Name: technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation
Uploaded: 2021-12-30T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation at JoVE.com

Vi takker de patienter, der frivilligt deltog og det medicinske og sygeplejepersonale på Hospital São Paulo. Denne undersøgelse blev støttet af Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasilien.

Denne undersøgelse er godkendt af UNIFESP's etiske komité (protokolnummer: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), udført efter indhentning af skriftligt informeret samtykke fra patienterne i henhold til Helsinki-erklæringen (2004). Prøven af denne undersøgelse består af ni kvindelige patienter i alderen 33-50 år (gennemsnitsalder 41,5) og gennemsnitligt initial body mass index (BMI) på 24,54 (mellem 22,32-26,77) (tabel 1), der gennemgik æstetisk abdominoplastik på grund af overskydende hud eft...

Isolering udbytte Det er veletableret, at kryopræserveringsprocessen, der ofte kræves i cellulær terapi, resulterer i signifikant celletab, undertiden større end 50% 29,30,35. Således er en teknisk forbedring for at opnå højt indledende cellulært udbytte isoleret set grundlæggende. Indsamlingsmetoden for lipoaspirat og isolationsmetoden for cellerne skal fokusere på at bevare et større antal celler...

Humane mesenkymale stamceller er fordelagtige i både grundforskning og anvendt forskning. Brugen af denne voksne celletype overgår etiske spørgsmål - sammenlignet med brugen af embryonale eller andre celler - er et af de mest lovende studieområder inden for autolog vævsregenereringsteknik og celleterapi1, såsom det neoplastiske område, behandling af degenerative sygdomme og terapeutiske anvendelser inden for rekonstruktiv kirurgiområde 2,3,4, 5. Det er tidligere blevet rapporteret, at der er en rigelig kilde til mesenkymale multipotente og pluripotente stamceller i den stromale vaskulære cellefraktion af fedtvæv 6,7. Disse ADSC betragtes som gode kandidater til brug i celleterapi og transplantation/infusion, da et betydeligt antal celler med en stærk ekspansionskapacitet ex vivo let kan opnås med et højt udbytte fra en minimal invasiv procedure 5,8.
Det blev også påvist, at fedtvæv har større kapacitet til at tilvejebringe mesenkymale stamceller end to andre kilder (knoglemarv og navlesnorsvæv)9. Udover at være dårligt immunogen og have en høj evne til at integrere sig i værtsvævet og interagere med det omgivende væv4,10, har ADSC en multipotent differentieringskapacitet i cellelinjer med rapporter om kondrogen, osteogen og myogen differentiering under passende kulturbetingelser11,12,13 og i celler, såsom bugspytkirtel, hepatocytter, og neurogene celler14,15,16.
Det videnskabelige samfund er enige om, at de mesenkymale stamcellers immunmodulerende virkning er en mere relevant virkningsmekanisme for celleterapi17,18,19 end deres differentieringsegenskab. En af de mest betydningsfulde fordele ved ADSC-brugen er muligheden for autolog infusion eller podning, der bliver en alternativ behandling for flere sygdomme. Til regenerativ medicin er ADSC allerede blevet brugt i tilfælde af leverskader, rekonstruktion af hjertemuskulatur, regenerering af nervevæv, forbedring af skeletmuskelfunktion, knogleregenerering, kræftbehandling og diabetesbehandling20,21.
Til denne dato er der 263 registrerede kliniske forsøg til evaluering af ADSC's potentiale, der er anført på webstedet for United States National Institutes of Health22. Forskellige protokoller til høst af fedtvæv er blevet etableret, men der er ingen konsensus i litteraturen om en standardiseret metode til at isolere ADSC til klinisk brug23,24. Lipoaspiratbehandlingsmetoder under og efter operationen kan direkte påvirke cellens levedygtighed, det endelige cellulære udbytte25 og kvaliteten af ADSC-populationen20. Med hensyn til den kirurgiske forbehandling er det ikke veletableret, hvilken kirurgisk forbehandlingsteknik der giver et større antal levedygtige celler efter isolering, eller om den bedøvelsesopløsning, der injiceres i fedtvæv, påvirker celleudbyttet og dets funktioner26. Tilsvarende kan forskellen mellem teknikker til opnåelse af fedtceller føre til så meget som et fald på 70% i antallet af levedygtige ADSC20. Ifølge litteraturen bør mekaniske behandlinger for at opnå cellepopulationer med høj levedygtighed - herunder ultralyd - undgås, for de kan nedbryde fedtvævet20. Imidlertid er den manuelle fedtaspirationsmetode med sprøjter mindre skadelig og forårsager mindre celledestruktion, hvor tumescent fedtsugning giver et betydeligt antal celler med den bedste kvalitet26.
