Name: characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy
Uploaded: 2021-12-08T13:00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Vi tackar Genethons "Imaging and Cytometry Core Facility", liksom histologitjänsten, som delvis stöds av utrustningsmedel från regionen Ile-de-France, Conseil General de l'Essonne, Genopole Recherche of Evry, University of Evry Val d'Essonne och INSERM, Frankrike. Vi är också tacksamma mot Dr. Rashmi Kothary för att ha tillhandahållit Smn 2B / 2B muslinjen (University of Ottawa, Kanada) och Dr. Eric Krejci för ColQDex2 / + muslinjen (opublicerad, University of Paris, Frankrike). Vi tackar Guillaume Corre för hans stöd i statistisk analys. De monoklonala antikropparna 2H3 (utvecklade av Jessel, T.M. och Dodd, J.) och SV2 (utvecklade av Buckley, K.M.) erhölls från Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), skapade av NICHD från NIH och underhålls vid University of Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242. Detta arbete stöddes av Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon), INSERM och University of Evry Val d'Essonne.

<ol>
	<li>Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+nerve-muscle+junctions+in+hindlimb+muscles+of+the+mouse.">Postnatal maturation of nerve-muscle junctions in hindlimb muscles of the mouse.</a> Developmental Biology. 94 (1), 11-22 (1982).</li><li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMJ-morph+reveals+principal+components+of+synaptic+morphology+influencing+structure-function+relationships+at+the+neuromuscular+junction.">NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction.</a> Open Biology. 6 (12), (2016).</li><li>Willadt, S., Nash, M., Slater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+the+structure+and+function+of+mammalian+neuromuscular+junctions.">Age-related changes in the structure and function of mammalian neuromuscular junctions.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1412, 41-53 (2018).</li><li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li><li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease.">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li><li>Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+as+a+distal+axonopathy:+molecular+mechanisms+affecting+neuromuscular+junction+stability+in+the+presymptomatic+stages+of+the+disease.">ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, (2014).</li><li>Lovering, R. M., Iyer, S. R., Edwards, B., Davies, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+neuromuscular+junctions+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Alterations of neuromuscular junctions in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuroscience Letters. 737, 135304 (2020).</li><li>Koneczny, I., Herbst, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+Gravis:+Pathogenic+effects+of+autoantibodies+on+neuromuscular+architecture.">Myasthenia Gravis: Pathogenic effects of autoantibodies on neuromuscular architecture.</a> Cells. 8 (7), 671 (2019).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubular+myopathy+and+the+neuromuscular+junction:+a+novel+therapeutic+approach+from+mouse+models.">Myotubular myopathy and the neuromuscular junction: a novel therapeutic approach from mouse models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 5 (6), 852-859 (2012).</li><li>Gibbs, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+abnormalities+in+DNM2-related+centronuclear+myopathy.">Neuromuscular junction abnormalities in DNM2-related centronuclear myopathy.</a> Journal of Molecular Medicine. 91 (6), 727-737 (2013).</li><li>Swoboda, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+denervation+in+SMA:+Relation+to+age,+SMN2+copy+number,+and+function.">Natural history of denervation in SMA: Relation to age, SMN2 copy number, and function.</a> Annals of Neurology. 57 (5), 704-712 (2005).</li><li>Rodr&#237;guez Cruz, P. M., Palace, J., Beeson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction+and+wide+heterogeneity+of+congenital+myasthenic+syndromes.">The neuromuscular junction and wide heterogeneity of congenital myasthenic syndromes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1677 (2018).</li><li>Tse, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction:+Measuring+synapse+size,+fragmentation+and+changes+in+synaptic+protein+density+using+confocal+fluorescence+microscopy.">The neuromuscular junction: Measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52220 (2014).</li><li>Mejia Maza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMJ-Analyser+identifies+subtle+early+changes+in+mouse+models+of+neuromuscular+disease.">NMJ-Analyser identifies subtle early changes in mouse models of neuromuscular disease.</a> Scientific Reports. 11 (1), 12251 (2021).</li><li>Minty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aNMJ-morph:+a+simple+macro+for+rapid+analysis+of+neuromuscular+junction+morphology.">aNMJ-morph: a simple macro for rapid analysis of neuromuscular junction morphology.</a> Royal Society Open Science. 7 (4), 200128 (2020).</li><li>Modla, S., Mendonca, J., Czymmek, K. J., Akins, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neuromuscular+junctions+by+correlative+confocal+and+transmission+electron+microscopy.">Identification of neuromuscular junctions by correlative confocal and transmission electron microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 191 (2), 158-165 (2010).