Name: technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation
Uploaded: 2021-12-30T16:00:00
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Nous remercions les patients qui se sont portés volontaires pour participer et le personnel médical et infirmier de l’hôpital de São Paulo. Cette étude a été soutenue par la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) et le Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brésil.

La présente étude est approuvée par le Comité d’éthique de l’UNIFESP (numéro de protocole : 0029/2015 CAAE : 40846215.0.0000.5505), réalisée après avoir obtenu le consentement éclairé écrit des patients conformément à la Déclaration d’Helsinki (2004). L’échantillon de la présente étude est composé de neuf patientes, âgées de 33 à 50 ans (âge moyen de 41,5 ans) et d’un indice de masse corporelle initial (IMC) moyen de 24,54 (allant de 22,32 à 26,77) (tableau 1) qui ont su...

Rendement d’isolement Il est bien établi que le procédé de cryoconservation, fréquemment requis en thérapie cellulaire, entraîne une perte cellulaire importante, parfois supérieure à 50%29,30,35. Ainsi, une amélioration technique pour obtenir un rendement cellulaire initial élevé isolément est fondamentale. La méthode de collecte des lipoaspirations et la méthode d’isolement des cellules doi...

Les cellules souches mésenchymateuses humaines sont avantageuses en recherche fondamentale et appliquée. L’utilisation de ce type de cellules adultes dépasse les questions éthiques - par rapport à l’utilisation de cellules embryonnaires ou autres - étant l’un des domaines d’étude les plus prometteurs en ingénierie de la régénération tissulaire autologue et en thérapie cellulaire1, tels que le domaine néoplasique, le traitement des maladies dégénératives et les applications thérapeutiques dans le domaine de la chirurgie reconstructive 2,3,4, 5. Il a été précédemment rapporté qu’il existe une source abondante de cellules souches mésenchymateuses multipotentes et pluripotentes dans la fraction cellulaire vasculaire stromale du tissu adipeux 6,7. Ces ADSC sont considérés comme d’excellents candidats pour une utilisation en thérapie cellulaire et en transplantation/perfusion car un nombre considérable de cellules ayant une forte capacité d’expansion ex vivo peuvent être facilement obtenues avec un rendement élevé à partir d’une procédure invasive minimale 5,8.
Il a également été démontré que le tissu adipeux présente une plus grande capacité à fournir des cellules souches mésenchymateuses que deux autres sources (moelle osseuse et tissu du cordon ombilical)9. En plus d’être peu immunogène et d’avoir une grande capacité à s’intégrer dans le tissu hôte et à interagir avec les tissus environnants4,10, l’ADSC a une capacité multipotente de différenciation en lignées cellulaires, avec des rapports de différenciation chondromogène, ostéogénique et myogénique dans des conditions de culture appropriées11,12,13, et dans les cellules, telles que le pancréas, les hépatocytes, et cellules neurogènes14,15,16.
La communauté scientifique s’accorde à dire que l’effet immunomodulateur des cellules souches mésenchymateuses est un mécanisme d’action plus pertinent pour la thérapie cellulaire17,18,19 que leur propriété de différenciation. L’un des avantages les plus importants de l’utilisation de l’ADSC est la possibilité de perfusion ou de greffe autologue, devenant un traitement alternatif pour plusieurs maladies. Pour la médecine régénérative, les ADSC ont déjà été utilisés dans les cas de lésions hépatiques, de reconstruction du muscle cardiaque, de régénération du tissu nerveux, d’amélioration de la fonction musculaire squelettique, de régénération osseuse, de traitement du cancer et de traitement du diabète20,21.
À ce jour, il existe 263 essais cliniques enregistrés pour l’évaluation du potentiel de l’ADSC, répertoriés sur le site Web des National Institutes of Health des États-Unis22. Différents protocoles de prélèvement de tissu adipeux ont été établis, mais il n’y a pas de consensus dans la littérature sur une méthode normalisée pour isoler l’ADSC à des fins cliniques23,24. Les méthodes de traitement des lipoaspires pendant et après la chirurgie peuvent affecter directement la viabilité cellulaire, le rendement cellulaire final25 et la qualité de la population ADSC20. En ce qui concerne le prétraitement chirurgical, il n’est pas bien établi quelle technique chirurgicale de prétraitement produit un nombre plus significatif de cellules viables après isolement ou si la solution anesthésique injectée dans le tissu adipeux affecte le rendement cellulaire et ses fonctions26. De même, la différence entre les techniques d’obtention de cellules adipeuses peut entraîner une diminution allant jusqu’à 70% du nombre d’ADSC20 viables. Selon la littérature, les traitements mécaniques visant à obtenir des populations cellulaires à haute viabilité - y compris les ultrasons - doivent être évités, car ils peuvent décomposer le tissu adipeux20. Cependant, la méthode d’aspiration manuelle des graisses avec des seringues est moins nocive, causant moins de destruction cellulaire, la liposuccion tumescente produisant un nombre important de cellules de la meilleure qualité26.
