Name: characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy
Uploaded: 2021-12-08T13:00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Genethon'un "Görüntüleme ve Sitometri Çekirdek Tesisi" nin yanı sıra kısmen Ile-de-France Bölgesi, Conseil General de l'Essonne, Evry Genopole Recherche, Evry Val d'Essonne Üniversitesi ve INSERM, Fransa'dan ekipman fonları tarafından desteklenen histoloji servisine teşekkür ederiz. Ayrıca Smn 2B/2B fare hattını (Ottawa Üniversitesi, Kanada) sağladığı için Dr. Rashmi Kothary'ye ve ColQDex2/+ fare çizgisi için Dr. Eric Krejci'ye (yayınlanmamış, Paris Üniversitesi, Fransa) minnettarız. Guillaume Corre'a istatistiksel analizdeki desteği için teşekkür ederiz. 2H3 (Jessel, TM ve Dodd, J. tarafından geliştirilmiştir) ve SV2 (Buckley, K.M. tarafından geliştirilmiştir) monoklonal antikorları, NIH'nin NICHD'si tarafından oluşturulan ve Iowa Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, Iowa City, IA 52242'de sürdürülen Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası'ndan (DSHB) elde edilmiştir. Bu çalışma Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon), INSERM ve Evry Val d'Essonne Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+nerve-muscle+junctions+in+hindlimb+muscles+of+the+mouse.">Postnatal maturation of nerve-muscle junctions in hindlimb muscles of the mouse.</a> Developmental Biology. 94 (1), 11-22 (1982).</li><li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMJ-morph+reveals+principal+components+of+synaptic+morphology+influencing+structure-function+relationships+at+the+neuromuscular+junction.">NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction.</a> Open Biology. 6 (12), (2016).</li><li>Willadt, S., Nash, M., Slater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+the+structure+and+function+of+mammalian+neuromuscular+junctions.">Age-related changes in the structure and function of mammalian neuromuscular junctions.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1412, 41-53 (2018).</li><li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li><li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease.">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li><li>Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+as+a+distal+axonopathy:+molecular+mechanisms+affecting+neuromuscular+junction+stability+in+the+presymptomatic+stages+of+the+disease.">ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, (2014).</li><li>Lovering, R. M., Iyer, S. R., Edwards, B., Davies, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+neuromuscular+junctions+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Alterations of neuromuscular junctions in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuroscience Letters. 737, 135304 (2020).</li><li>Koneczny, I., Herbst, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myasthenia+Gravis:+Pathogenic+effects+of+autoantibodies+on+neuromuscular+architecture.">Myasthenia Gravis: Pathogenic effects of autoantibodies on neuromuscular architecture.</a> Cells. 8 (7), 671 (2019).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubular+myopathy+and+the+neuromuscular+junction:+a+novel+therapeutic+approach+from+mouse+models.">Myotubular myopathy and the neuromuscular junction: a novel therapeutic approach from mouse models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 5 (6), 852-859 (2012).</li><li>Gibbs, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+abnormalities+in+DNM2-related+centronuclear+myopathy.">Neuromuscular junction abnormalities in DNM2-related centronuclear myopathy.</a> Journal of Molecular Medicine. 91 (6), 727-737 (2013).</li><li>Swoboda, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+denervation+in+SMA:+Relation+to+age,+SMN2+copy+number,+and+function.">Natural history of denervation in SMA: Relation to age, SMN2 copy number, and function.</a> Annals of Neurology. 57 (5), 704-712 (2005).</li><li>Rodr&#237;guez Cruz, P. M., Palace, J., Beeson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction+and+wide+heterogeneity+of+congenital+myasthenic+syndromes.">The neuromuscular junction and wide heterogeneity of congenital myasthenic syndromes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1677 (2018).</li><li>Tse, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction:+Measuring+synapse+size,+fragmentation+and+changes+in+synaptic+protein+density+using+confocal+fluorescence+microscopy.">The neuromuscular junction: Measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52220 (2014).</li><li>Mejia Maza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMJ-Analyser+identifies+subtle+early+changes+in+mouse+models+of+neuromuscular+disease.">NMJ-Analyser identifies subtle early changes in mouse models of neuromuscular disease.</a> Scientific Reports. 11 (1), 12251 (2021).</li><li>Minty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aNMJ-morph:+a+simple+macro+for+rapid+analysis+of+neuromuscular+junction+morphology.">aNMJ-morph: a simple macro for rapid analysis of neuromuscular junction morphology.</a> Royal Society Open Science. 7 (4), 200128 (2020).</li><li>Modla, S., Mendonca, J., Czymmek, K. J., Akins, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neuromuscular+junctions+by+correlative+confocal+and+transmission+electron+microscopy.">Identification of neuromuscular junctions by correlative confocal and transmission electron microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 191 (2), 158-165 (2010).</li><li>Kittel, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+promotes+active+zone+assembly,+Ca2++channel+clustering,+and+vesicle+release.">Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release.</a> Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).</li><li>York, A. L., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+a+nanoscale+organization+of+acetylcholine+receptors+for+trans-synaptic+alignment+at+neuromuscular+synapses.">Super-resolution microscopy reveals a nanoscale organization of acetylcholine receptors for trans-synaptic alignment at neuromuscular synapses.</a> eNeuro. 4 (4), (2017).</li><li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology.">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (3), 263-276 (2012).</li><li>Feng, G., Krejci, E., Molgo, J., Cunningham, J. M., Massouli&#233;, J., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+collagen+Q:+Roles+in+acetylcholinesterase+and+butyrylcholinesterase+assembly+and+in+synaptic+structure+and+function.">Genetic analysis of collagen Q: Roles in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase assembly and in synaptic structure and function.</a> Journal of Cell Biology. 144 (6), 1349-1360 (1999).</li><li>Sigoillot, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+immaturity+and+muscle+atrophy+are+hallmarks+of+the+ColQ-deficient+mouse,+a+model+of+congenital+myasthenic+syndrome+with+acetylcholinesterase+deficiency.">Neuromuscular junction immaturity and muscle atrophy are hallmarks of the ColQ-deficient mouse, a model of congenital myasthenic syndrome with acetylcholinesterase deficiency.</a> The FASEB Journal. 30 (6), 2382-2399 (2016).</li><li>Vanhaesebrouck, A. E., Beeson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+congenital+myasthenic+syndromes:+expanding+genetic+and+phenotypic+spectrums+and+refining+treatment+strategies.">The congenital myasthenic syndromes: expanding genetic and phenotypic spectrums and refining treatment strategies.</a> Current Opinion in Neurology. 32 (5), 696-703 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Legland, D., Beaugrand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+clustering+of+lignocellulosic+fibres+based+on+morphometric+features+and+using+clustering+of+variables.">Automated clustering of lignocellulosic fibres based on morphometric features and using clustering of variables.</a> Industrial Crops and Products. 45, 253-261 (2013).</li><li>. GitHUb Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/Genethon/ImCy">https://github.com/Genethon/ImCy</a> (2021)</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">A Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction,+assembly,+maturation+and+maintenance+of+a+postsynaptic+apparatus.">Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus.</a> Nature Reviews Neuroscience. 2 (11), 791-805 (2001).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+synaptic+vesicle+release+and+immaturity+of+neuromuscular+junctions+in+spinal+muscular+atrophy+mice.">Impaired synaptic vesicle release and immaturity of neuromuscular junctions in spinal muscular atrophy mice.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (3), 842-851 (2009).</li><li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Human Molecular Genetics. 11 (12), 1439-1447 (2002).</li><li>Murray, L. M., Comley, L. H., Thomson, D., Parkinson, N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 17 (7), 949-962 (2008).</li><li>Boyer, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+program+dysregulation+is+contributory+to+disease+pathogenesis+in+spinal+muscular+atrophy.">Myogenic program dysregulation is contributory to disease pathogenesis in spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 23 (16), 4249-4259 (2014).</li><li>Ling, K. K. Y., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 21 (1), 185-195 (2012).</li><li>Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+transversus+abdominis+muscle+for+whole-mount+neuromuscular+junction+analysis.">Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51162 (2014).</li><li>Baker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , (1958).</li><li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+Nanoscopy+with+time-gated+detection:+Theoretical+and+experimental+aspects.">STED Nanoscopy with time-gated detection: Theoretical and experimental aspects.</a> PLoS ONE. 8 (1), 054421 (2013).</li><li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses.">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).</li><li>Thomson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characteristics+of+motor+neurons+do+not+determine+their+relative+susceptibility+to+degeneration+in+a+mouse+model+of+severe+spinal+muscular+atrophy.">Morphological characteristics of motor neurons do not determine their relative susceptibility to degeneration in a mouse model of severe spinal muscular atrophy.</a> PLoS ONE. 7 (12), 052605 (2012).</li><li>McMacken, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salbutamol+modifies+the+neuromuscular+junction+in+a+mouse+model+of+ColQ+myasthenic+syndrome.">Salbutamol modifies the neuromuscular junction in a mouse model of ColQ myasthenic syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 28 (14), 2339-2351 (2019).</li></ol>