</li><li>Kittel, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+promotes+active+zone+assembly,+Ca2++channel+clustering,+and+vesicle+release.">Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release.</a> Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).</li><li>York, A. L., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+a+nanoscale+organization+of+acetylcholine+receptors+for+trans-synaptic+alignment+at+neuromuscular+synapses.">Super-resolution microscopy reveals a nanoscale organization of acetylcholine receptors for trans-synaptic alignment at neuromuscular synapses.</a> eNeuro. 4 (4), (2017).</li><li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology.">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (3), 263-276 (2012).</li><li>Feng, G., Krejci, E., Molgo, J., Cunningham, J. M., Massouli&#233;, J., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+collagen+Q:+Roles+in+acetylcholinesterase+and+butyrylcholinesterase+assembly+and+in+synaptic+structure+and+function.">Genetic analysis of collagen Q: Roles in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase assembly and in synaptic structure and function.</a> Journal of Cell Biology. 144 (6), 1349-1360 (1999).</li><li>Sigoillot, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+immaturity+and+muscle+atrophy+are+hallmarks+of+the+ColQ-deficient+mouse,+a+model+of+congenital+myasthenic+syndrome+with+acetylcholinesterase+deficiency.">Neuromuscular junction immaturity and muscle atrophy are hallmarks of the ColQ-deficient mouse, a model of congenital myasthenic syndrome with acetylcholinesterase deficiency.</a> The FASEB Journal. 30 (6), 2382-2399 (2016).</li><li>Vanhaesebrouck, A. E., Beeson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+congenital+myasthenic+syndromes:+expanding+genetic+and+phenotypic+spectrums+and+refining+treatment+strategies.">The congenital myasthenic syndromes: expanding genetic and phenotypic spectrums and refining treatment strategies.</a> Current Opinion in Neurology. 32 (5), 696-703 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Legland, D., Beaugrand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+clustering+of+lignocellulosic+fibres+based+on+morphometric+features+and+using+clustering+of+variables.">Automated clustering of lignocellulosic fibres based on morphometric features and using clustering of variables.</a> Industrial Crops and Products. 45, 253-261 (2013).</li><li>. GitHUb Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/Genethon/ImCy">https://github.com/Genethon/ImCy</a> (2021)</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">A Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction,+assembly,+maturation+and+maintenance+of+a+postsynaptic+apparatus.">Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus.</a> Nature Reviews Neuroscience. 2 (11), 791-805 (2001).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+synaptic+vesicle+release+and+immaturity+of+neuromuscular+junctions+in+spinal+muscular+atrophy+mice.">Impaired synaptic vesicle release and immaturity of neuromuscular junctions in spinal muscular atrophy mice.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (3), 842-851 (2009).</li><li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Human Molecular Genetics. 11 (12), 1439-1447 (2002).</li><li>Murray, L. M., Comley, L. H., Thomson, D., Parkinson, N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 17 (7), 949-962 (2008).</li><li>Boyer, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+program+dysregulation+is+contributory+to+disease+pathogenesis+in+spinal+muscular+atrophy.">Myogenic program dysregulation is contributory to disease pathogenesis in spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 23 (16), 4249-4259 (2014).</li><li>Ling, K. K. Y., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 21 (1), 185-195 (2012).</li><li>Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+transversus+abdominis+muscle+for+whole-mount+neuromuscular+junction+analysis.">Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51162 (2014).</li><li>Baker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , (1958).</li><li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+Nanoscopy+with+time-gated+detection:+Theoretical+and+experimental+aspects.">STED Nanoscopy with time-gated detection: Theoretical and experimental aspects.</a> PLoS ONE. 8 (1), 054421 (2013).</li><li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses.">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).</li><li>Thomson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characteristics+of+motor+neurons+do+not+determine+their+relative+susceptibility+to+degeneration+in+a+mouse+model+of+severe+spinal+muscular+atrophy.">Morphological characteristics of motor neurons do not determine their relative susceptibility to degeneration in a mouse model of severe spinal muscular atrophy.</a> PLoS ONE. 7 (12), 052605 (2012).</li><li>McMacken, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salbutamol+modifies+the+neuromuscular+junction+in+a+mouse+model+of+ColQ+myasthenic+syndrome.">Salbutamol modifies the neuromuscular junction in a mouse model of ColQ myasthenic syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 28 (14), 2339-2351 (2019).</li></ol>