Cette technique utilise une solution saline avec de la lidocaïne et de l’épinéphrine qui est injectée dans la zone de liposuccion. Pour chaque volume de 3 mL de solution injecté, 1 mL est aspiré. Dans cette étude, la technique de liposuccion humide a été réalisée, dans laquelle pour chaque 1 mL d’adrénaline et de solution saline injectée, 0,2 mL de tissu adipeux est aspiré. L’utilisation d’enzymes digestives, en particulier de collagénase, est courante pour le processus d’isolement de l’ADSC.
Après la première étape d’isolement en laboratoire, la pastille finale est appelée fraction vasculaire stromale (SVF). Il contient différents types de cellules27, y compris les cellules précurseurs endothéliales, les cellules endothéliales, les macrophages, les cellules musculaires lisses, les lymphocytes, les péricytes, les pré-adipocytes et les ADSC, qui sont capables d’adhérence. Une fois l’isolement final conclu à partir de cultures in vitro , les cellules qui n’adhéraient pas au plastique sont éliminées dans des échanges de milieu. Après huit semaines d’expansion, de changements moyens et de passages, les ADSC représentent la majeure partie de la population cellulaire dans les flacons20. L’un des avantages les plus importants de l’utilisation de cellules souches isolées dérivées du tissu adipeux pour une éventuelle thérapie future est la possibilité de cryoconservation. Il a été démontré que la lipoaspiration cryoconservée est une source potentielle de cellules SVF même après 6 semaines de congélation28, avec une activité biologique même après 2 ans de cryoconservation29, et une capacité totale de croissance et de différenciation en culture30. Cependant, au cours du processus de décongélation, un pourcentage considérable de cellules est généralement perdu31. Par conséquent, le processus d’élimination des lipoaspires et les méthodes suivantes d’isolement cellulaire doivent assurer le rendement cellulaire le plus élevé.
Cette étude décrit une méthodologie plus rapide pour collecter et isoler l’ADSC, démontrant un rendement cellulaire élevé et une viabilité pour une meilleure efficacité des thérapies cellulaires. De plus, l’effet de cette technique améliorée après cryoconservation à long terme de la SVF a été évalué.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL cryovials</td>
			<td>Nunc Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>340711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL polyvinyl chloride transfer bag</td>
			<td>JP FARMA</td>
			<td>80146150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adrenaline (1 mg/mL)</td>
			<td>Hipolabor</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,01,647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride 10%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine gluconate 4%</td>
			<td>VIC PHARMA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,00,496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS100</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live and Dead Cell Assay</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>01-3333-41 | 01-3333-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD105</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD11B</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD19</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD34</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>747822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD45</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD73</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD90</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>553011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: HLA-DR</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>340827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile connector with one spike with needle injection site</td>
			<td>Origen Biomedical Connector, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Code mark: IBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation

Les cellules souches mésenchymateuses humaines dérivées du tissu adipeux sont devenues de plus en plus attrayantes car elles présentent des caractéristiques appropriées et constituent une source accessible pour des applications cliniques régénératives. Différents protocoles ont été utilisés pour obtenir des cellules souches dérivées du tissu adipeux. Cet article décrit les différentes étapes d’un protocole amélioré permettant de gagner du temps pour obtenir une quantité plus importante d’ADSC, en montrant comment cryopréserver et décongeler l’ADSC pour obtenir des cellules viables pour l’expansion de la culture. Cent millilitres de lipoaspiration ont été prélevés, à l’aide d’une liposuccion à seringue de calibre trois trous de 26 cm et de calibre 3 mm, dans la région abdominale de neuf patients qui ont ensuite subi une abdominoplastie élective. L’isolement des cellules souches a été réalisé avec une série de lavages avec la solution de solution de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco supplémentée en calcium et en utilisant de la collagénase. Les cellules de la fraction vasculaire stromale (SVF) ont été cryopréservées et leur viabilité a été vérifiée par immunophénotypage. Le rendement cellulaire SVF était de 15,7 x 105 cellules/mL, variant entre 6,1 et 26,2 cellules/mL. Les cellules SVF adhérentes ont atteint la confluence après une moyenne de 7,5 (±4,5) jours, avec un rendement cellulaire moyen de 12,3 (± 5,7) x 105 cellules / mL. La viabilité de la SVF décongelée après 8 mois, 1 an et 2 ans variait entre 23,06 % et 72,34 %, avec une moyenne de 47,7 % (±24,64), la viabilité la plus faible étant corrélée aux cas de gel de deux ans. L’utilisation de la solution DPBS complétée par du calcium et des temps de repos en sac pour la précipitation des graisses avec un temps de digestion de collagénase plus court a entraîné une augmentation du rendement cellulaire final des cellules souches. La procédure détaillée pour obtenir des rendements élevés de cellules souches viables était plus efficace en termes de temps et de rendement cellulaire que les techniques des études précédentes. Même après une longue période de cryoconservation, des cellules ADSC viables ont été trouvées dans le SVF.

La caractérisation des neuf personnes étudiées, y compris leur âge, leur poids, leur taille et leur IMC, est présentée au tableau 1.
Selon le rendement cellulaire initialement présenté, le volume cellulaire inoculé en culture a été calculé pour être le plus proche possible de la capacité du ballon de culture de 75cm2. Le volume d’échantillon ensemencé dans chaque cas est décrit au tableau 2. Ensuite, selon le rendement cellulaire ...

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Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Le présent protocole décrit une méthodologie améliorée pour l’isolement ADSC résultant en un rendement cellulaire énorme avec gain de temps par rapport à la littérature. Cette étude fournit également une méthode simple pour obtenir un nombre relativement important de cellules viables après cryoconservation à long terme.

Technique d’obtention de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu adipeux et caractérisation de la fraction vasculaire stromale dans la cryoconservation à long terme