Yazarlar bu çalışma ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Açıklanan video protokolü, sinaptik öncesi ve sonrası seviyelerde patolojik değişiklikleri karakterize etmek için kullanılabilecek konfokal ve STED mikroskopiyi birleştirerek nöromüsküler kavşakların 3D yapısını ölçmek için ayrıntılı bir yöntem sağlar. STED mikroskobunun yüksek çözünürlüğü, geleneksel konfokal görüntüleme ile tanımlanamayan nanoyapıların görselleştirilmesine ve morfometrik analizine izin verir. Bu prosedür, SMA ve ColQ ile ilişkili CMS farelerinin tibialis anterior ve gastroknemius olmak üzere iki apandiküler kastaki NMJ'lerin yapısal değişikliklerini ölçmemizi sağladı.
Bu teknikle güvenilir sonuçlar elde etmek için, kasları düzgün bir şekilde parçalamak ve kızdırmak, kası çevreleyen fasyaya ve kas demetlerini ayırmak için uygulanan güce özellikle dikkat etmek çok önemlidir; Aksi takdirde, innervasyon paterni bozulabilir ve uygun presinaptik NMJ değerlendirmesini engelleyebilir. NMJ'leri TA ve GA'dan analiz etmek için ayrıntılı bilgi sağlanmasına rağmen, prensip olarak, bu protokol, diyafram veya enine abdominis37 gibi düz kaslar da dahil olmak üzere diğer kaslara uyarlanabilir. Doku fiksasyonu, kaliteli boyama sağlamak için de çok önemlidir; bu nedenle, uygun bir hacimde (kasın 15-20 katı) yüksek kaliteli PFA kullanılması önerilir. Ek olarak, fiksatif maruz kalma süresi önemli bir adımdır, çünkü büzülme ve kümelenme gibi artefaktlar aşırı fiksasyon nedeniyle ortaya çıkabilir ve NMJ özelliklerini etkileyebilir. Numunelerin büyüklüğü ve paraformaldehit çözeltisinin dokulardaki penetrasyon hızı38 göz önüne alındığında, bu tip kas için 18-24 saatlik bir fiksasyon süresi önerilir. Boyama adımının doku hasadından bir haftadan fazla bir süre sonra planlanması durumunda, bakteriyel çoğalmayı önlemek için PBS'de PFA ile sabitlenmiş kasların sodyum azid ile desteklenmiş 4 ° C'de tutulması önerilir.
Bu protokol, konfokal için α-BTX-F488 ve STED görüntüleme için α-BTX-F633 kullanan bir yaklaşım sunar. Bu floroforlar, tarif edilen deneysel tasarıma uyacak şekilde seçilmiştir, ancak mevcut ekipman ve malzemelere göre değiştirilebilir. Örneğin, görüntü alma ve niceleme için STED CW 592 nm lazer kullanılırken α-BTX F488 etiketleme seçilebilir. Bununla birlikte, bu çalışmada uygulanan konfigürasyonun (darbeli uyarma kapılı STED, 775 nm tükenme) sürekli dalga STED39 gibi diğer yaklaşımlardan daha yüksek performans ve daha iyi çözünürlük sergilediği ve mevcut uygulama için daha uygun hale getirdiği görülmektedir. Özellikle STED (hem uyarma hem de tükenme) için lazer güç ayarlarının dikkatlice seçilmesi de önemlidir, çünkü bir yoğunluk profilinin özellikleri doygunluk durumunda ölçülemez ve bu nedenle bir NMJ görüntüsündeki herhangi bir doymuş sinyal tüm analizi tehlikeye atabilir.
Mikroskop yazılımı ve ImageJ makroları kullanılarak görüntü yakalama ve analiz dahil olmak üzere bu ayrıntılı iş akışı, tek bir kastan konfokal ve STED mikroskobu ile otonom NMJ morfometrik analizini kolaylaştırmak için geliştirilmiştir. NMJ-morph2 veya NMJ-Analyser14 gibi NMJ konfokal analizi için daha önce tanımlanmış iş akışları, NMJ'lerin morfolojik analizini ve karşılaştırmalı çalışmaları kolaylaştıran yarı otomatik yöntemlerin tasarımının yolunu açtı. NMJ-morph (ve güncellenmiş sürümü aNMJ-morph15), 21 morfolojik özelliği ölçmek için maksimum yoğunluk projeksiyonunu kullanan ücretsiz bir ImageJ tabanlı platformdur ve NMJ-Analyser, Python'da geliştirilen ve tüm 3D NMJ yapısından 29 ilgili parametre üreten bir komut dosyası kullanır. El ile eşikleme, kullanıcı analizi gerektiren bu iki yöntemde görüntü işleme sırasında tek adımdır. Bu entegre protokol, doku hazırlama, 3D konfokal görüntü alımları ve tüm iskelet kaslarından NMJ'lerin ImageJ tabanlı işlenmesi için adımları detaylandırır ve postsinaptik (hacim, maksimum projeksiyon alanı ve kıvrımlılık) ve presinaptik (akson terminal doluluk ve nörofilament birikimi) uç plakalarının beş önemli parametresine basitleştirilmiş bir genel bakış sağlar. Ek bir biyolojik alaka parametresi olan postsinaptik bileşke kıvrımlarının AChR organizasyon paterni, süper çözünürlüklü STED mikroskopisi (çözünürlük 20-30 nm)40 ile nano ölçekte morfometrik analiz için dahil edilmiştir. İlginçtir ki, STED görüntüleme için doku hazırlığı, NMJ ultrastrüktürel çalışmaları için kullanılan geleneksel transmisyon elektron mikroskobu (TEM)9 gibi diğer yöntemlerden daha basittir; bu, uygun kas bölgesinin ultra ince kesitlerini elde etmek için yetenekli bir manipülatör gerektiren oldukça karmaşık ve zaman alıcı bir prosedürdür. Ek olarak, çoklu bağlantı kıvrımlarından elde edilen nicel veriler, STED ile ilişkili yazılım kullanılarak otomatik olarak elde edilebilir.
Bu protokol, SMN ve ColQ eksikliği olan kaslarda20,36,41,42 daha önce bilinen NMJ defektlerini göstermek için uygulandı. İki fare modelinde konfokal mikroskopi ile postsinaptik uç plaka hacminin azalması, MIP alanı ve göreceli kıvrımlılık ve artmış nörofilament birikimi gibi yaygın değişiklikler bulunurken, bazı daha spesifik bulgular (azalmış NMJ doluluğu), bozulmuş vezikül kaçakçılığının bir göstergesi olarak sadece SMA farelerde gözlenmiştir36. Son olarak, daha önce TEM20 tarafından gözlemlendiği gibi, postsinaptik bileşke kıvrımlarındaki ultrayapısal kusurların belirtileri olan STED analizi ile ColQ-KO'da AChR şerit mesafesi ve genişliğinde bir artış tespit edildi. Önemli olarak, bu protokol gelişim, bakım sırasında ve çeşitli patolojik koşullar altında nöromüsküler kavşakların daha derinlemesine morfolojik karakterizasyonuna yardımcı olabilir.

