Name: technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation
Uploaded: 2021-12-30T16:00:00
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Wir danken den Patienten, die sich freiwillig zur Teilnahme gemeldet haben, und dem medizinischen und pflegerischen Personal des Krankenhauses São Paulo. Diese Studie wurde von der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) und Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasilien, unterstützt.

Die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission der UNIFESP genehmigt (Protokollnummer: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), durchgeführt nach schriftlicher Einverständniserklärung der Patienten gemäß der Deklaration von Helsinki (2004). Die Stichprobe der vorliegenden Studie besteht aus neun Patientinnen im Alter von 33 bis 50 Jahren (Durchschnittsalter 41,5 Jahre) und einem durchschnittlichen anfänglichen Body-Mass-Index (BMI) von 24,54 (zwischen 22,32 und 26,77) (Tabelle 1), die sich eine...

Isolationsausbeute Es ist allgemein bekannt, dass der Kryokonservierungsprozess, der häufig in der Zelltherapie erforderlich ist, zu einem signifikanten Zellverlust führt, manchmal mehr als 50%29,30,35. Daher ist eine technische Verbesserung zur Erzielung einer hohen anfänglichen Zellausbeute in Isolation von grundlegender Bedeutung. Die Sammelmethode der Lipoaspirate und die Isolierungsmethode der Zellen ...