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Ici, nous avons démontré le protocole pour obtenir et préserver les cellules bonnes et viables pour des utilisations d’étapes thérapeutiques, comme la perfusion de cellules mésenchymateuses pluripotentes. Le principal avantage de ceci, qu’en utilisant cette technique, nous pouvons obtenir le volume cellulaire viable en fonction du temps gagné dans l’étape d’isolement des cellules à partir du tissu collecté. Cette technique peut être étendue à toutes les maladies ou affections où la médecine hétérogénique et la thérapie cellulaire sont appliquées.Cette méthode peut également être appliquée aux tests de stabilité cytogénomique dans des domaines tels que les tests de médicaments, où les cultures cellulaires à long terme peuvent être encouragées. Chaque fois que vous manipulez les cellules vivantes, soyez calme et confiant. Prenez des précautions extrêmes avec la septicémie et soyez constamment vigilant avec les yeux d’un scientifique pour observer toute adversité et prendre de bonnes décisions.Commencez par peser le sac et mesurer la température à l’aide d’un thermomètre clinique infrarouge numérique sans contact. Laissez le sac pendant cinq minutes à l’intérieur de la chambre d’écoulement laminaire pour précipiter les couches graisseuses et séparer le tissu contenant les cellules. Injectez 100 millilitres de DPBS avec du calcium dans le sac de transfert et mélangez-le avec les mains.Laissez-le reposer pendant cinq minutes. Utilisez ensuite une seringue de 60 millilitres fixée à l’adaptateur de sac pour éliminer la majeure partie du liquide basal qui précipite. Répétez ce processus deux fois.Ajouter 100 millilitres de la solution de digestion dans le sac et laisser à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes sous agitation lente. Ensuite, transférez tout le contenu du sac dans quatre tubes coniques de 50 millilitres et centrifugez-les à 400 G pendant 10 minutes à 22 degrés Celsius. Jeter le surnageant et ajouter 5 millilitres de DMEM à faible teneur en glucose complété par 20% de sérum bovin fœtal à la pastille cellulaire.Mélanger une solution fraîche de 10 microlitres de bleu de trypan à 0,05% dans de l’eau distillée avec 10 microlitres de suspension cellulaire pendant cinq minutes. Utilisez un microscope à lumière inversée à un grossissement de 20X et comptez les cellules viables dans une chambre de comptage de cellules Neubauer. Suspendre la pastille cellulaire dans un milieu cryoprotecteur à une concentration de 1 million de cellules par millilitre.Placez ensuite 1 millilitre de ce mélange dans des flacons cryogéniques. Utilisez un contenant congelé avec une vitesse de refroidissement de 1 degré Celsius par minute et conservez à 80 degrés Celsius pendant un an. Après un an, stockez-le dans des boîtes de cassettes standard immergées dans une phase vapeur d’azote liquide.Les données des différentes étapes de la procédure des neuf patients sont présentées dans ce tableau. Selon le rendement cellulaire initial, un volume variable de cellules pour chaque échantillon a été déterminé. 1 millilitre d’échantillons avec un rendement cellulaire plus élevé, 1,1 millilitre pour les échantillons avec un rendement cellulaire intermédiaire et 2 millilitres par échantillon avec un rendement cellulaire inférieur.Le rendement cellulaire avant passage variait largement, même lorsque la même confluence avant trypsinisation était observée. Par conséquent, ici, les cellules peuvent avoir grandi en couches. L’image représentative montre les ADSC mésenchymateux adhérents au plastique au premier passage après isolement en microscopie optique.Les cellules montrent une adhésion à la morphologie de type plastique et fibroblaste. Les cellules viables comptées dans la chambre de Neubauer dans le dosage du bleu de trypan sont montrées ici. Les données de cytométrie en flux de six patients sont présentées dans ce tableau.À partir de ces cellules CD45 négatives, le pourcentage d’ADSC avec différentes combinaisons de marqueurs de cellules souches a été déterminé. Les images représentatives montrent la sous-population de cellules positives pour les marqueurs associés aux cellules souches dans la SVF du cas neuf après huit mois de cryoconservation. Ici, R1 est la région cellulaire totale analysée dans le diagramme de diffusion vers l’avant par rapport à la dispersion latérale.Et R2 est la région CD45 négative. Les populations de CD73, CD90 et CD105 sont positives dans cette région. La différenciation ADSC dans les chondrocytes, les ostéocytes et les adipocytes est illustrée ici.En essayant cette procédure, n’oubliez pas de remuer lentement, de préférence avec les mains, tout en laissant à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour observer les adhérences et les cloques. Maintenez la température de la pièce de travail autour de 25 degrés Celsius et évitez tout choc thermique à des températures beaucoup plus élevées. La technique que nous avons montrée ici peut être utilisée avec succès pour isoler les cellules mésenchymateuses pluripotentes d’autres tissus.

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