Nöromüsküler bileşke (NMJ), bir motor akson terminali, bir perisinaptik Schwann hücresi ve kimyasal bilginin iletilmesinde ve alt motor nöron aktivitesinin kas kasılmasına bağlanmasında rol oynayan iskeletsel bir miyofiber kısmından oluşan karmaşık bir yapıdır. Memelilerde, nöromüsküler kavşağın morfolojisi gelişim sırasında değişir, olgunlaşmadan sonra tipik bir simit benzeri şekil benimser, türler arasında şekil ve karmaşıklık farklılıkları vardır ve egzersiz veya yaşlanma gibi fizyolojik süreçlere yanıt olarak bir dereceye kadar plastisite gösterir 1,2,3,4 . Postsinaptik motor uç plakası, asetilkolin reseptörleri (AChR) içeren üst kısmın presinaptik terminal akson dal5 ile yakın temas halinde olduğu bileşke kıvrımları adı verilen membran invaginasyonları oluşturur.
Nöromüsküler kavşaklardaki morfolojik ve fonksiyonel değişiklikler, spinal müsküler atrofi (SMA) ve amiyotrofik lateral skleroz (ALS), Duchenne musküler distrofisi (DMD), konjenital miyastenik sendromlar (CMS), myastenia gravis (MG) ve sentronükleer miyopatiler (CNM) gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıkların patofizyolojisine katkıda bulunur ve yaşlanmaya bağlı sarkopeni 3,6,7,8,9, 10,11,12. Bu hastalıklarda son plaka parçalanması, postsinaptik bileşke kıvrım boyutunda azalma ve/veya denervasyon gibi NMJ yapısal değişiklikleri gözlenir. NMJ'lerin patolojisi, hastalığın ilerlemesi sırasında birincil veya erken bir olay olabilir veya klinik bulgulara katkıda bulunan ikincil bir olay olarak daha geç ortaya çıkabilir. Her durumda, bu hastalıkların hayvan modellerinde NMJ'lerin morfolojisinin izlenmesi, patolojik değişiklikleri incelemek ve potansiyel tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için değerli bir parametreyi temsil eder.
Nöromüsküler kavşakların morfolojisi genellikle konfokal mikroskopi 2,13,14,15 veya elektron mikroskobu 5,16 kullanılarak tekniklerle, sırasıyla çözünürlük veya teknik zorluklar gibi doğal sınırlamalarıyla analiz edilir. Daha yakın zamanlarda, süper-çözünürlüklü mikroskopi, elektron mikroskobu ile ultrayapısal analize alternatif veya tamamlayıcı bir yaklaşım olarak, presinaptik aktif bölgeler veya postsinaptik membran16,17,18 üzerindeki AChR dağılımı gibi NMJ'nin belirli bölgelerini görselleştirmek için de kullanılmıştır.
Bu protokol, floresan konfokal ve uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskopisini birleştirerek NMJ morfolojik parametrelerini değerlendirmek için ayrıntılı ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır. Presinaptik ve postsinaptik uç plakaların hacim, alan, göreceli kıvrımlılık, AChR şerit genişliği ve fare gastroknemius ve tibialis anteriorunun innerve alaylı kas liflerindeki akson terminal dağılımı gibi önemli özellikleri normal ve hastalıklı durumlar bağlamında ölçüldü. Özellikle, NMJ defektleri, SMN1 geni 11,19'daki mutasyonların neden olduğu motor nöron dejenerasyonu olan bir nöromüsküler hastalık olan spinal müsküler atrofinin Smn2B / - fare modelinde ve konjenital miyastenik sendrom20'nin bir modeli olarak asimetrik asetilkolinesteraz nakavtının (ColQ Dex2 / Dex2 veya ColQ-KO) kollajen benzeri bir kuyruk alt biriminde örneklendirilmiştir. 21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Buffers and Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (F488)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488 &#945;-bungarotoxin (F488-a-BTX)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>B13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (F594)</td>
			<td>Life Technologies, Thermofisher</td>
			<td>A-11032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATTO-633 &#945;-bungarotoxin (F633-a-BTX)</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-100-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS</td>
			<td>Gibco, Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol Absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immersion Oil, n = 1.518</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>MOIL-10LF&#160;</td>
			<td>Low autofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurofilament (NF-M) antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_531793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.04005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Synaptic vesicle glycoprotein 2 (SV2) antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_2315387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alnico Button cylindrical magnets</td>
			<td>Farnell France</td>
			<td>E822</td>
			<td>diameter of 19.1 mm with maximal pull of 1.9 Kg</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >63x 1.4 NA magnitude oil immersion&#160; HCX Plan Apo CS objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Curved thin forceps-Moria iris forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra thin scissors - Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15-003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel loading tip round 1-200 &#181;L</td>
			<td>COSTAR</td>
			<td>4853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica laser-scanning confocal microscope TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Laser-scanning confocal microscope TCS SP8 Gated STED 775 nm</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens Cleaning Tissue&#160;</td>
			<td>Whatman (GE Healthcare)</td>
			<td>2105-841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium serrated forceps</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>P-95-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope cover glasses 24x50 nm No 1.5H 170&#177;5 &#181;m</td>
			<td>Marienfield</td>
			<td>107222</td>
			<td>High precision</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (12-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunclon delta surface (24-well plates)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safeshield scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>02.001.40.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sharp-blunt scissors - fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost plus slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GraphPad&#160;</td>
			<td>Prism, San Diego (US)</td>
			<td>Release N&#176;6.07</td>
			<td>Statistical software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Release N&#176; 1.53f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Release N&#176;3.7.2.2283</td>
			<td >Free microscope software available at https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy

Nöromüsküler kavşaklar (NMJ'ler), moleküllerin sinir sisteminden gönüllü kaslara iletilmesinde önemli bir rol oynayan ve kasılmaya yol açan alt motor nöronlar ve iskelet kası lifleri arasındaki oldukça uzmanlaşmış sinapslardır. Duchenne musküler distrofisi (DMD), konjenital miyastenik sendromlar (CMS), spinal müsküler atrofi (SMA) ve amiyotrofik lateral skleroz (ALS) gibi kalıtsal nöromüsküler bozukluklar dahil olmak üzere birçok insan hastalığında etkilenirler. Bu nedenle, nöromüsküler kavşakların morfolojisinin ve hastalık fare modellerindeki değişikliklerinin izlenmesi, patolojik çalışmalar ve terapötik yaklaşımların klinik öncesi değerlendirmesi için değerli bir araçtır. Burada, murin ile alay edilen kas liflerinden motor uç plakalarının ön ve postsinaptik kısımlarının üç boyutlu (3D) morfolojisini etiketleme ve analiz etme yöntemleri açıklanmaktadır. Konfokal görüntüleme ile numune hazırlama ve NMJ hacmi, alanı, kıvrımlılığı ve akson terminal morfolojisi/doluluğunu ölçme prosedürleri ve süper çözünürlüklü uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu ile postsinaptik bileşke kıvrımları ile asetilkolin reseptörü (AChR) şerit genişliği arasındaki mesafe detaylandırılmıştır. Bu NMJ parametrelerindeki değişiklikler, SMA ve CMS'den etkilenen mutant farelerde gösterilmiştir.