Författarna förklarar inga intressekonflikter relaterade till detta arbete.

Det beskrivna videoprotokollet ger en detaljerad metod för att kvantifiera 3D-strukturen hos neuromuskulära korsningar genom att kombinera konfokal och STED-mikroskopi som kan användas för att karakterisera patologiska förändringar på pre- och postsynaptiska nivåer. Den höga upplösningen av STED-mikroskopi möjliggör visualisering och morfometrisk analys av nanostrukturer som inte kan identifieras genom konventionell konfokal avbildning. Denna procedur gjorde det möjligt för oss att mäta strukturella förändringar av NMJ i två appendikulära muskler, tibialis anterior och gastrocnemius, av SMA- och ColQ-relaterade CMS-möss.
För att få tillförlitliga resultat med denna teknik är det viktigt att dissekera och reta musklerna ordentligt, med särskild uppmärksamhet på fascian som omger muskeln och den applicerade styrkan för att separera muskelbuntar; annars kan innervationsmönstret störas och hindra korrekt presynaptisk NMJ-bedömning. Även om detaljerad information tillhandahålls för att analysera NMJ från TA och GA, kan detta protokoll i princip anpassas till andra muskler, inklusive platta muskler, såsom membran eller tvärgående abdominis37, som inte kräver retningssteget. Vävnadsfixering är också avgörande för att säkerställa färgning av god kvalitet; Därför rekommenderas att använda högkvalitativ PFA vid lämplig volym (15-20 gånger muskelns). Dessutom är exponeringstiden för fixativet ett viktigt steg eftersom artefakter, såsom krympning och klumpning, kan uppstå på grund av överfixering och påverka NMJ-funktioner. Med tanke på provernas storlek och penetrationshastigheten för paraformaldehydlösningen i vävnader38 rekommenderas en fixeringstid på 18-24 h för denna typ av muskel. Om färgningssteget planeras mer än en vecka efter vävnadsskörd, föreslås att PFA-fixerade muskler i PBS kompletteras med natriumazid vid 4 ° C för att förhindra bakteriell spridning.
Detta protokoll presenterar en metod som använder α-BTX-F488 för konfokal och α-BTX-F633 för STED-avbildning. Dessa fluoroforer valdes för att passa med den beskrivna experimentella designen men kan modifieras enligt tillgänglig utrustning och material. Till exempel kan α-BTX F488-märkning väljas när du använder en STED CW 592 nm laser för bildförvärv och kvantifiering. Det verkar dock som om konfigurationen som tillämpades i den här studien (pulserad excitation gated STED, 775 nm utarmning) uppvisar högre prestanda och bättre upplösning än andra tillvägagångssätt, såsom kontinuerlig våg STED39, vilket gör den mer lämplig för den aktuella applikationen. Det är också viktigt att noggrant välja lasereffektinställningarna, särskilt för STED (både excitation och utarmning), eftersom egenskaperna hos en intensitetsprofil inte kan mätas vid mättnad, och därför kan någon mättad signal i en NMJ-bild äventyra hela analysen.
Detta detaljerade arbetsflöde, inklusive bildförvärv och analys med hjälp av mikroskopprogramvara och ImageJ-makron, utvecklades för att underlätta autonom NMJ-morfometrisk analys genom konfokal- och STED-mikroskopi från en enda muskel. Tidigare beskrivna arbetsflöden för NMJ konfokal analys, såsom NMJ-morph2 eller NMJ-Analyser14, banade väg för design av halvautomatiska metoder som underlättar morfologisk analys av NMJ och jämförande studier. NMJ-morph (och dess uppdaterade version aNMJ-morph15) är en gratis ImageJ-baserad plattform som använder maximal intensitetsprojektion för att mäta 21 morfologiska funktioner, och NMJ-Analyser använder ett skript utvecklat i Python som genererar 29 relevanta parametrar från hela 3D NMJ-strukturen. Manuell tröskel är det enda steget under bildbehandling i dessa två metoder som kräver användaranalys. Detta integrerade protokoll beskriver steg för vävnadsberedning, 3D-konfokala bildförvärv och ImageJ-baserad bearbetning av NMJ från hela skelettmusklerna och ger en förenklad översikt över fem viktiga parametrar för postsynaptiska (volym, maximal projektionsarea och tortuositet) och presynaptiska (axonterminalbeläggning och neurofilamentackumulering) ändplattor. En ytterligare parameter av biologisk relevans, AChR-organisationsmönstret för de postsynaptiska korsningsvecken, införlivades för morfometrisk analys på nanonivånivå genom superupplöst STED-mikroskopi (upplösning 20-30 nm)40. Intressant nog är vävnadsförberedelse för STED-avbildning enklare än andra metoder som används för NMJ-ultrastrukturella studier, såsom konventionell transmissionselektronmikroskopi (TEM)9, vilket är ett ganska komplext och tidskrävande förfarande som kräver en skicklig manipulator för att erhålla ultratunna delar av lämplig muskelregion. Dessutom kan kvantitativa data från flera korsningsveck erhållas automatiskt med hjälp av den STED-associerade programvaran.
Detta protokoll tillämpades för att illustrera tidigare kända NMJs-defekter i SMN- och ColQ-bristfälliga muskler 20,36,41,42. Vanliga förändringar hittades i de två musmodellerna genom konfokalmikroskopi, såsom minskad postsynaptisk ändplåtvolym, MIP-område och relativ tortuositet och ökad neurofilamentackumulering, medan vissa mer specifika fynd (minskad NMJ-beläggning) endast observerades hos SMA-möss, som en indikator på nedsatt vesikelhandel36. Slutligen detekterades en ökning av AChR-randavståndet och bredden i ColQ-KO genom STED-analys, vilket är tecken på ultrastrukturella defekter i de postsynaptiska korsningsvecken, som tidigare observerats av TEM20. Det är viktigt att detta protokoll kan hjälpa till med en mer djupgående morfologisk karakterisering av neuromuskulära korsningar under utveckling, underhåll och under olika patologiska tillstånd.