Denne teknik bruger en saltopløsning med lidokain og adrenalin, der injiceres i fedtsugningsområdet. For hver 3 ml injektionsvolumen opløsning opsuges 1 ml. I denne undersøgelse blev den våde fedtsugningsteknik udført, hvor der for hver 1 ml adrenalin og saltopløsning, der injiceres, aspireres 0,2 ml fedtvæv. Anvendelsen af fordøjelsesenzymer, især collagenase, er almindelig for processen med at isolere ADSC.
Efter det første isoleringstrin i laboratoriet kaldes den endelige pellet stromal vaskulær fraktion (SVF). Den indeholder forskellige celletyper27, herunder endotelprecursorceller, endotelceller, makrofager, glatte muskelceller, lymfocytter, pericytter, præ-adipocytter og ADSC'er, som er i stand til vedhæftning. Når den endelige isolering er afsluttet fra in vitro-kulturer , elimineres celler, der ikke klæber til plasten, i mellemstore udvekslinger. Efter otte ugers ekspansion, mellemstore ændringer og passager repræsenterer ADSC'er det meste af cellepopulationen i kolberne20. En af de væsentligste fordele ved at anvende isolerede fedtafledte stamceller til en mulig fremtidig behandling er muligheden for kryopræservering. Det blev påvist, at kryopræserveret lipoaspirat er en potentiel kilde til SVF-celler, selv efter 6 ugers frysning28, med biologisk aktivitet selv efter 2 års kryopræservering29 og fuld evne til at vokse og differentiere i kultur30. Under optøningsprocessen går en betydelig procentdel af cellerne imidlertid normalt tabt31. Derfor skal lipoaspiratfjernelsesprocessen og følgende metoder til celleisolering sikre det højeste celleudbytte.
Denne undersøgelse beskriver en hurtigere metode til indsamling og isolering af ADSC, der viser højt cellulært udbytte og levedygtighed for bedre effektivitet af cellulær terapi. Desuden blev effekten af denne forbedrede teknik efter langvarig SVF-kryopræservering evalueret.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL cryovials</td>
			<td>Nunc Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>340711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL polyvinyl chloride transfer bag</td>
			<td>JP FARMA</td>
			<td>80146150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adrenaline (1 mg/mL)</td>
			<td>Hipolabor</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,01,647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride 10%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine gluconate 4%</td>
			<td>VIC PHARMA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,00,496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS100</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live and Dead Cell Assay</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>01-3333-41 | 01-3333-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD105</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD11B</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD19</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD34</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>747822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD45</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD73</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD90</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>553011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: HLA-DR</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>340827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile connector with one spike with needle injection site</td>
			<td>Origen Biomedical Connector, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Code mark: IBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation

Humane mesenkymale stamceller afledt af fedtvæv er blevet mere og mere attraktive, da de viser passende egenskaber og er en tilgængelig kilde til regenerative kliniske anvendelser. Forskellige protokoller er blevet brugt til at opnå fedtafledte stamceller. Denne artikel beskriver forskellige trin i en forbedret tidsbesparende protokol for at opnå en mere betydelig mængde ADSC, der viser, hvordan man kryopreserverer og optøer ADSC for at opnå levedygtige celler til dyrkningsudvidelse. Et hundrede milliliter lipoaspirat blev opsamlet ved hjælp af en 26 cm tre-huls og 3 mm kaliber sprøjte fedtsugning fra abdominalområdet hos ni patienter, der efterfølgende gennemgik elektiv abdominoplastik. Stamcelleisoleringen blev udført med en række vaske med Dulbeccos fosfatbuffered saltvand (DPBS) opløsning suppleret med calcium og brug af collagenase. Stromal vaskulær fraktion (SVF) celler blev kryopræserveret, og deres levedygtighed blev kontrolleret ved immunophenotyping. SVF-cellulært udbytte var 15,7 x 105 celler / ml, der spænder mellem 6,1-26,2 celler / ml. Vedhæftede SVF-celler nåede sammenløb efter et gennemsnit på 7,5 (±4,5) dage med et gennemsnitligt cellulært udbytte på 12,3 (± 5,7) x 105 celler / ml. Levedygtigheden af optøet SVF efter 8 måneder, 1 år og 2 år varierede mellem 23,06%-72,34% med et gennemsnit på 47,7% (±24,64) med den laveste levedygtighed korreleret med tilfælde af toårig frysning. Brugen af DPBS-opløsning suppleret med hviletider for calcium og poser til fedtudfældning med en kortere tid med kollagenasefordøjelse resulterede i et øget stamcelle endeligt cellulært udbytte. Den detaljerede procedure for opnåelse af høje udbytter af levedygtige stamceller var mere effektiv med hensyn til tid og cellulært udbytte end teknikkerne fra tidligere undersøgelser. Selv efter en lang periode med kryopræservering blev der fundet levedygtige ADSC-celler i SVF.

Karakteriseringen af de ni undersøgte personer, herunder deres alder, vægt, højde og BMI, er vist i tabel 1.
Ifølge det cellulære udbytte, der oprindeligt blev præsenteret, blev cellevolumenet, der blev podet i kultur, beregnet til at være så tæt som muligt på kapaciteten af den 75 cm2 dyrkningskolbe. Den prøvemængde, der i hvert enkelt tilfælde er sået, er beskrevet i tabel 2. Derefter blev der ifølge det oprindelige cellulære udbyt...

Watch this Scientific Journal Video about Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation at JoVE.com

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Den nuværende protokol beskriver en forbedret metode til ADSC-isolering, hvilket resulterer i et enormt cellulært udbytte med tidsgevinst sammenlignet med litteraturen. Denne undersøgelse giver også en ligetil metode til at opnå et relativt stort antal levedygtige celler efter langvarig kryopræservering.

Teknik til opnåelse af mesenkymal stamcelle fra fedtvæv og stromal vaskulær fraktionskarakterisering ved langvarig kryopræservering

