Name: technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation
Uploaded: 2021-12-30T16:00:00
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Ringraziamo i pazienti che si sono offerti volontari per partecipare e il personale medico e infermieristico dell'Ospedale di San Paolo. Questo studio è stato sostenuto dalla Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e dal Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasile.

Il presente studio è approvato dal Comitato Etico dell'UNIFESP (numero di protocollo: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), eseguito dopo aver ottenuto il consenso informato scritto dei pazienti secondo la Dichiarazione di Helsinki (2004). Il campione del presente studio è composto da nove pazienti di sesso femminile, di età compresa tra 33 e 50 anni (età media 41,5) e indice di massa corporea iniziale medio (BMI) di 24,54 (compreso tra 22,32-26,77) (Tabella 1) che sono state sottoposte a addominopl...

Resa di isolamento E' assodato che il processo di crioconservazione, frequentemente richiesto nella terapia cellulare, comporta una significativa perdita cellulare, talvolta superiore al 50%29,30,35. Pertanto, un miglioramento tecnico per ottenere un'elevata resa cellulare iniziale in isolamento è fondamentale. Il metodo di raccolta del lipoaspirato e il metodo di isolamento delle cellule devono concentrarsi...

Le cellule staminali mesenchimali umane sono vantaggiose sia nella ricerca di base che in quella applicata. L'uso di questo tipo di cellula adulta supera le questioni etiche - rispetto all'uso di cellule embrionali o di altro tipo - essendo una delle aree di studio più promettenti nell'ingegneria della rigenerazione dei tessuti autologhi e nella terapia cellulare1, come l'area neoplastica, il trattamento delle malattie degenerative e le applicazioni terapeutiche nell'area della chirurgia ricostruttiva 2,3,4, 5. È stato precedentemente riportato che esiste un'abbondante fonte di cellule staminali mesenchimali multipotenti e pluripotenti nella frazione vascolare stromale del tessuto adiposo 6,7. Questi ADSC sono considerati ottimi candidati per l'uso nella terapia cellulare e nel trapianto/infusione poiché un numero considerevole di cellule con una forte capacità di espansione ex vivo può essere facilmente ottenuto con un alto rendimento da una procedura minimamente invasiva 5,8.
È stato inoltre dimostrato che il tessuto adiposo presenta una maggiore capacità di fornire cellule staminali mesenchimali rispetto ad altre due fonti (midollo osseo e tessuto del cordone ombelicale)9. Oltre ad essere scarsamente immunogenico e ad avere un'elevata capacità di integrarsi nel tessuto ospite e di interagire con i tessuti circostanti4,10, l'ADSC ha una capacità multipotente di differenziazione in linee cellulari, con segnalazioni di differenziazione condrogena, osteogenica e miogenica in appropriate condizioni di coltura11,12,13, e in cellule, come pancreatiche, epatociti, e cellule neurogeniche14,15,16.
La comunità scientifica concorda sul fatto che l'effetto immunomodulatore delle cellule staminali mesenchimali è un meccanismo d'azione più rilevante per la terapia cellulare17,18,19 rispetto alla loro proprietà di differenziazione. Uno dei meriti più significativi dell'uso dell'ADSC è la possibilità di infusione autologa o innesto, diventando un trattamento alternativo per diverse malattie. Per la medicina rigenerativa, gli ADSC sono già stati utilizzati in caso di danno epatico, ricostruzione del muscolo cardiaco, rigenerazione del tessuto nervoso, miglioramento della funzione del muscolo scheletrico, rigenerazione ossea, terapia del cancro e trattamento del diabete20,21.
Ad oggi, ci sono 263 studi clinici registrati per la valutazione del potenziale di ADSC, elencati sul sito web del National Institutes of Health degli Stati Uniti22. Sono stati stabiliti diversi protocolli per la raccolta del tessuto adiposo, ma non c'è consenso in letteratura su un metodo standardizzato per isolare l'ADSC per uso clinico23,24. I metodi di lavorazione del lipoaspirato durante e dopo l'intervento chirurgico possono influenzare direttamente la vitalità cellulare, la resa cellulare finale25 e la qualità della popolazione ADSC20. Per quanto riguarda il pretrattamento chirurgico, non è ben stabilito quale tecnica di pretrattamento chirurgico produca un numero più significativo di cellule vitali dopo l'isolamento o se la soluzione anestetica iniettata nel tessuto adiposo influenzi la resa cellulare e le sue funzioni26. Allo stesso modo, la differenza tra le tecniche per ottenere cellule adipose può portare a una diminuzione fino al 70% del numero di ADSC20 vitali. Secondo la letteratura, i trattamenti meccanici per ottenere popolazioni cellulari con elevata vitalità, compresi gli ultrasuoni, dovrebbero essere evitati, poiché possono abbattere il tessuto adiposo20. Tuttavia, il metodo manuale di aspirazione del grasso con siringhe è meno dannoso, causando meno distruzione cellulare, con la liposuzione tumescente che produce un numero significativo di cellule con la migliore qualità26.