Den neuromuskulära korsningen (NMJ) är en komplex struktur som består av en motoraxonterminal, en perisynaptisk Schwann-cell och en skelettmyofiberdel som är involverad i överföringen av kemisk information och koppling av lägre motorneuronaktivitet till muskelkontraktion. Hos däggdjur förändras morfologin hos den neuromuskulära korsningen under utvecklingen och antar en typisk kringlaliknande form efter mognad, med skillnader i form och komplexitet mellan arter, och visar en viss grad av plasticitet som svar på fysiologiska processer som träning eller åldrande 1,2,3,4 . Den postsynaptiska motorändplattan bildar membraninvaginationer som kallas korsningsveck, där den övre delen innehållande acetylkolinreceptorer (AChR) är i nära kontakt med den presynaptiska terminala axongrenen5.
Morfologiska och funktionella förändringar i neuromuskulära korsningar bidrar till patofysiologin hos flera neurodegenerativa störningar såsom spinal muskelatrofi (SMA) och amyotrofisk lateralskleros (ALS), myopatier som Duchennes muskeldystrofi (DMD), medfödda myastheniska syndrom (CMS), myasthenia gravis (MG) och centronukleära myopatier (CNM) och åldrande-associerad sarkopeni 3,6,7,8,9, 10,11,12. Vid dessa sjukdomar observeras NMJ-strukturella förändringar såsom fragmentering av ändplattan, minskad postsynaptisk korsningsveckstorlek och / eller denervation. Patologin hos NMJ kan vara en primär eller tidig händelse under sjukdomsprogression eller visas mer nyligen som en sekundär händelse som bidrar till de kliniska manifestationerna. I vilket fall som helst representerar övervakning av NMJs morfologi i djurmodeller av dessa sjukdomar en värdefull parameter för att studera patologiska förändringar och bedöma effekten av potentiella behandlingar.
Morfologin hos neuromuskulära korsningar analyseras vanligtvis med tekniker som använder konfokalmikroskopi 2,13,14,15 eller elektronmikroskopi 5,16, med deras inneboende begränsningar såsom upplösning respektive tekniska svårigheter. På senare tid användes superupplösningsmikroskopi också för att visualisera vissa regioner i NMJ, såsom presynaptiska aktiva zoner eller AChR-fördelning på det postsynaptiska membranet16,17,18, som ett alternativt eller kompletterande tillvägagångssätt för ultrastrukturell analys med elektronmikroskopi.
Detta protokoll syftar till att tillhandahålla en detaljerad och reproducerbar metod för att bedöma NMJ-morfologiska parametrar genom att kombinera fluorescenskonfokal och stimulerad emissionsutarmning (STED) mikroskopi. Viktiga egenskaper hos de presynaptiska och postsynaptiska ändplattorna, såsom volym, area, relativ tortuositet, AChR-randbredd och axonterminalfördelning i innerverade retade muskelfibrer hos mus gastrocnemius och tibialis främre kvantifierades i samband med normala och sjuka tillstånd. I synnerhet exemplifierades NMJ-defekter i Smn2B/- musmodellen av spinal muskelatrofi, en neuromuskulär sjukdom med motorneurondegenerering orsakad av mutationer i SMN1-genen11,19, och i en kollagenliknande svansunderenhet av asymmetrisk acetylkolinesteras knockout (ColQ Dex2/Dex2 eller ColQ-KO) möss, som en modell av det medfödda myastheniska syndromet20, 21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Buffers and Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 &#945;-bungarotoxin (F488-a-BTX)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>B13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATTO-633 &#945;-bungarotoxin (F633-a-BTX)</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-100-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS</td>
			<td>Gibco, Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol Absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion Oil, n = 1.518</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>MOIL-10LF&#160;</td>
			<td>Low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurofilament (NF-M) antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_531793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.04005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_2315387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alnico Button cylindrical magnets</td>
			<td>Farnell France</td>
			<td>E822</td>
			<td>diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >63x 1.4 NA magnitude oil immersion&#160; HCX Plan Apo CS objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Curved thin forceps-Moria iris forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra thin scissors - Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15-003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel loading tip round 1-200 &#181;L</td>
			<td>COSTAR</td>
			<td>4853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue&#160;</td>
			<td>Whatman (GE Healthcare)</td>
			<td>2105-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170&#177;5 &#181;m</td>
			<td>Marienfield</td>
			<td>107222</td>
			<td>High precision</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (12-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (24-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safeshield scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.40.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost plus slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GraphPad&#160;</td>
			<td>Prism, San Diego (US)</td>
			<td>Release N&#176;6.07</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Release N&#176; 1.53f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Release N&#176;3.7.2.2283</td>
			<td >Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy

Neuromuskulära korsningar (NMJs) är högspecialiserade synapser mellan lägre motorneuroner och skelettmuskelfibrer som spelar en viktig roll vid överföring av molekyler från nervsystemet till frivilliga muskler, vilket leder till sammandragning. De påverkas av många mänskliga sjukdomar, inklusive ärftliga neuromuskulära störningar som Duchennes muskeldystrofi (DMD), medfödda myastheniska syndrom (CMS), spinal muskelatrofi (SMA) och amyotrofisk lateralskleros (ALS). Därför utgör övervakning av morfologin hos neuromuskulära korsningar och deras förändringar i sjukdomsmusmodeller ett värdefullt verktyg för patologiska studier och preklinisk bedömning av terapeutiska tillvägagångssätt. Här beskrivs metoder för märkning och analys av den tredimensionella (3D) morfologin hos de pre- och postsynaptiska delarna av motoriska ändplattor från murina retade muskelfibrer. Procedurerna för att förbereda prover och mäta NMJ-volym, area, tortuositet och axonterminal morfologi / beläggning genom konfokal avbildning och avståndet mellan postsynaptiska korsningsveck och acetylkolinreceptor (AChR) randbredd genom superupplösningsstimulerad emissionsutarmning (STED) mikroskopi är detaljerade. Förändringar i dessa NMJ-parametrar illustreras hos mutanta möss som påverkas av SMA och CMS.