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Her har vi demonstreret protokollen til opnåelse og bevarelse af de gode og levedygtige celler til brug af terapeutiske trin, som infusion af pluripotente mesenkymale celler. Den største fordel ved dette, at vi ved hjælp af denne teknik kan opnå det levedygtige cellevolumen versus den tid, der er opnået i cellernes isolationstrin fra det indsamlede væv. Denne teknik kan udvides til alle sygdomme eller tilstande, hvor heterogen medicin og celleterapi anvendes.Denne metode kan også anvendes til cytogenomisk stabilitetstest på områder som lægemiddeltest, hvor langsigtede cellekulturer kan tilskyndes. Når du manipulerer de levende celler, skal du være rolig og selvsikker. Vær ekstremt forsigtig med sepsis og vær konstant opmærksom med en videnskabsmands øjne for at observere enhver modgang og træffe gode beslutninger.Begynd med at veje posen og måle temperaturen med et digitalt infrarødt klinisk termometer uden berøring. Lad posen stå i fem minutter inde i det laminære strømningskammer for at udfælde de fedtede lag og adskille vævet, der indeholder cellerne. Injicer 100 ml DPBS med calcium i overførselsposen og bland det med hænderne.Lad det stå i fem minutter. Brug derefter en 60 ml sprøjte, der er fastgjort til poseadapteren, til at kassere det meste af den basale væske, der udfældes. Gentag denne proces to gange.Tilsæt 100 ml fordøjelsesopløsningen til posen, og lad den stå ved 37 grader Celsius i 30 minutter under langsom omrøring. Overfør derefter alt posens indhold til fire 50 ml koniske rør og centrifuge dem ved 400G i 10 minutter ved 22 grader Celsius. Kassér supernatanten og tilsæt 5 ml DMEM lav glukose suppleret med 20% føtalt bovin serum til cellepellet.Bland en frisk opløsning af 10 mikroliter trypanblå ved 0,05% i destilleret vand med 10 mikroliter cellulær suspension i fem minutter. Brug et omvendt lysmikroskop ved 20X forstørrelse, og tæl de levedygtige celler i et Neubauer-celletællingskammer. Suspender cellepelleten i et kryobeskyttende medium i en koncentration på 1 million celler pr. milliliter.Anbring derefter 1 milliliter af denne blanding i cryo hætteglas. Brug en frysebeholder med en kølehastighed på 1 grad Celsius pr. Minut og opbevar ved 80 grader Celsius i et år. Efter et år opbevares det i standardkassettekasser nedsænket i flydende nitrogendampfase.Data fra forskellige trin i proceduren fra de ni patienter er vist i denne tabel. Ifølge det oprindelige cellulære udbytte blev et variabelt volumen af celler for hver prøve bestemt. 1 milliliter prøver med højere cellulært udbytte, 1,1 ml til prøver med mellemliggende cellulært udbytte og 2 ml pr. prøver med lavere cellulært udbytte.Det cellulære udbytte før passage en varierede bredt, selv når den samme sammenløb før trypsinisering blev observeret. Derfor kan cellerne her være vokset i lag. Det repræsentative billede viser de plastklæbende mesenkymale ADSC'er ved den første passage efter isolering ved lysmikroskopi.Cellerne viser vedhæftning til den plast- og fibroblastlignende morfologi. De levedygtige celler, der tælles i Neubauer-kammeret i trypanblå assay, er vist her. Flowcytometridata fra seks patienter er præsenteret i denne tabel.Fra disse CD45-negative celler blev procentdelen af ADSC'er med forskellige kombinationer af stamcellemarkører bestemt. De repræsentative billeder viser subpopulationen af celler, der er positive for stamcelleassocierede markører i SVF i tilfælde ni efter otte måneders kryopræservering. Her er R1 det samlede cellulære område analyseret i det fremadrettede scatter versus side scatter plot.Og R2 er CD45 negativ region. CD73, CD90 og CD105 befolkninger er positive i denne region. ADSC-differentiering i kondrocytter, osteocytter og adipocytter er vist her.Mens du forsøger denne procedure, skal du huske at røre langsomt, helst med hænderne, mens du forlader ved 37 Celsius grader i 30 minutter for at observere adhæsioner og blærer. Hold arbejdstemperaturen omkring 25 Celsius grader, og undgå termisk stød ved meget større temperaturer. Den teknik, vi har vist her, kan bruges til med succes at isolere de pluripotente mesenkymale celler fra andre væv.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolering af cardiomyocyte Kerner fra Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, karakterisering og sammenlignende differentiering af humane Dental Pulp stamceller fra blivende tænder ved hjælp af to forskellige metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Surgical Placement of Catheters for Long-term Cardiovascular Exercise Testing in Swine

Kirurgisk Placering af Katetre til Langsigtet motionsture Afprøvning i Swine

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

En teknik til subkutan Abdominal fedtvæv biopsi via en ikke-Diatermi metode

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Stromal Vascular Fraction-enriched Fat Grafting for the Treatment of Symptomatic End-neuromata

Stromale vaskulære brøkdel-beriget fedt podning til behandling af symptomatisk ende-neuromata

The purpose of this study was to methodically illustrate and highlight the crucial steps of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Transplantation af fedtvæv-afledte stamceller ark til at reducere udsivningen efter delvis kolektomi i en rotte Model

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Karakterisering af immunceller i menneskers fedtvæv ved hjælp af flowcytometri

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Klinisk protokol producere fedtvæv-afledte stromale vaskulære brøkdel for potentielle brusk regenerering

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

En enzym-fri metode til isolering og udvidelse af humane Adipose-afledte mesenchymale stamceller

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Isolering af levedygtige adipocytter og stromal vaskulær fraktion fra humant visceralt fedtvæv, der er egnet til RNA-analyse og makrofagfænotypning

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...