Humane mesenchymale Stammzellen sind sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der angewandten Forschung von Vorteil. Die Verwendung dieses adulten Zelltyps überwindet ethische Fragen - verglichen mit der Verwendung embryonaler oder anderer Zellen - und ist eines der vielversprechendsten Forschungsgebiete in der autologen Geweberegeneration und Zelltherapie1, wie der neoplastische Bereich, die Behandlung degenerativer Erkrankungen und therapeutische Anwendungen im Bereich der rekonstruktiven Chirurgie 2,3,4, 5. Es wurde bereits berichtet, dass es eine reichliche Quelle von mesenchymalen multipotenten und pluripotenten Stammzellen in der stromalen vaskulären Zellfraktion des Fettgewebesgibt 6,7. Diese ADSC gelten als hervorragende Kandidaten für den Einsatz in der Zelltherapie und Transplantation/Infusion, da eine beträchtliche Anzahl von Zellen mit einer starken Expansionskapazität ex vivo leicht mit einer hohen Ausbeute aus einem minimalinvasiven Verfahren gewonnen werden kann 5,8.
Es wurde auch gezeigt, dass Fettgewebe eine größere Fähigkeit zur Bereitstellung mesenchymaler Stammzellen aufweist als zwei andere Quellen (Knochenmark und Nabelschnurgewebe)9. ADSC ist nicht nur schlecht immunogen und besitzt eine hohe Fähigkeit, sich in das Wirtsgewebe zu integrieren und mit dem umgebenden Gewebe zu interagieren4,10, sondern hat auch eine multipotente Fähigkeit zur Differenzierung in Zelllinien, mit Berichten über chondrogene, osteogene und myogene Differenzierung unter geeigneten Kulturbedingungen11,12,13, und in Zellen wie Pankreas, Hepatozyten, und neurogene Zellen14,15,16.
Die wissenschaftliche Gemeinschaft ist sich einig, dass die immunmodulatorische Wirkung der mesenchymalen Stammzellen ein relevanterer Wirkmechanismus für die Zelltherapieist 17,18,19 als ihre Differenzierungseigenschaft. Einer der wichtigsten Vorteile der ADSC-Verwendung ist die Möglichkeit der autologen Infusion oder Transplantation, die zu einer alternativen Behandlung für mehrere Krankheiten wird. Für die regenerative Medizin wurden ADSC bereits bei Leberschäden, Rekonstruktion des Herzmuskels, Regeneration von Nervengewebe, Verbesserung der Skelettmuskelfunktion, Knochenregeneration, Krebstherapie und Diabetesbehandlung eingesetzt20,21.
Bis heute gibt es 263 registrierte klinische Studien zur Bewertung des Potenzials von ADSC, die auf der Website der United States National Institutes of Health22 aufgeführt sind. Verschiedene Protokolle zur Entnahme von Fettgewebe wurden etabliert, aber es gibt keinen Konsens in der Literatur über eine standardisierte Methode zur Isolierung von ADSC für den klinischen Gebrauch23,24. Lipoaspirate-Verarbeitungsmethoden während und nach der Operation können sich direkt auf die Zelllebensfähigkeit, die endgültige Zellausbeute25 und die Qualität der ADSC-Population20 auswirken. In Bezug auf die chirurgische Vorbehandlung ist nicht genau bekannt, welche chirurgische Vorbehandlungstechnik nach der Isolierung eine signifikantere Anzahl lebensfähiger Zellen ergibt oder ob die in das Fettgewebe injizierte Anästhesielösung die Zellausbeute und ihre Funktionen beeinflusst26. In ähnlicher Weise kann der Unterschied zwischen den Techniken zur Gewinnung von Fettzellen zu einer Verringerung der Anzahl lebensfähiger ADSC 20 um bis zu70% führen. Nach der Literatur sollten mechanische Behandlungen zur Gewinnung von Zellpopulationen mit hoher Lebensfähigkeit - einschließlich Ultraschall - vermieden werden, da sie das Fettgewebe abbauen können20. Die manuelle Fettaspirationsmethode mit Spritzen ist jedoch weniger schädlich und verursacht weniger Zellzerstörung, wobei die Tumeszenzfettabsaugung eine signifikante Anzahl von Zellen mit der besten Qualität ergibt26.
Diese Technik verwendet eine Kochsalzlösung mit Lidocain und Epinephrin, die in den Fettabsaugungsbereich injiziert wird. Für jedes injizierte 3-ml-Volumen der injizierten Lösung wird 1 ml aspiriert. In dieser Studie wurde die nasse Fettabsaugungstechnik durchgeführt, bei der für jeden injizierten 1 ml Adrenalin und Kochsalzlösung 0,2 ml Fettgewebe abgesaugt werden. Die Verwendung von Verdauungsenzymen, insbesondere Kollagenase, ist für den Prozess der Isolierung von ADSC üblich.
Nach dem ersten Isolationsschritt im Labor wird das endgültige Pellet als stromale vaskuläre Fraktion (SVF) bezeichnet. Es enthält verschiedene Zelltypen27, einschließlich endothelialer Vorläuferzellen, Endothelzellen, Makrophagen, glatter Muskelzellen, Lymphozyten, Perizyten, Präadipozyten und ADSCs, die adhäsionsfähig sind. Sobald die endgültige Isolierung aus In-vitro-Kulturen abgeschlossen ist, werden Zellen, die nicht am Kunststoff haften, im Medienaustausch eliminiert. Nach acht Wochen Expansion, Mediumsveränderungen und Passagen repräsentieren ADSCs den größten Teil der Zellpopulation in den Kolben20. Einer der wichtigsten Vorteile der Verwendung isolierter Stammzellen aus Fettgeweben für eine mögliche zukünftige Therapie ist die Möglichkeit der Kryokonservierung. Es wurde gezeigt, dass kryokonserviertes Lipoaspirate auch nach 6 Wochen des Einfrierens eine potenzielle Quelle von SVF-Zellen ist28, mit biologischer Aktivität auch nach 2 Jahren Kryokonservierung29 und voller Fähigkeit, in Kultur30 zu wachsen und zu differenzieren. Während des Auftauvorgangs geht jedoch in der Regel ein erheblicher Prozentsatz der Zellen verloren31. Daher müssen der Prozess der Lipoaspirateentfernung und die folgenden Methoden der Zellisolierung die höchste Zellausbeute gewährleisten.
Diese Studie beschreibt eine schnellere Methodik zur Erfassung und Isolierung von ADSC und zeigt eine hohe Zellausbeute und Lebensfähigkeit für eine bessere Effizienz von Zelltherapeutika. Darüber hinaus wurde die Wirkung dieser verbesserten Technik nach Langzeit-SVF-Kryokonservierung evaluiert.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL cryovials</td>
			<td>Nunc Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>340711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL polyvinyl chloride transfer bag</td>
			<td>JP FARMA</td>
			<td>80146150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adrenaline (1 mg/mL)</td>
			<td>Hipolabor</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,01,647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride 10%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine gluconate 4%</td>
			<td>VIC PHARMA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,00,496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS100</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live and Dead Cell Assay</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>01-3333-41 | 01-3333-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD105</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD11B</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD19</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD34</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>747822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD45</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD73</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD90</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>553011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: HLA-DR</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>340827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile connector with one spike with needle injection site</td>
			<td>Origen Biomedical Connector, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Code mark: IBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation

Humane mesenchymale Stammzellen aus Fettgewebe sind zunehmend attraktiver geworden, da sie geeignete Merkmale aufweisen und eine zugängliche Quelle für regenerative klinische Anwendungen darstellen. Verschiedene Protokolle wurden verwendet, um aus Fett gewonnene Stammzellen zu erhalten. Dieser Artikel beschreibt verschiedene Schritte eines verbesserten zeitsparenden Protokolls, um eine signifikantere Menge an ADSC zu erhalten, und zeigt, wie ADSC kryokonserviert und aufgetaut wird, um lebensfähige Zellen für die Kulturexpansion zu erhalten. Einhundert Milliliter Lipoaspirate wurden mit einer 26 cm langen Dreiloch- und 3-mm-Spritzen-Fettabsaugung aus dem Bauchbereich von neun Patienten entnommen, die sich anschließend einer elektiven Bauchdeckenstraffung unterzogen. Die Isolierung der Stammzellen wurde mit einer Reihe von Wäschen mit Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) -Lösung, ergänzt mit Kalzium und der Verwendung von Kollagenase, durchgeführt. Zellen der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) wurden kryokonserviert und ihre Lebensfähigkeit wurde durch Immunphänotypisierung überprüft. Die SVF-Zellausbeute betrug 15,7 x 105 Zellen / ml, zwischen 6,1-26,2 Zellen / ml. Adhärente SVF-Zellen erreichten nach durchschnittlich 7,5 (±4,5) Tagen eine Konfluenz mit einer durchschnittlichen Zellausbeute von 12,3 (± 5,7) x 105 Zellen/ml. Die Lebensfähigkeit von aufgetautem SVF nach 8 Monaten, 1 Jahr und 2 Jahren lag zwischen 23,06% und 72,34% mit einem Durchschnitt von 47,7% (±24,64), wobei die niedrigste Lebensfähigkeit mit Fällen von zweijährigem Einfrieren korrelierte. Die Verwendung von DPBS-Lösung, ergänzt mit Kalzium und Beutelruhezeiten für die Fettfällung mit einer kürzeren Zeit der Kollagenase-Verdauung, führte zu einer erhöhten Zellendausbeute der Stammzellen. Das detaillierte Verfahren zur Erzielung hoher Ausbeuten lebensfähiger Stammzellen war in Bezug auf Zeit und Zellertrag effizienter als die Techniken aus früheren Studien. Selbst nach einer langen Zeit der Kryokonservierung wurden lebensfähige ADSC-Zellen im SVF gefunden.

Die Charakterisierung der neun untersuchten Personen, einschließlich Alter, Gewicht, Größe und BMI, ist in Tabelle 1 dargestellt.
Entsprechend der anfänglich dargestellten Zellausbeute wurde das in Kultur inokulierte Zellvolumen so berechnet, dass es so nah wie möglich an der Kapazität des 75cm2 Kulturkolbens liegt. Das jeweils ausgesäte Probenvolumen ist in Tabelle 2 beschrieben. Dann wurde entsprechend der anfänglichen Zellausbeute ein var...

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Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine verbesserte Methodik zur ADSC-Isolierung, die im Vergleich zur Literatur zu einer enormen zellulären Ausbeute mit Zeitgewinn führt. Diese Studie bietet auch eine einfache Methode, um eine relativ große Anzahl lebensfähiger Zellen nach langfristiger Kryokonservierung zu erhalten.

Technik zur Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe und stromaler vaskulärer Fraktion Charakterisierung in der Langzeitkryokonservierung