Nöromüsküler kavşakların pre- ve postsinaptik düzeyde morfolojik analizini tekrarlanabilir bir şekilde kolaylaştırmak için, mikroskop yazılımı ve ImageJ özel makroları kullanılarak kas hasadından görüntüleme ve nicelemeye kadar bir iş akışı geliştirilmiştir (Şekil 1). Bu protokolün yararlılığını örneklemek için, sırasıyla spinal müsküler atrofi (SMA) ve konjenital miyastenik sendrom (CMS) formundan etkilenen Smn2B / - ve ColQDex2 / Dex2 fareleri genetik bozuklukların iki fare modelinde NMJ'lerin morfolojisi değerlendirildi ve veriler yaşa uygun kontrol çöp arkadaşlarıyla karşılaştırıldı.
NMJ yapısı, bu hayvanlarda hastalık belirtileri zaten mevcut olduğunda, sırasıyla 3 ve 6 haftalık Smn2B / - (C57Bl / 6 arka plan) ve ColQDex2 / Dex2 (B6D2F1 / J arka plan) farelerinin tibialis anterior ve gastroknemius kaslarından değerlendirildi. 3 haftalıkken, Smn2B / - fareleri, NMJ atrofisi ve kaybı35,36 gibi gecikmiş iskelet kası gelişimi ve denervasyon belirtileri gösterir. CMS fareleri, NMJ'lerde birincil bir patolojiye sahiptir ve yaşamın ilk haftasından itibaren vücut ağırlığında bir azalma ve belirgin kas zayıflığı20 (veriler gösterilmemiştir) gösterir. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, floresan α-bungarotoksin ile etiketlenmiş postsinaptik motor uç plakası, konfokal mikroskopi ile iki fare çizgisinin mutantlarında daha küçük ve / veya parçalanmış olarak ortaya çıkmıştır. Bu özelleştirilmiş ImageJ makroları kullanılarak NMJ Z-yığınlarının nicelleştirilmesi, NMJ olgunlaşma kusurlarının belirtileri olarak kontrollere kıyasla hem SMA hem de CMS farelerinde uç plaka hacminde, maksimum yoğunluk projeksiyonunda (MIP) ve göreceli kıvrımda belirgin düşüşler olduğunu ortaya koymuştur32 (Şekil 2B-D). Postsinaptik uç plaka hacmi ve MIP, hastalıklı hayvanlarda azalmıştır (sırasıyla Smn2B / - ve ColQDex2 / Dex2 farelerde hacim için 2.7 ve 2.0 ve MIP için 2.5 ve 2.0'lık katlama değişimi). Göreceli kıvrımlılık SMN ve ColQ eksikliği olan kaslarda WT'den daha küçüktü (SMA'da% 16.97 ±% 1.33, % 48.84 ±% 5.90 WT fareleri ve% 13.29 ±% 2.79 CMS'de% 30.20 ±% 4.44 kontrol faresi). Ek olarak, ImageJ özel makrosu kullanılarak presinaptik akson terminal dallarının dağılımının nicelleştirilmesi, iki hayvan modelinde nörofilament M dağılımında değişmiş bir model ortaya koymuştur ve immünoetiketleme artmıştır (sırasıyla kontrollere kıyasla Smn2B / - ve ColQDex2 / Dex2 farelerinde% 16.57'ye% 84.65 ±% 0.32 ve% 23.64 ±% 2.78'e karşı% 18.77 ±% 18.77 ±% 1.73) (Şekil 3A-D ). SV2 boyama ile, doluluk oranında% 43'lük bir azalma, yani bitişik sinir terminali aktif bölgelerine sahip AChR içeren bölgelerin yüzdesi, Smn2B / - farelerde de gözlenmiştir (SMA'da% 49.36 ±% 3.76, % 85.69 ±% 2.34 WT fareleri) (Şekil 3E, F). Bu NMJ parametresi ColQDex2 / Dex2 mutantlarının GA'sında da hesaplanmıştır, ancak kontrol çöp arkadaşlarına kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamıştır (veriler gösterilmemiştir).
Ayrıca, birleşme kıvrımları arasındaki mesafeyi ve bu kıvrımların tepesinde bulunan AChR çizgilerinin genişliğini, süper çözünürlüklü uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu kullanarak ColQ eksikliği olan kaslarda ölçerek postsinaptik membran özelliklerini analiz ettik. Şekil 4'te gösterildiği gibi, bu yapıların yönü floresan α-bungarotoksin etiketleme ve yoğunluk profili analizi ile açıkça görselleştirilebilir. Bu NMJ parametrelerini değerlendirdik ve mutantların gastroknemius kasında AChR çizgilerinin birleşim kıvrım mesafesi (d) ve genişliğinde (w) bir artış bulduk (358.3 nm ± 11.97 nm ve 320.8 nm ± mesafe için 10.90 nm ve 216.9 nm ± 10.51 nm ve 186.3 nm ± 7.015 nm, ColQDex2 / Dex2'de vahşi tip farelere kıyasla, sırasıyla, p < 0.05) (Şekil 4C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig01.jpg"> Şekil 1: Konfokal ve STED mikroskopi ile 3D çok ölçekli NMJ karakterizasyonu için video protokolünün akış şeması. Tibialis anterior (TA) ve gastroknemius (GA) kasları farelerden toplandı ve kas lifleri, α-bungarotoksin-F488 veya α-bungarotoksin-F633, DAPI, nörofilament M (NF-M) ve sinaptik vezikül glikoprotein 2 (SV2) ve florofor (F488 veya F594) konjuge sekonjuge sekonjene antikorlara karşı yönlendirilen primer antikorlarla etiketlenmeden önce alay edildi. Görüntü yığınları konfokal mikroskopi ile elde edildi ve postsinaptik NMJ hacmini, presinaptik NF-M birikimini, NMJ akson terminal doluluğunu, postsinaptik maksimum yoğunluk projeksiyonu (MIP) uç plaka alanını ve kıvrımlılığı ölçmek için işlendi (dObj (AB), nesnenin çevresi boyunca A ve B arasındaki mesafedir (kırmızı çizgi), dEuc (AB) A ve B arasındaki Öklid uzaklığıdır (yeşil çizgi)). STED mikroskopi analizi için, asetilkolin reseptörü (AChR) çizgilerinin genişliği ve birleşim kıvrımları arasındaki mesafe, α-BTX-F633 boyamasının yoğunluk profillerinden ölçülmüştür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig02.jpg"> Şekil 2: Spinal müsküler atrofi (SMA) ve ColQ ile ilişkili konjenital miyastenik sendromun (CMS) fare modellerinde çok parametreli postsinaptik NMJ karakterizasyonu. (A) α-bungarotoksin-F488 (α-BTX) ile etiketlenmiş TA ve GA kaslarından postsinaptik motor uç plakaların temsili görüntüleri. (B) NMJ postsinaptik uç plaka hacminin miktarı, (C) maksimum yoğunluk projeksiyonu (MIP) alanı ve (D) 3 haftalık vahşi tip (WT) ve Smn2B/- farelerin TA'daki nispi kıvrımlılığı (sol grafikler, genotip başına N = 3 hayvan, sırasıyla n = 37 ve n = 56 NMJ) ve 6 haftalık WT ve ColQ Dex2 / Dex2 fareler (sağ grafikler, genotip başına N = 5 fare, sırasıyla n = 89 ve n = 97 NMJ). Veriler fare (nokta) başına ortalama SEM ± olarak ifade edilmiştir. Gruplar arasındaki farklılıklar Mann-Whitney testi ile analiz edilmiştir (* p < 0.05). Ölçek çubuğu 10 μm'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig03.jpg"> Şekil 3: WT ve mutant farelerin