Questa tecnica utilizza una soluzione salina con lidocaina ed epinefrina che viene iniettata nell'area di liposuzione. Per ogni volume di 3 mL di soluzione iniettata, viene aspirato 1 mL. In questo studio è stata eseguita la tecnica di liposuzione umida, in cui per ogni 1 ml di soluzione adrenalinica e salina iniettata, vengono aspirati 0,2 ml di tessuto adiposo. L'uso di enzimi digestivi, in particolare la collagenasi, è comune per il processo di isolamento dell'ADSC.
Dopo la prima fase di isolamento in laboratorio, il pellet finale viene chiamato frazione vascolare stromale (SVF). Contiene diversi tipi di cellule27, tra cui cellule precursori endoteliali, cellule endoteliali, macrofagi, cellule muscolari lisce, linfociti, periciti, pre-adipociti e ADSC, che sono in grado di aderire. Una volta concluso l'isolamento finale da colture in vitro , le cellule che non hanno aderito alla plastica vengono eliminate in scambi medi. Dopo otto settimane di espansione, cambiamenti di mezzo e passaggi, gli ADSC rappresentano la maggior parte della popolazione cellulare nei palloni20. Uno dei vantaggi più significativi dell'utilizzo di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo isolato per una possibile terapia futura è la possibilità di crioconservazione. È stato dimostrato che il lipoaspirato crioconservato è una potenziale fonte di cellule SVF anche dopo 6 settimane di congelamento28, con attività biologica anche dopo 2 anni di crioconservazione29, e piena capacità di crescere e differenziarsi in coltura30. Tuttavia, durante il processo di scongelamento, una percentuale considerevole di cellule viene solitamente persa31. Pertanto, il processo di rimozione del lipoaspirato e i seguenti metodi di isolamento cellulare devono garantire la massima resa cellulare.
Questo studio descrive una metodologia più rapida per la raccolta e l'isolamento dell'ADSC, dimostrando un'elevata resa cellulare e vitalità per una migliore efficienza delle terapie cellulari. Inoltre, è stato valutato l'effetto di questa tecnica migliorata dopo la crioconservazione SVF a lungo termine.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL cryovials</td>
			<td>Nunc Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>340711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL polyvinyl chloride transfer bag</td>
			<td>JP FARMA</td>
			<td>80146150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adrenaline (1 mg/mL)</td>
			<td>Hipolabor</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,01,647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride 10%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine gluconate 4%</td>
			<td>VIC PHARMA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,00,496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS100</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live and Dead Cell Assay</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>01-3333-41 | 01-3333-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD105</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD11B</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD19</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD34</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>747822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD45</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD73</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD90</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>553011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: HLA-DR</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>340827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile connector with one spike with needle injection site</td>
			<td>Origen Biomedical Connector, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Code mark: IBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation

Le cellule staminali mesenchimali umane derivate dal tessuto adiposo sono diventate sempre più attraenti in quanto mostrano caratteristiche appropriate e sono una fonte accessibile per applicazioni cliniche rigenerative. Diversi protocolli sono stati utilizzati per ottenere cellule staminali derivate dal tessuto adiposo. Questo articolo descrive diversi passaggi di un protocollo migliorato che consente di risparmiare tempo per ottenere una quantità più significativa di ADSC, mostrando come crioconservare e scongelare ADSC per ottenere cellule vitali per l'espansione della coltura. Sono stati raccolti cento millilitri di lipoaspirato, utilizzando una liposuzione a siringa a tre fori e calibro 3 mm da 26 cm, dalla zona addominale di nove pazienti successivamente sottoposti a addominoplastica elettiva. L'isolamento delle cellule staminali è stato effettuato con una serie di lavaggi con soluzione salina tamponata fosfato (DPBS) di Dulbecco integrata con calcio e l'uso di collagenasi. Le cellule della frazione vascolare stromale (SVF) sono state crioconservate e la loro vitalità è stata controllata mediante immunofenotipizzazione. La resa cellulare SVF era 15,7 x 105 cellule/ml, compresa tra 6,1-26,2 cellule/ml. Le cellule SVF aderenti hanno raggiunto la confluenza dopo una media di 7,5 (±4,5) giorni, con una resa cellulare media di 12,3 (± 5,7) x 105 cellule/ml. La vitalità della SVF scongelata dopo 8 mesi, 1 anno e 2 anni variava tra il 23,06% e il 72,34% con una media del 47,7% (±24,64) con la vitalità più bassa correlata ai casi di congelamento a due anni. L'uso della soluzione DPBS integrata con calcio e tempi di riposo del sacchetto per la precipitazione dei grassi con un tempo più breve di digestione della collagenasi ha comportato un aumento della resa cellulare finale delle cellule staminali. La procedura dettagliata per ottenere alte rese di cellule staminali vitali era più efficiente per quanto riguarda il tempo e la resa cellulare rispetto alle tecniche degli studi precedenti. Anche dopo un lungo periodo di crioconservazione, cellule ADSC vitali sono state trovate nella SVF.

La caratterizzazione dei nove individui studiati, compresa la loro età, peso, altezza e BMI, sono mostrati nella Tabella 1.
In base alla resa cellulare inizialmente presentata, il volume cellulare inoculato in coltura è stato calcolato per essere il più vicino possibile alla capacità del matraccio di coltura da 75 cm2. Il volume campione seminato in ciascun caso è descritto nella tabella 2. Quindi, in base alla resa cellulare iniziale, è stato...

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Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Il presente protocollo descrive una metodologia migliorata per l'isolamento ADSC con conseguente enorme resa cellulare con guadagno di tempo rispetto alla letteratura. Questo studio fornisce anche un metodo semplice per ottenere un numero relativamente elevato di cellule vitali dopo la crioconservazione a lungo termine.

Tecnica per ottenere cellule staminali mesenchimali dal tessuto adiposo e dalla caratterizzazione della frazione vascolare stromale nella crioconservazione a lungo termine