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Hier haben wir das Protokoll zur Gewinnung und Erhaltung der guten und lebensfähigen Zellen für die Verwendung von therapeutischen Schritten, wie der Infusion von pluripotenten mesenchymalen Zellen, demonstriert. Der Hauptvorteil dabei ist, dass wir mit dieser Technik das lebensfähige Zellvolumen über die Zeit erhalten können, die im Isolierungsschritt der Zellen aus dem gesammelten Gewebe gewonnen wird. Diese Technik kann auf alle Krankheiten oder Zustände ausgedehnt werden, bei denen heterogene Medizin und Zelltherapie angewendet werden.Diese Methode kann auch auf zytogenomische Stabilitätstests in Bereichen wie Drogentests angewendet werden, in denen langfristige Zellkulturen gefördert werden können. Wenn Sie die lebenden Zellen manipulieren, seien Sie ruhig und zuversichtlich. Seien Sie extrem vorsichtig mit Sepsis und seien Sie ständig wachsam mit den Augen eines Wissenschaftlers, um Widrigkeiten zu beobachten und gute Entscheidungen zu treffen.Beginnen Sie mit dem Wiegen des Beutels und messen Sie die Temperatur mit einem digitalen berührungslosen Infrarot-Klinikthermometer. Lassen Sie den Beutel fünf Minuten lang in der Laminar-Flow-Kammer, um die fettigeren Schichten auszufällen und das Gewebe mit den Zellen zu trennen. Injizieren Sie 100 Milliliter DPBS mit Kalzium in den Transferbeutel und mischen Sie ihn mit den Händen.Lassen Sie es fünf Minuten stehen. Verwenden Sie dann eine 60-Milliliter-Spritze, die am Beuteladapter befestigt ist, um den größten Teil der Basalflüssigkeit zu entsorgen, die ausfällt. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal.Geben Sie 100 Milliliter der Verdauungslösung in den Beutel und lassen Sie ihn 30 Minuten bei 37 Grad Celsius unter langsamem Rühren. Dann den gesamten Inhalt des Beutels in vier 50-Milliliter-Konikusröhrchen geben und bei 400G für 10 Minuten bei 22 Grad Celsius zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 5 Milliliter DMEM niedrige Glukose, ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum, zum Zellpellet hinzu.Mischen Sie eine frische Lösung von 10 Mikrolitern Trypanblau bei 0,05% in destilliertem Wasser mit 10 Mikrolitern Zellsuspension für fünf Minuten. Verwenden Sie ein Inverslichtmikroskop bei 20-facher Vergrößerung und zählen Sie die lebensfähigen Zellen in einer Neubauer-Zellzählkammer. Suspendieren Sie das Zellpellet in einem kryoschützenden Medium bei einer Konzentration von 1 Million Zellen pro Milliliter.Dann 1 Milliliter dieser Mischung in Kryofläschchen geben. Verwenden Sie einen Gefrierbehälter mit einer Kühlgeschwindigkeit von 1 Grad Celsius pro Minute und lagern Sie ihn ein Jahr lang bei 80 Grad Celsius. Lagern Sie es nach einem Jahr in Standard-Kassettenboxen, die in flüssige Stickstoffdampfphase eingetaucht sind.In dieser Tabelle sind Daten aus verschiedenen Verfahrensschritten der neun Patienten dargestellt. Entsprechend der anfänglichen Zellausbeute wurde für jede Probe ein variables Zellvolumen bestimmt. 1 Milliliter Proben mit höherer Zellausbeute, 1,1 Milliliter für Proben mit mittlerer Zellausbeute und 2 Milliliter pro Probe mit geringerer Zellausbeute.Die zelluläre Ausbeute vor der Passage variierte stark, selbst wenn der gleiche Zusammenfluss vor der Trypsinisierung beobachtet wurde. Daher können hier die Zellen in Schichten gewachsen sein. Das repräsentative Bild zeigt die kunststoffadhärenten mesenchymalen ADSCs beim ersten Durchgang nach Isolierung bei der Lichtmikroskopie.Die Zellen zeigen eine Adhäsion an die plastische und Fibroblasten-ähnliche Morphologie. Die lebensfähigen Zellen, die in der Neubauer-Kammer im Trypanblau-Assay gezählt wurden, sind hier gezeigt. Die Durchflusszytometriedaten von sechs Patienten sind in dieser Tabelle dargestellt.Aus diesen CD45-negativen Zellen wurde der Prozentsatz der ADSCs mit verschiedenen Kombinationen von Stammzellmarkern bestimmt. Die repräsentativen Bilder zeigen die Subpopulation von Zellen, die positiv für Stammzell-assoziierte Marker in SVF von Fall neun nach acht Monaten Kryokonservierung sind. Hier ist R1 die gesamte zelluläre Region, die im Vorwärtsstreu- versus Seitenstreudiagramm analysiert wird.Und R2 ist die CD45-negative Region. CD73-, CD90- und CD105-Populationen sind in dieser Region positiv. Die ADSC-Differenzierung in Chondrozyten, Osteozyten und Adipozyten wird hier gezeigt.Denken Sie beim Versuch dieses Verfahrens daran, langsam zu rühren, vorzugsweise mit den Händen, während Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius stehen gelassen werden, um die Adhäsionen und Blasenbildung zu beobachten. Halten Sie die Temperatur im Arbeitsraum bei etwa 25 Grad Celsius und vermeiden Sie einen Temperaturschock bei viel höheren Temperaturen. Die Technik, die wir hier gezeigt haben, kann verwendet werden, um die pluripotenten mesenchymalen Zellen erfolgreich aus anderen Geweben zu isolieren.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Forschung

Medizin

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