kaslarında presinaptik akson terminal dağılımının morfometrik analizi. Vahşi tip, SMA ve ColQ ile ilişkili CMS farelerin tibialis anterior (TA) ve gastroknemius (GA) kaslarında NMJ innervasyon paterni. (A, B) Nörofilament M (NF-M, kırmızı) ve α-bungarotoksin-F488 (α-BTX, yeşil) (A) karşı antikorlarla etiketlenmiş 21 günlük WT ve Smn2B / - farelerin TA'sından temsili nöromüsküler kavşaklar ve nörofilament birikiminin kantitatif analizinden elde edilen sonuçlar (B); (C, D) Nörofilament M (NF-M, kırmızı) ve α-bungarotoksin-F488'e (α-BTX, yeşil) karşı antikorlarla etiketlenmiş 6 haftalık WT ve ColQDex2 / Dex2 farelerinin GA'sından temsili nöromüsküler kavşaklar, parçalanmış ve olgunlaşmamış postsinaptik uç plakaları (C) ve iki hayvan grubunda nörofilament birikiminin sonuçlarını (D) göstermektedir. Deneylerde N=4 (n=34 NMJ) (B) ve N = 3 (n = 54 NMJ) (D) WT hayvanları ve N = 3 (n = 36 NMJ) Smn2B / - ve N = 3 (n = 55 NMJ) ColQ Dex2 / Dex2 fareleri analiz edildi (B, D). (E, F) Sinaptik vezikül glikoprotein 2 (SV2, kırmızı) ve α-bungarotoksin-F488 (α-BTX, yeşil) (E) karşı antikorlarla etiketlenmiş 3 haftalık WT ve Smn2B / - farelerin TA'sından NMJ'lerde akson terminal doluluğunun temsili görüntüleri ve NMJ doluluk sonuçları (SV2 / AChR hacim oranı) (F). N = 3 (n = 50 NMJ) vahşi tip ve N = 4 (n = 62 NMJ) Smn2B / - farelerden gelen kaslar analiz edildi. Veriler fare (nokta) başına ortalama değer SEM ± olarak ifade edilmiştir. Gruplar arasındaki farklar Mann-Whitney testi ile analiz edilmiştir (* p < 0.05). Ölçek çubukları 20 μm'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig04.jpg"> Şekil 4: NMJ postsinaptik uç plakalarının STED görüntülemesi. (A) Postjunctional AChR çizgilerini gösteren 6 haftalık vahşi tip bir farenin gastroknemisinden α-bungarotoksin-F633 (α-BTX) ile etiketlenmiş bir NMJ'nin temsili STED görüntüsü (ölçek çubuğu 5 μm'dir). (B) Yoğunluk profilini oluşturmak için kullanılan AChR çizgili (alt panel) bir bölgenin daha yüksek büyütülmesi. AChR çizgilerinin genişliği (w) ve bu bölgenin iki bitişik şeridi (d) arasındaki mesafe ölçülmüş ve çubuk grafikte sunulmuştur. AChR şerit genişliğini (w) ve mesafeyi (d) göstermek için postsinaptik uç plakanın şematik gösterimi. Bu parametreler, (C) AChR şerit mesafesi ve (D) genişliği, ColQDex2 / Dex2 farelerinde ölçüldü ve 6 haftalıkken çöp arkadaşlarını kontrol etti. 5 WT (toplam n = 29 NMJ) ve 6 ColQDex2 / Dex2 (toplam n = 43 NMJ) hayvanından NMJ'ler körü körüne analiz edildi. Veriler fare başına ortalama (nokta) ± SEM olarak ifade edilmiştir. Gruplar arasındaki istatistiksel farklılıklar Mann-Whitney testi kullanılarak analiz edilmiştir (* p < 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: LAS X yazılımının ve konfokal edinimler için parametrelerin piyasaya sürülmesi. Konfokal görüntüler elde etmek için çeşitli adımlar, protokolün 3.1.2 ila 3.1.7 bölümlerinde açıklanmıştır. Her NMJ yığın alımı için bir proje açılır (adım 3.1.4) ve görüntü boyutu, alma hızı, X, Y ve Z eksenleri parametreleri seçilir (adım 3.1.7), her sıralı tarama belirtilir (SEQ.1, DAPI için lazer 405; Seq.2, α-BTX-F488 için lazer 488; ve Seq.3, F594 konjuge sekonjuge sekonder antikorlar için lazer 552). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil 2: LAS X yazılımının lansmanı ve STED alımları için parametreler. STED görüntülerini edinme adımları, protokolün 3.2.2 ila 3.2.8 bölümlerinde açıklanmıştır. Mikroskop STED ON yapılandırma modunda başlatılır (adım 3.2.2) ve bir proje açılır (adım 3.2.3). Her sıralı taramada görüntü alma parametreleri (adım 3.2.7) (görüntü boyutu, yakalama hızı, Yakınlaştırma faktörü, X ekseni) belirtilir (α-BTX-F633 için Seq.1; F488 konjuge sekonjuge sekonder antikorlar için Seq.2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%202.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil 3: STED mikroskobu ile elde edilen α-BTX boyalı bileşke kıvrımlarının görüntüleri. Doğru (sol) veya yanlış bir odaklanma (sağ) ile edinilen 6 haftalık vahşi tip bir fareden α-BTX-F633 ile etiketlenmiş bir postsinaptik uç plakanın görüntü örnekleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%203.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil 4: Özel ImageJ makroları tarafından elde edilen giriş ve çıkış verilerini açıklayan Windows açılır pencereleri. NMJ görüntülerinin giriş verisi örnekleri (.tif ve .lif dosyaları) sol sütunda gösterilir. Makrolardan (sağ sütun) alınan çıktı verileri, birleşim resimlerini (Save_Volume) içeren klasörlere (Save_Accu, .tif) ve sonuçları içeren veri sayfalarına (.csv dosyaları) kaydedilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%204.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Şekil 5: LAS X yazılımı kullanılarak STED alımından AChR şerit mesafesi ve genişliği analizi. NMJ STED görüntülerini analiz etme adımları protokolün 5. bölümünde açıklanmıştır. A) AChR çizgileri içeren etiketli bir postsinaptik uç plaka bölgesinin görüntüsü. Şerit analizi için ilgi alanı, dikey bir çizgi (şerit mesafesi için yeşil çizgi) veya dikey bir dikdörtgen (şerit genişliği için mor dikdörtgen) çizilerek seçilir. (B, C) AChR şeritleri (B) ile AChR şerit genişliği (C) arasındaki mesafeyi hesaplamak için seçilen bölgelerin yoğunluk profilleri ve ölçümleri gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%205.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Kodlama Dosyası 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. NMJ parametre ölçümlerini (NMJ hacmi, MIP uç plaka alanı ve NMJ kıvrımlılığı) ayıklamak için ImageJ özel makrosu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Kodlama Dosyası 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. NF-M birikimini ve SV2 boyamasını ayıklamak için ImageJ özel makrosu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy at JoVE.com