För att underlätta den morfologiska analysen av neuromuskulära korsningar på pre- och postsynaptisk nivå på ett reproducerbart sätt utvecklades ett arbetsflöde från muskelskörd till avbildning och kvantifiering med hjälp av mikroskopprogramvaran och ImageJ-anpassade makron (figur 1). För att exemplifiera nyttan av detta protokoll utvärderades morfologin hos NMJ i två musmodeller av genetiska störningar, Smn2B/- och ColQ Dex2/Dex2-möss som drabbats av spinal muskelatrofi (SMA) respektive en medfödd myasthenisk syndrom (CMS) och data jämfördes med åldersmatchade kontrollkullkamrater.
NMJ-strukturen bedömdes från tibialis främre och gastrocnemius muskler hos 3- och 6-veckors gamla Smn2B/- (C57Bl/6 bakgrund) respektive ColQ Dex2/Dex2 (B6D2F1/J bakgrund) möss, när tecken på sjukdomen redan finns hos dessa djur. Vid 3 veckors ålder visar Smn2B/- möss tecken på fördröjd skelettmuskelutveckling och denervation, såsom NMJ-atrofi och förlust35,36. CMS-möss har en primär patologi i NMJ och uppvisar en minskning av kroppsvikt från den första veckan i livet och markerad muskelsvaghet20 (data visas inte). Som visas i figur 2A verkade den postsynaptiska motorplattan märkt med fluorescerande α-bungarotoxin mindre och / eller fragmenterad i mutanter av de två muslinjerna genom konfokalmikroskopi. Kvantifiering av NMJ Z-stackar med hjälp av dessa anpassade ImageJ-makron avslöjade markanta minskningar i ändplattans volym, maximal intensitetsprojektion (MIP) och relativ tortuositet hos både SMA- och CMS-möss jämfört med kontroller, som tecken på NMJ-mognadsdefekter32 (Figur 2B-D). Postsynaptisk endplate-volym och MIP minskade hos sjuka djur (vikförändring på 2,7 och 2,0 för volym och 2,5 och 2,0 för MIP, hos Smn2B/- respektive ColQ Dex2/Dex2-möss). Den relativa tortuositeten var också mindre i SMN- och ColQ-bristfälliga muskler än WT (16,97% ± 1,33% i SMA jämfört med 48,84% ± 5,90% WT-möss och 13,29% ± 2,79% i CMS jämfört med 30,20% ± 4,44% kontrollmöss). Dessutom avslöjade kvantifieringen av fördelningen av presynaptiska axonterminalgrenar med hjälp av ImageJ-anpassade makrot ett förändrat mönster i neurofilament M-distribution i de två djurmodellerna, med ökad immunmärkning (84,65% ± 0,32% mot 16,57% ± 2,03% och 23,64% ± 2,78% mot 18,77% ± 1,73% i Smn2B /- respektive ColQ Dex2 / Dex2-möss jämfört med kontroller) (Figur 3A-D ). Vid SV2-färgning observerades också en 43% minskning av beläggningsgraden, dvs procent av AChR-innehållande regioner med intilliggande nervterminala aktiva zoner, hos Smn2B /- möss (49,36% ± 3,76% i SMA jämfört med 85,69% ± 2,34% WT-möss) (Figur 3E, F). Denna NMJ-parameter beräknades också i GA för ColQ Dex2/Dex2-mutanter, men ingen statistiskt signifikant skillnad hittades jämfört med kontrollkullkamrater (data visas inte).
Vi analyserade vidare postsynaptiska membranegenskaper genom att kvantifiera avståndet mellan korsningsveck och bredden på AChR-ränder, som ligger vid toppen av dessa veck, i ColQ-bristfällig muskel med hjälp av superupplösningsstimulerad emissionsutarmning (STED) mikroskopi. Som visas i figur 4 kan aspekten av dessa strukturer tydligt visualiseras genom fluorescerande α-bungarotoxinmärkning och intensitetsprofilanalys. Vi utvärderade dessa NMJ-parametrar och fann en ökning av korsningsavståndet (d) och bredden (w) för AChR-ränder i gastrocnemiusmuskeln hos mutanter (358,3 nm ± 11,97 nm och 320,8 nm ± 10,90 nm för avståndet och 216,9 nm ± 10,51 nm och 186,3 nm ± 7,015 nm för bredden, i ColQ Dex2 / Dex2 jämfört med vildtypsmöss, respektive p < 0,05) (figur 4C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig01.jpg"> Figur 1: Flödesschema för videoprotokollet för 3D-multiskala NMJ-karakterisering med konfokal- och STED-mikroskopi. Tibialis främre (TA) och gastrocnemius (GA) muskler samlades in från möss, och muskelfibrer retades före märkning med α-bungarotoxin-F488 eller α-bungarotoxin-F633, DAPI, primära antikroppar riktade mot neurofilament M (NF-M) och synaptiskt vesikelglykoprotein 2 (SV2) och fluorofor (F488 eller F594) -konjugerade sekundära antikroppar. Bildstackar förvärvades genom konfokalmikroskopi och bearbetades för att mäta postsynaptisk NMJ-volym, presynaptisk NF-M-ackumulering, NMJ-axonterminalbeläggning, postsynaptisk maximal intensitetsprojektion (MIP) ändplattaarea och tortuositet (d Obj (AB) är avståndet mellan A och B längs objektets omkrets (röd linje), medan dEuc (AB) är det euklidiska avståndet mellan A och B (grön linje)). För STED-mikroskopianalys kvantifierades bredden på acetylkolinreceptor (AChR) ränder och avståndet mellan korsningsveck från intensitetsprofiler av α-BTX-F633-färgning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig02.jpg"> Figur 2: Postsynaptisk NMJ-karakterisering med flera parametrar i musmodeller av spinal muskelatrofi (SMA) och ColQ-relaterat medfött myastheniskt syndrom (CMS). (A) Representativa bilder av postsynaptiska motoriska ändplattor från TA- och GA-muskler märkta med α-bungarotoxin-F488 (α-BTX). (B) Kvantifiering av NMJ postsynaptisk endplatevolym, (C) maximal intensitetsprojektion (MIP) -område och (D) relativ tortuositet i TA av 3 veckor gammal vildtyp (WT) och Smn2B /- möss (vänster grafer, N = 3 djur per genotyp, n = 37 respektive n = 56 NMJ) och 6 veckor gamla WT och ColQ Dex2 / Dex2 möss (höger grafer, N = 5 möss per genotyp, n = 89 respektive n = 97 NMJ). Data uttrycks som medelvärdet per mus (punkt) ± SEM. Skillnader mellan grupper analyserades med Mann-Whitney-test (* p < 0,05). Skalfältet är 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig03.jpg"> Figur 3: Morfometrisk analys av presynaptisk axonterminalfördelning i muskler hos WT och mutanta möss. NMJ innervationsmönster i tibialis främre (TA) och gastrocnemius (GA) muskler av vild typ, SMA och ColQ-relaterade