de flecha, haga clic en el ROI y elimínelo haciendo clic en el icono de la papelera.Para calcular el ancho de la banda del receptor de acetilcolina, seleccione la intensidad en el panel superior izquierdo debajo de la pestaña herramientas, haga clic en el icono determinar FWHM y marque los canales de clasificación. Luego haga clic en la pestaña Abrir proyectos y seleccione la imagen filtrada a analizar. A continuación, haga clic en el icono de dibujar rectángulo en el menú superior de la ventana derecha.Seleccione una franja horizontal o vertical y dibuje un rectángulo perpendicularmente a la banda. Aparece un perfil en la ventana central. Haga clic en vertical u horizontal del menú Proyección promedio ubicado en el panel izquierdo, dependiendo de si la orientación de la franja es vertical u horizontal.Haga clic en Estadísticas en la ventana central para leer el valor FWHM y luego guarde y elimine los ROI como se demostró anteriormente. La placa terminal motora postsináptica, marcada con alfa-bungarotoxina fluorescente, apareció más pequeña y fragmentada en los mutantes de dos líneas de ratón. La cuantificación de las pilas Z de la unión neuromuscular utilizando las macros personalizadas de la Imagen J reveló una marcada disminución en el volumen de la placa terminal, la proyección de intensidad máxima y la tortuosidad relativa en ambos modelos de ratón de enfermedad en comparación con los controles, lo que indica defectos de maduración de la unión neuromuscular.La cuantificación de la distribución de la rama terminal del axón presináptico utilizando la macro personalizada Image J reveló un patrón alterado en la distribución de neurofilamentos M en los dos modelos animales con mayor inmunomarcaje. A través de la tinción de glicoproteína 2 de vesícula sináptica, se observó una reducción del 43% en la relación de ocupación de las regiones que contienen receptores de acetilcolina con zonas activas terminales nerviosas adyacentes en ratones Smn 2B / ratones. El aspecto de las placas terminales postsinápticas de la unión neuromuscular se visualizó claramente mediante el marcado fluorescente de alfa-bungarotoxina y el análisis del perfil de intensidad.La evaluación de los parámetros de la unión neuromuscular reveló un aumento en la distancia del pliegue de unión y el ancho de las rayas del receptor de acetilcolina en el músculo gastrocnemio de los mutantes. Para obtener resultados confiables, es crucial burlarse de los músculos correctamente, prestando especial atención a la fuerza aplicada para separar los haces musculares. Este protocolo puede ayudar a obtener una caracterización morfológica más profunda de la unión neuromuscular, que anteriormente se explicaba solo por procedimientos complejos y lentos, como la microscopía electrónica de transmisión.El procedimiento de imagen STED allanó el camino para la investigación de nuevos conocimientos sobre los marcadores pre y postsinápticos, que contribuyen a la fisiopatología de las enfermedades que afectan la unión neuromuscular.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Imagen confocal espectral de marcado con fluorescencia receptores nicotínicos en Knock-en ratones con administración crónica de nicotina

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Investigación

Neurociencias

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