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Bu protokol, SMA ve ColQ ile ilişkili CMS'nin fare modellerindeki patolojik değişiklikleri ölçmek için kullanılan kombine konfokal ve STED mikroskopisi ile nöromüsküler kavşakların morfometrik analizi için bir yöntemi açıklamaktadır.

Farelerde Nöromüsküler Kavşakların Kombine Konfokal ve Süper Redüksiyonlu Mikroskopi ile Karakterizasyonu

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Bu protokol, basit bir prosedür kullanarak nöromüsküler kavşakların 3D yapısını elektron mikroskobuna yakın bir çözünürlükte nicel olarak analiz etmeye yardımcı olur. Bu protokolün temel avantajı, kas örneklerinin benzer şekilde işlenmesi ve konfokal ve STED mikroskopisi için immüno-etiketli olmasıdır, bu da hayvan modellerinde doğru nöromüsküler kavşak yapısı değerlendirmesi için zamanı azaltır. Geliştirdiğimiz morfolojik niceleme, diğer hücre altı yapıları analiz etmek için kolayca uyarlanabilir.Kas alaycılığı ve immün boyamaların nasıl yapıldığını gösterecek ve bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için bazı önerilerde bulunacak olan ekibimden bir bilim adamı olan Dr. Martina Marinello'yu tanıtmaktan mutluluk duyuyorum. Genethon'un görüntüleme platformundan Dr. Jeremie Cosette'i tanıtmaktan mutluluk duyuyorum, o da konfokal ve STED mikroskopları kullanarak görüntü toplama ve analiz gösterecek. Ötanizasyon sonrası, iki ince tırtıklı forseps kullanarak tibialis anterior kaslarını yaklaşık bir milimetre genişliğindeki küçük lif demetlerinde alay etmeye başlayın.Daha sonra, bu kas demetlerini PBS'de hazırlanan% 1 Triton X-100 içeren 24 delikli bir plakaya aktarın ve oda sıcaklığında bir saat veya dört santigrat derecede beş saat boyunca hafifçe çalkalanmasını sağlayın. Numuneleri oda sıcaklığında PBS ile beş dakika boyunca üç kez yıkadıktan sonra, numuneleri PBS'de hazırlanan% 4 BSA'dan oluşan bir blokaj çözeltisi ile% 1 Triton X-100 ile dört saat boyunca dört santigrat derecede hafif ajitasyon altında inkübe edin. Daha sonra, sırasıyla presinaptik akson terminallerini veya aktif bölgeleri etiketlemek için numuneleri nörofilament M veya sinaptik vezikül glikoprotein 2'ye karşı birincil monoklonal antikorlar içeren aynı bloke edici çözelti ile gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, etiketli kas demetlerini hafif ajitasyon altında PBS ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra, oda sıcaklığında iki saat boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirerek uygun ikincil antikorlarla inkübe edin. Kas demetlerini tekrar yıkadıktan sonra, montaj ortamına sahip bir slayta yerleştirin.Ardından, üstüne 1,5 dereceli bir cam kapak kayması, ardından basınç uygulamak ve kasları düzleştirmek için slaytın her iki tarafına silindirik mıknatıslar yerleştirin. Konfokal mikroskobu kullanarak görüntü elde etmek için, mikroskop yazılımını başlatın ve yapılandırma modu olarak makineyi seçin ve metin yazısında belirtilen ayarlara göre her deney grubundaki nöromüsküler kavşakların görüntü yığınlarını toplayın. Oturumun sonunda, 3B görüntüleyicide aç'a tıklayın ve 3B etiketlemeyi görselleştirmek için bir deney grubunun nöromüsküler kavşak temsilcisini seçin.Sinaptik sonrası nöromüsküler bağlantı ve plaka hacmini, maksimum yoğunluk projeksiyon alanını ve göreceli kıvrımlılığı hesaplamak için, nöromüsküler birleşim hacmi ölçümü için makroyu sürükleyip Görüntü J penceresine bırakın ve makro ikinci bir pencerede açıldığında, Makrolar ve Makroyu çalıştır'a tıklayın. Analiz edilecek birleşim alt klasörlerini içeren yerel klasörü seçin ve Seç'e tıklayın. Ardından, kaydetme klasörü açılır menüsünde, depolama klasörünü seçin ve Seç'e tıklayın.Görüntü Türü adlı yeni açılır menüde, Z yığını alımlarının biçimini seçin. İlgilenilen lekelenmeye karşılık gelen RGB kanalını seçin ve X, Y piksel boyutu ve Z adımını belirtin. Özel dosya biçimleri seçilirse, makro doğrudan piksel boyutunu ve Z adımını okur.Presinaptik nörofilament birikimini ölçmek için, nöromüsküler birleşim birikimi niceliği için makroyu sürükleyip Görüntü J penceresine bırakın ve Makrolar ve Makroyu çalıştır'a tıklayın. Daha önce gösterildiği gibi birleşim alt klasörlerini, depolama klasörünü ve Z yığını alımlarının biçimini seçin. Ardından, Boyama Bilgileri açılır penceresinde, sinaptik öncesi ve sonrası sinaptik etiketi ve rengi belirtin ve Piksel Boyutu açılır penceresini OK.In tıklayın, X, Y piksel boyutunu 0,072 mikrometre olarak, Z adımını 0,5 mikrometre olarak belirtin ve Tamam'ı tıklayın. Özel dosya biçimleri seçilirse, makro doğrudan piksel boyutunu ve Z adımını okur.Asetilkolin reseptör şeritleri arasındaki mesafeyi hesaplamak için, merkezi pencerenin üstündeki Nicelik menüsünü seçin. Araçlar sekmesine tıklayın, yoğunluğu seçin ve çizgi profili simgesine tıklayın. Aşırı örneklemeyi bir taneye ayarlayın ve Kanalları Sırala'yı işaretleyin.Projeleri Aç sekmesine tıklayın ve analiz edilecek filtrelenmiş görüntüyü seçin. Ardından, çizgi çiz simgesini tıklatın ve dikey olarak birkaç çizgiyi veya birleşim kıvrımlarını kesen bir çizgiyi izleyin. İlk tepe noktasının üstüne tıklayın ve bir sonraki maksimum tepe noktasına ulaşılana kadar farenin sol düğmesine basarken fare işaretçisini hareket ettirin.