CMS-möss. (A, B) Representativa neuromuskulära korsningar från TA av WT- och Smn2B/- möss vid 21 dagars ålder märkta med antikroppar mot neurofilament M (NF-M, röd) och α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, grön) (A), och resultat från kvantitativ analys av neurofilamentackumulering (B); (C, D) Representativa neuromuskulära korsningar från GA av 6 veckor gamla WT- och ColQ Dex2 / Dex2-möss märkta med antikroppar mot neurofilament M (NF-M, röd) och α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, grön), som visar fragmenterade och omogna postsynaptiska ändplattor (C) och resultat av neurofilamentackumulering i de två grupperna av djur (D). N= 4 (n = 34 NMJ) (B) och N = 3 (n = 54 NMJ) (D) WT-djur och N=3 (n = 36 NMJs) Smn2B/- och N = 3 (n = 55 NMJs) ColQ Dex2/Dex2-möss analyserades i experimenten (B, D). (E, F) Representativa bilder av axonterminalbeläggning i NMJ från TA av 3 veckor gamla WT- och Smn2B/- möss märkta med antikroppar mot synaptiskt vesikelglykoprotein 2 (SV2, rött) och α-bungarotoxin-F488 (α-BTX, grönt) (E) och resultat av NMJ-beläggning (SV2 / AChR-volymförhållande) (F). Muskler från N = 3 (n = 50 NMJ) vildtyp och N = 4 (n = 62 NMJs) Smn2B/- möss analyserades. Data uttrycks som medelvärdet per mus (punkt) ± SEM. Skillnader mellan grupper analyserades med Mann-Whitney-test (* p < 0,05). Skalstrecken är 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig04.jpg"> Figur 4: STED-avbildning av NMJ postsynaptiska ändplattor. (A) Representativ STED-bild av en NMJ märkt med α-bungarotoxin-F633 (α-BTX) från gastrocnemius av en 6 veckor gammal vild mus som visar postjunctional AChR-ränder (skalstången är 5 μm). (B) Högre förstoring av ett område med AChR-ränder (bottenpanelen) som användes för att generera intensitetsprofilen. Bredden (w) på AChR-ränder och avståndet mellan två intilliggande ränder (d) i denna region kvantifierades och presenterades i stapeldiagrammet. Schematisk representation av den postsynaptiska ändplattan för att illustrera AChR-randbredd (w) och avstånd (d). Dessa parametrar, (C) AChR-randavstånd och (D) bredd, mättes hos ColQ Dex2/Dex2-möss och kontrollkullkamrater vid 6 veckors ålder. NMJs från 5 WT (totalt n = 29 NMJs) och 6 ColQ Dex2/Dex2 (totalt n = 43 NMJs) djur analyserades blint. Data uttrycks som medelvärdet per mus (punkt) ± SEM. Statistiska skillnader mellan grupper analyserades med hjälp av Mann-Whitney-testet (* p < 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Kompletterande figur 1: Lansering av LAS X-programvara och parametrar för konfokala förvärv. De olika stegen för att skaffa konfokala bilder beskrivs i avsnitten 3.1.2 till 3.1.7 i protokollet. För varje NMJ-stackförvärv öppnas ett projekt (steg 3.1.4) och parametrarna för bildstorlek, förvärvshastighet, X-, Y- och Z-axlar väljs (steg 3.1.7), med varje sekventiell skanning indikerad (Seq.1, laser 405 för DAPI; Seq.2, laser 488 för α-BTX-F488; och Seq.3, laser 552 för F594 konjugerade sekundära antikroppar). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 2: Lansering av LAS X-programvara och parametrar för STED-förvärv. Stegen för att skaffa STED-bilder beskrivs i avsnitten 3.2.2 till 3.2.8 i protokollet. Mikroskopet startas i konfigurationsläge STED ON (steg 3.2.2) och ett projekt öppnas (steg 3.2.3). Parametrarna för bildförvärv (steg 3.2.7) (bildstorlek, förvärvshastighet, zoomfaktor, X-axel), med varje sekventiell skanning anges (Seq.1 för α-BTX-F633; Seq.2 för F488-konjugerade sekundära antikroppar). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%202.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 3: Bilder av α-BTX-färgade korsningsveck erhållna genom STED-mikroskopi. Bildexempel på en postsynaptisk ändplatta märkt med α-BTX-F633 från en 6 veckor gammal vild mus som förvärvades med antingen ett korrekt (vänster) eller felaktigt fokus (höger). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%203.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande bild 4: Windows popup-fönster för att beskriva indata och utdata som hämtas av de anpassade ImageJ-makrona. Exempel på indata (.tif- och .lif-filer) av NMJ-bilder visas i den vänstra kolumnen. Utdata från makrona (höger kolumn) sparas i mappar (Save_Volume, Save_Accu) som innehåller bilder av korsningen (.tif) och datablad som innehåller resultaten (.csv filer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%204.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande figur 5: AChR-randavstånds- och breddanalys från ett STED-förvärv med LAS X-programvaran. Stegen för att analysera NMJ STED-bilder beskrivs i avsnitt 5 i protokollet. A) Bild av en märkt postsynaptisk ändplatta som innehåller AChR-ränder. Området av intresse för randanalys väljs genom att rita en vinkelrät linje (grön linje, för randavstånd) eller en vinkelrät rektangel (lila rektangel, för randbredd). (B, C) Intensitetsprofiler för de valda regionerna och mätningar för att beräkna avståndet mellan AChR-ränder (B) och AChR-randbredden (C) visas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%205.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande kodningsfil 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. ImageJ anpassat makro för att extrahera NMJ-parametermätningar (NMJ-volym, MIP-ändplattereal och NMJ-tortuositet). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande kodningsfil 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. ImageJ anpassat makro för att extrahera NF-M-ackumulering och SV2-färgning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Detta protokoll beskriver en metod för morfometrisk analys av neuromuskulära korsningar genom kombinerad konfokal och STED-mikroskopi som används för att kvantifiera patologiska förändringar i musmodeller av SMA och ColQ-relaterat CMS.