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Qui, abbiamo dimostrato il protocollo per ottenere e preservare le cellule buone e vitali per usi di fasi terapeutiche, come l'infusione di cellule mesenchimali pluripotenti. Il vantaggio principale di questo, che utilizzando questa tecnica, possiamo ottenere il volume cellulare vitale rispetto al tempo guadagnato nella fase di isolamento delle cellule dal tessuto raccolto. Questa tecnica può essere estesa a tutte le malattie o condizioni in cui vengono applicate la medicina eterogena e la terapia cellulare.Questo metodo può essere applicato anche ai test di stabilità citogenomica in aree come i test farmacologici, dove possono essere incoraggiate colture cellulari a lungo termine. Ogni volta che manipolate le cellule vive, siate calmi e fiduciosi. Fai estrema attenzione alla sepsi e sii costantemente vigile con gli occhi di uno scienziato per osservare eventuali avversità e prendere buone decisioni.Inizia pesando la sacca e misurando la temperatura con un termometro clinico digitale a infrarossi senza contatto. Lasciare la sacca per cinque minuti all'interno della camera a flusso laminare per precipitare gli strati più grassi e separare il tessuto contenente le cellule. Iniettare 100 millilitri di DPBS con calcio nella sacca di trasferimento e mescolare con le mani.Lasciare riposare per cinque minuti. Quindi utilizzare una siringa da 60 millilitri collegata all'adattatore del sacchetto per eliminare la maggior parte del liquido basale che precipita. Ripeti questo processo due volte.Aggiungere 100 millilitri della soluzione di digestione al sacchetto e lasciarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti sotto lenta agitazione. Quindi trasferire tutto il contenuto del sacchetto in quattro tubi conici da 50 millilitri e centrifugarli a 400G per 10 minuti a 22 gradi Celsius. Scartare il surnatante e aggiungere 5 millilitri di DMEM a basso glucosio integrato con il 20% di siero bovino fetale al pellet cellulare.Mescolare una soluzione fresca di 10 microlitri di tripano blu allo 0,05% in acqua distillata con 10 microlitri di sospensione cellulare per cinque minuti. Utilizzare un microscopio a luce invertita con ingrandimento 20X e contare le cellule vitali in una camera di conteggio delle cellule Neubauer. Sospendere il pellet cellulare in un mezzo crioprotettivo ad una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro.Quindi posizionare 1 millilitro di questa miscela in flaconcini di crio. Utilizzare un contenitore di congelamento con una velocità di raffreddamento di 1 grado Celsius al minuto e conservare a 80 gradi Celsius per un anno. Dopo un anno, conservarlo in scatole standard immerse in fase di vapore di azoto liquido.I dati delle diverse fasi della procedura dei nove pazienti sono presentati in questa tabella. In base alla resa cellulare iniziale, è stato determinato un volume variabile di cellule per ciascun campione. 1 millilitro di campioni con resa cellulare più elevata, 1,1 millilitri per campioni con resa cellulare intermedia e 2 millilitri per campioni con resa cellulare inferiore.La resa cellulare prima del passaggio uno variava ampiamente anche quando si osservava la stessa confluenza prima della tripsinizzazione. Pertanto, qui le cellule potrebbero essere cresciute a strati. L'immagine rappresentativa mostra le ADSC mesenchimali plastico-aderenti al primo passaggio dopo l'isolamento al microscopio ottico.Le cellule mostrano adesione alla morfologia plastica e fibroblasto. Le cellule vitali contate nella camera di Neubauer nel saggio del blu di tripano sono mostrate qui. I dati di citometria a flusso di sei pazienti sono presentati in questa tabella.Da queste cellule CD45 negative, è stata determinata la percentuale di ADSC con diverse combinazioni di marcatori delle cellule staminali. Le immagini rappresentative mostrano la sottopopolazione di cellule positive per i marcatori associati alle cellule staminali nella SVF del caso nove dopo otto mesi di crioconservazione. Qui, R1 è la regione cellulare totale analizzata nel grafico di dispersione diretta rispetto al grafico di dispersione laterale.E R2 è la regione CD45 negativa. Le popolazioni CD73, CD90 e CD105 sono positive in questa regione. La differenziazione ADSC nei condrociti, negli osteociti e negli adipociti è mostrata qui.Durante il tentativo di questa procedura, ricordarsi di mescolare lentamente, preferibilmente con le mani, lasciando a 37 gradi Celsius per 30 minuti per osservare le aderenze e le vesciche. Mantenere la temperatura della stanza di lavoro intorno ai 25 gradi Celsius ed evitare qualsiasi shock termico a temperature molto più elevate. La tecnica che abbiamo mostrato qui può essere utilizzata per isolare con successo le cellule mesenchimali pluripotenti da altri tessuti.

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