İki tepe noktası arasındaki mesafeye karşılık gelen DX değerine dikkat edin. Sağ pencerenin görüntüsündeyken fareye sağ tıklayın ve YG'leri Kaydet'i seçin. Ok simgesine tıkladıktan sonra, YG'ye tıklayın ve bin simgesine tıklayarak silin.Asetilkolin reseptör şeridinin genişliğini hesaplamak için, araçlar sekmesinin altındaki sol üst panelde yoğunluğu seçin, FWHM'yi belirle simgesine tıklayın ve sıralama kanallarını işaretleyin. Ardından Projeleri Aç sekmesine tıklayın ve analiz edilecek filtrelenmiş görüntüyü seçin. Ardından, sağ pencerenin üst menüsündeki dikdörtgen çiz simgesine tıklayın.Yatay veya dikey bir şerit seçin ve şeride dik olarak bir dikdörtgen çizin. Orta pencerede bir profil görünür. Sol panelde bulunan Ortalama Projeksiyon menüsünün dikey veya yatay olmasına bağlı olarak, şerit yönünün dikey veya yatay olmasına bağlı olarak tıklayın.FWHM değerini okumak için orta penceredeki İstatistikler'e tıklayın ve ardından YG'leri daha önce gösterildiği gibi kaydedin ve silin. Floresan alfa-Bungarotoksin ile etiketlenmiş post-sinaptik motor uç plakası, iki fare çizgisinin mutantlarında daha küçük ve parçalanmış görünüyordu. Özelleştirilmiş Image J makroları kullanılarak nöromüsküler bileşke Z yığınlarının nicelleştirilmesi, her iki hastalık fare modelinde kontrollere kıyasla uç plaka hacminde, maksimum yoğunluk projeksiyonunda ve göreceli kıvrımda belirgin bir azalma olduğunu ortaya koymuştur ve nöromüsküler kavşak olgunlaşma kusurlarını göstermektedir.Image J özel makrosu kullanılarak presinaptik akson terminal dal dağılımının ölçülmesi, immünoetiketlemenin arttığı iki hayvan modelinde nörofilament M dağılımında değişmiş bir model ortaya çıkardı. Sinaptik vezikül glikoprotein 2 boyama yoluyla, Smn 2B / farelerde bitişik sinir terminali aktif bölgeleri olan asetilkolin reseptörü içeren bölgelerin doluluk oranında% 43'lük bir azalma gözlenmiştir. Nöromüsküler bileşke sonrası sinaptik uç plakalarının yönü, floresan alfa-Bungarotoksin etiketlemesi ve yoğunluk profili analizi ile açıkça görselleştirildi.Nöromüsküler bileşke parametrelerinin değerlendirilmesi, mutantların gastroknemius kasındaki asetilkolin reseptör şeritlerinin bileşke mesafesi ve genişliğinde bir artış olduğunu ortaya koydu. Güvenilir sonuçlar elde etmek için, kasları düzgün bir şekilde kızdırmak, kas demetlerini ayırmak için uygulanan güce özellikle dikkat etmek çok önemlidir. Bu protokol, daha önce sadece iletim elektron mikroskobu gibi karmaşık ve zaman alıcı prosedürlerle açıklanan nöromüsküler kavşağın daha derinlemesine morfolojik karakterizasyonunun elde edilmesine yardımcı olabilir.STED görüntüleme prosedürü, nöromüsküler kavşağı etkileyen hastalıkların patofizyolojisine katkıda bulunan sinaptik öncesi ve sonrası belirteçlerle ilgili yeni anlayışların araştırılmasının yolunu açmıştır.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Kronik Nikotin İdaresi fareler Knock-in içinde floresan etiketli Nikotinik Reseptör Spektral Konfokal Görüntüleme

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Nöronal Yoğun çekirdekli Keseciklerinde süper çözünürlüklü Görüntüleme

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Nöromusküler Kavşak: Ölçme Synapse Boyut, Konfokal Floresan Mikroskobu kullanılarak sinaptik Protein Yoğunluk Parçalanma ve Değişiklikler

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

En fenotip Karakterizasyonu: Niceleme Matters Neden<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Uyanık Farelerde Nöroaktif Maddelerin Microiontophoretic Uygulaması ile birlikte Nöronal Faaliyet dışı Kaydı

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

Fibula Sinir Yaralanması Yöntem: Güvenilir Testi tanımak ve Test O Tamir Nöromüsküler Junctions Faktörleri

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Konvansiyonel UV Lazer konfokal mikroskopi kullanılarak Tetikleme Hücre Stres ve Ölüm

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Görselleştirme ve Oligodendrocyte organelleri Adeno ilişkili virüs ve Confocal mikroskobu kullanılarak Organotypic beyin dilimleri içinde canlı görüntüleme

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Primer Nöronlarda Proteinlerin ve Sinaptik Belirteçlerin Eş Lokalizasyonunun İncelenmesinde Süper Çözünürlüklü Görüntüleme

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...