Karakterisering av neuromuskulära korsningar hos möss genom kombinerad konfokal och superupplösningsmikroskopi

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Detta protokoll hjälper till att kvantitativt analysera 3D-strukturen hos neuromuskulära korsningar vid en upplösning nära elektronmikroskopi med hjälp av en enkel procedur. Den största fördelen med detta protokoll är att muskelprover bearbetas på liknande sätt och immunmärks för konfokal och STED-mikroskopi, vilket minskar tiden för noggrann utvärdering av neuromuskulär korsningsstruktur i djurmodeller. Den morfologiska kvantifieringen som vi utvecklade kan enkelt anpassas för att analysera andra subcellulära strukturer.Det är mitt nöje att presentera Dr.Martina Marinello, en forskare från mitt team som kommer att visa hur muskel retning och immunfärgningar utförs och ge några rekommendationer för en framgångsrik tillämpning av detta protokoll. Jag är glad att kunna presentera Dr.Jeremie Cosette från Genethons bildplattform som kommer att visa bildförvärv och analys med hjälp av konfokala och STED-mikroskop. Efter avlivning börjar du reta tibialis främre muskler i små fiberbuntar på cirka en millimeter breda med två fina tandade pincett.Överför sedan dessa muskelbuntar till en 24-brunnsplatta innehållande 1% Triton X-100 beredd i PBS och låt den försiktigt agitera i en timme vid rumstemperatur eller fem timmar vid fyra grader Celsius. Efter tvättning av proverna tre gånger i fem minuter med PBS vid rumstemperatur, inkubera proverna med en blockerande lösning bestående av 4% BSA framställd i PBS med 1% Triton X-100 i fyra timmar vid fyra grader Celsius under mild omrörning. Inkubera sedan proverna över natten med samma blockerande lösning innehållande primära monoklonala antikroppar mot antingen neurofilament M eller synaptiskt vesikelglykoprotein 2 för att märka presynaptiska axonterminaler respektive aktiva zoner.Följande dag, tvätta de märkta muskelbuntarna tre gånger i fem minuter med PBS under mild omrörning. Inkubera dem sedan med lämpliga sekundära antikroppar genom att placera dem på en shaker i två timmar vid rumstemperatur. Efter att ha tvättat muskelbuntarna igen, placera dem på en bild med monteringsmedium.Placera sedan en 1,5-graders glaslockglidning på toppen, följt av cylindriska magneter på båda sidor av bilden för att applicera tryck och platta ut musklerna. För att få bilder med hjälp av konfokalmikroskopet, starta mikroskopprogramvaran och välj maskin som konfigurationsläge och samla in bildstaplar av de neuromuskulära korsningarna i varje experimentgrupp enligt inställningarna som nämns i textmanuskriptet. I slutet av sessionen klickar du på Öppna i 3D-tittare och väljer en neuromuskulär korsning som är representativ för en experimentell grupp för att visualisera 3D-märkningen.För att beräkna postsynaptisk neuromuskulär korsning och plattvolym, projektionsområde med maximal intensitet och relativ tortuositet, dra och släpp makrot för kvantifiering av neuromuskulär korsningsvolym till bild J-fönstret, och när makrot öppnas i ett andra fönster, klicka på Makron och Kör makro. Välj den inbyggda mappen som innehåller korsningsundermapparna som ska analyseras och klicka på Välj. Välj sedan lagringsmappen i popup-menyn för att spara mappen och klicka på Välj.I den nya popup-menyn Bildtyp väljer du formatet för Z-stackförvärven. Välj den RGB-kanal som motsvarar färgningen av intresse och ange X, Y pixelstorlek och Z-steg. Om proprietära filformat väljs läser makrot direkt pixelstorlek och Z-steg.För att kvantifiera presynaptisk neurofilamentackumulering, dra och släpp makrot för neuromuskulär kopplingsackumuleringskvantifiering till bild J-fönstret och klicka på Makron och Kör makro. Välj korsningsundermapparna, lagringsmappen och formatet för Z-stackförvärven som visats tidigare. Ange sedan den presynaptiska och postsynaptiska etiketten och färgen i popup-fönstret Staining Infos och klicka OK.In på popup-fönstret Pixel Size, ange X, Y-pixelstorleken som 0,072 mikrometer, Z-steget som 0,5 mikrometer och klicka på OK. Om proprietära filformat väljs läser makrot direkt pixelstorlek och Z-steg.För att beräkna avståndet mellan acetylkolinreceptorränderna, välj menyn Kvantifiera ovanpå det centrala fönstret. Klicka på fliken Verktyg, välj intensitet och klicka på linjeprofilikonen. Ställ in Översampling på en och markera Sortera kanaler.Klicka på fliken Öppna projekt och välj den filtrerade bilden som ska analyseras. Klicka sedan på ritlinjeikonen och spåra en linje som korsar vinkelrätt flera ränder eller korsningsveck. Klicka på toppen av den första toppen och flytta muspekaren medan du trycker på vänster musknapp tills nästa maximala topp har uppnåtts.Observera DX-värdet, vilket motsvarar avståndet mellan de två topparna. Högerklicka på musen medan du är i bilden i det högra fönstret och välj Spara ROI. När du har klickat på pilikonen klickar du på avkastningen och tar bort den genom att klicka på bin-ikonen.För att beräkna acetylkolinreceptorremsans bredd, välj intensitet i den övre vänstra panelen under verktygsfliken, klicka på bestäm FWHM-ikonen och markera sorteringskanalerna. Klicka sedan på fliken Öppna projekt och välj den filtrerade bilden som ska analyseras. Klicka sedan på ritrektangelikonen i toppmenyn i det högra fönstret.Välj en rand som är antingen horisontell eller vertikal och rita en rektangel vinkelrätt mot randen. En profil visas i det centrala fönstret. Klicka på antingen vertikalt eller horisontellt på menyn Genomsnittlig projektion i den vänstra panelen, beroende på om randorienteringen är vertikal eller horisontell.Klicka på statistik i det centrala fönstret för att läsa FWHM-värdet och spara och ta bort roi: erna som visats tidigare. Den postsynaptiska motorändplattan, märkt med fluorescerande alfa-Bungarotoxin, verkade mindre och fragmenterad i mutanterna av två muslinjer. Kvantifiering av de neuromuskulära korsnings-Z-staplarna med hjälp av de anpassade Image J-makron avslöjade en markant minskning av ändplattans volym, maximal intensitetsprojektion och relativ tortuositet i båda sjukdomsmusmodellerna jämfört med kontroller, vilket indikerar neuromuskulära korsningsmognadsdefekter.Kvantifiering av den presynaptiska axonterminalgrenfördelningen med hjälp av Image J anpassade makro avslöjade ett förändrat mönster i neurofilament M-distribution i de två djurmodellerna med ökad immunmärkning. Genom synaptisk vesikelglykoprotein 2-färgning observerades en 43% minskning av beläggningsgraden för de acetylkolinreceptorinnehållande regionerna med intilliggande nervterminala aktiva zoner i Smn 2B / möss. Aspekten av de neuromuskulära korsningens postsynaptiska ändplattor visualiserades tydligt genom fluorescerande alfa-Bungarotoxinmärkning och intensitetsprofilanalys.Utvärdering av de neuromuskulära korsningsparametrarna avslöjade en ökning av korsningsavståndet och bredden av acetylkolinreceptorremsor i mutanternas gastrocnemiusmuskel. För att få tillförlitliga resultat är det viktigt att reta musklerna ordentligt, med särskild uppmärksamhet på den applicerade styrkan för att separera muskelbuntar. Detta protokoll kan hjälpa till att erhålla en mer djupgående morfologisk karakterisering av neuromuskulär korsning, som tidigare endast stod för komplexa och tidskrävande förfaranden, såsom transmissionselektronmikroskopi.STED-avbildningsförfarandet banade väg för undersökning av nya insikter om pre- och postsynaptiska markörer, som bidrar till patofysiologin för sjukdomar som påverkar neuromuskulär korsning.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Spektral Confocal avbildning av fluorescensmärkta nikotinreceptorer i Knock-in Möss med kronisk Nikotin Administration

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-upplösning avbildning av neurala Tät-core Blåsor

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Den neuromuskulära förbindelsen: Mäta Synapse Storlek, fragmentering och Förändringar i Synaptic Protein Densitet Använda Confocal fluorescensmikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll för Tredimensionell Confocal Morfometrisk Analys av Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Varför kvantifiering Matters: karakterisering av fenotyper vid<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvernas Neuromuskulära förbindelsen

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Extracellulär inspelning av nervaktiviteten Kombinerat med Microiontophoretic Tillämpning av neuroaktiva ämnen i Vakna möss

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

Fibular Nerve Injury Metod: En tillförlitlig analys för att identifiera och testa faktorer som Reparation neuromuskulära korsningar

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Trigg Cell Stress och död med användning av konventionella UV-Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Visualisering och levande avbildning av Oligodendrocyte organeller i Organotypic hjärnan skivor med hjälp av Adeno-associerade Virus och konfokalmikroskopi

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Super-Resolution Imaging att studera samlokalisering av proteiner och synaptiska markörer i primära nervceller

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...