Name: technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation
Uploaded: 2021-12-30T16:00:00
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ボランティアで参加してくださった患者さん、サンパウロ病院の医療・看護スタッフに感謝します。この研究は、サンパウロ州アンパロ・ペスキサ・ド・エスタード・デ・サンパウロ財団(FAPESP)およびブラジルのコンセリョ・ナシオナル・デ・デセンボルビメント・シエンティフィコ・エ・テクノロヒコ(CNPq)の支援を受けた。

本研究は、UNIFESPの倫理委員会(プロトコル番号:0029/2015 CAAE:40846215.0.0000.5505)によって承認され、 ヘルシンキ宣言(2004)に従って患者から書面によるインフォームドコンセントを取得した後に実施されます。本研究のサンプルは、33〜50歳(平均年齢41.5歳)および平均初期ボディマス指数(BMI)24.54(22.32〜26.77の範囲)(表1)の9人の女性患者で構成されています 妊娠後の皮膚の過剰のために審美...

単離収率 細胞療法で頻繁に必要とされる凍結保存プロセスは、時には50%を超える重大な細胞損失をもたらすことは十分に確立されています29,30,35。したがって、単離して高い初期細胞収量を得るための技術的改善が基本である。脂肪吸引液の採取方法と細胞の単離方法は、細胞の長期培養と操作を考慮しな?...

ヒト間葉系幹細胞は、基礎研究と応用研究の両方で有利です。この成体細胞型の使用は、胚や他の細胞の使用と比較して倫理的問題を克服し、腫瘍領域、変性疾患の治療、再建手術領域2,3,4の治療など、自家組織再生工学および細胞治療における最も有望な研究分野の1つです。5.脂肪組織の間質血管細胞画分には間葉系多能性および多能性幹細胞の豊富な供給源があることが以前に報告されている6,7。これらのADSCは、最小限の侵襲的手順から、ex vivoでの強力な増殖能力を有するかなりの数の細胞を高収率で容易に得ることができるため、細胞療法および移植/注入に使用するための優れた候補と考えられている5,8。
また、脂肪組織は、他の2つの供給源(骨髄および臍帯組織)よりも間葉系幹細胞を提供する能力が高いことも実証されました9。ADSCは、免疫原性が低く、宿主組織に統合し、周囲の組織と相互作用する能力が高いことに加えて4,10、細胞株への分化の多能性能力を有し、適切な培養条件下での軟骨形成、骨形成、および筋原性分化の報告があります11,12,13、および膵臓、肝細胞などの細胞への分化、 神経原性細胞14,15,16。
科学界は、間葉系幹細胞の免疫調節効果が、その分化特性よりも細胞療法にとってより関連性のある作用機序であることに同意しています17,18,19。ADSC使用の最も重要なメリットの1つは、自家注入または移植の可能性であり、いくつかの疾患の代替治療になります。再生医療では、肝障害、心筋の再建、神経組織の再生、骨格筋機能の改善、骨の再生、がん治療、糖尿病治療などにADSCがすでに使用されています20,21。
現在までに、ADSCの可能性を評価するための263の登録臨床試験があり、米国国立衛生研究所のウェブサイトに記載されています22。脂肪組織を採取するためのさまざまなプロトコルが確立されていますが、臨床使用のためにADSCを分離するための標準化された方法についての文献にはコンセンサスがありません23,24。手術中および手術後の脂肪吸引処理方法は、細胞生存率、最終的な細胞収量25、およびADSC集団の質20に直接影響する可能性があります。外科的前処理に関しては、どの外科的前処理技術が単離後により多くの有意な数の生細胞を生成するか、または脂肪組織に注入された麻酔薬溶液が細胞収量およびその機能に影響を与えるかどうかは十分に確立されていない26。同様に、脂肪細胞を得るための技術間の違いは、生存可能なADSC20の数の70%もの減少をもたらし得る。文献によれば、超音波を含む高い生存率を有する細胞集団を得るための機械的処置は、脂肪組織を分解する可能性があるため、避けるべきである20。ただし、注射器を使用した手動脂肪吸引法は害が少なく、細胞破壊が少なく、腫脹性脂肪吸引により、最高品質のかなりの数の細胞が得られます26。
この技術は、脂肪吸引領域に注入されるリドカインとエピネフリンを含む生理食塩水を使用します。注入された溶液の容量3 mLごとに、1 mLが吸引されます。この研究では、1 mLのアドレナリンと生理食塩水を注入するごとに、0.2 mLの脂肪組織を吸引する湿式脂肪吸引技術を実施しました。消化酵素、特にコラゲナーゼの使用は、ADSCを単離するプロセスに一般的です。
実験室での最初の単離ステップの後、最終的なペレットは間質血管画分(SVF)と呼ばれます。これには、内皮前駆細胞、内皮細胞、マクロファージ、平滑筋細胞、リンパ球、周皮細胞、前脂肪細胞、および接着が可能なADSCを含む、さまざまな細胞タイプ27が含まれています。 in vitro 培養からの最終的な単離が完了すると、プラスチックに接着しなかった細胞は培地交換で排除されます。8週間の増殖、培地交換、および継代の後、ADSCはフラスコ20内の細胞集団の大部分を表す。将来の治療の可能性のために単離された脂肪由来幹細胞を使用することの最も重要な利点の1つは、凍結保存の可能性です。凍結保存された脂肪吸引液は、6週間の凍結後でもSVF細胞の潜在的な供給源であり28、2年間の凍結保存後でも生物学的活性があり29、培養で増殖および分化する完全な能力があることが実証されました30。しかしながら、融解プロセス中に、かなりの割合の細胞が通常失われる31。したがって、脂肪吸引除去プロセスおよび以下の細胞単離方法は、最高の細胞収率を確保しなければならない。
この研究では、ADSCを収集して分離するためのより迅速な方法論について説明し、細胞治療の効率を向上させるための高い細胞収量と生存率を実証します。さらに、SVF凍結保存後のこの改良技術の効果を評価した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL cryovials</td>
			<td>Nunc Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>340711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL polyvinyl chloride transfer bag</td>
			<td>JP FARMA</td>
			<td>80146150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adrenaline (1 mg/mL)</td>
			<td>Hipolabor</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,01,647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride 10%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine gluconate 4%</td>
			<td>VIC PHARMA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,00,496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS100</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live and Dead Cell Assay</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>01-3333-41 | 01-3333-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD105</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD11B</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD19</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD34</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>747822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD45</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD73</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD90</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>553011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: HLA-DR</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>340827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile connector with one spike with needle injection site</td>
			<td>Origen Biomedical Connector, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Code mark: IBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation

脂肪組織由来のヒト間葉系幹細胞は、適切な特徴を示し、再生臨床応用のためのアクセス可能な供給源であるため、ますます魅力的になっています。脂肪由来幹細胞を得るために、異なるプロトコルが使用されている。この記事では、より大量のADSCを得るために改良された時間節約プロトコルのさまざまなステップについて説明し、ADSCを凍結保存および解凍して培養増殖用の生細胞を取得する方法を示します。その後待機的腹部形成術を受けた9人の患者の腹部から、26cmの3穴および3mm口径のシリンジ脂肪吸引を使用して、100ミリリットルの脂肪吸引液を採取した。幹細胞の単離は、カルシウムを添加したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)溶液およびコラゲナーゼの使用による一連の洗浄で行った。間質血管画分(SVF)細胞を凍結保存し、その生存率をイムノフェノタイピングによって確認しました。SVF細胞収量は15.7 x 105 細胞/ mLであり、6.1〜26.2細胞/ mLの範囲でした。接着性SVF細胞は平均7.5(±4.5)日後にコンフルエントに達し、平均細胞収量は12.3(± 5.7)x 105 細胞/mLでした。8ヶ月、1年、2年後の解凍SVFの生存率は23.06%〜72.34%の範囲で、平均47.7%(±24.64)であり、2年間の凍結の場合と相関する生存率は最も低かった。カルシウムとバッグの休止時間を補ったDPBS溶液を使用して脂肪を沈殿させ、コラゲナーゼ消化時間を短縮すると、幹細胞の最終細胞収量が増加しました。生幹細胞を高収率で得るための詳細な手順は、以前の研究の技術よりも時間と細胞収率に関してより効率的でした。長期間の凍結保存後でも、SVFに生菌ADSC細胞が見出された。

年齢、体重、身長、BMIなど、調査した9人の個人の特徴を 表1に示します。
最初に提示した細胞収量に従って、培養液に接種される細胞量は、75cm2 培養フラスコの容量にできるだけ近いと計算した。それぞれの場合において播種したサンプル量を 表2に記載する。次に、初期細胞収量に従って、各サンプルの可変容量の細胞を決定しました...

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Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

本プロトコルは、文献と比較して時間的増加を伴う途方もない細胞収量をもたらすADSC単離のための改良された方法論を記載する。この研究はまた、長期凍結保存後に比較的多数の生細胞を得るための簡単な方法を提供します。

脂肪組織から間葉系幹細胞を得る技術および長期凍結保存における間質血管画分のキャラクタリゼーション

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

ここでは、多能性間葉系細胞の注入などの治療ステップの使用のための良好で生存可能な細胞を取得および保存するためのプロトコルを実証しました。これの主な利点は、この技術を使用して、採取した組織からの細胞の単離工程で得られた時間に対する生細胞体積を得ることができることである。この技術は、異質医療と細胞療法が適用されるすべての疾患または状態に対して拡張することができます。この方法は、薬物検査など、長期間の細胞培養が奨励される分野での細胞ゲノム安定性試験にも適用できます。生細胞を操作するときはいつでも、落ち着いて自信を持ってください。敗血症には細心の注意を払い、科学者の目で常に注意を払い、逆境を観察し、適切な決定を下してください。バッグの重量を量り、デジタル非接触赤外線体温計で温度を測定することから始めます。バッグを層流チャンバー内に5分間放置して、脂っこい層を沈殿させ、細胞を含む組織を分離します。カルシウム入りのDPBS100ミリリットルをトランスファーバッグに注入し、手で混ぜます。5分間放置します。次に、バッグアダプターに取り付けられた60ミリリットルのシリンジを使用して、沈殿する基礎液のほとんどを廃棄します。このプロセスを2回繰り返します。100ミリリットルの消化液をバッグに加え、ゆっくりと攪拌しながら37°Cで30分間放置します。次に、バッグの内容物をすべて4本の50ミリリットルのコニカルチューブに移し、摂氏22度で10分間400Gで遠心分離します。上清を廃棄し、20%ウシ胎児血清を添加した5ミリリットルのDMEM低グルコースを細胞ペレットに加えます。10マイクロリットルのトリパンブルーの新鮮な溶液を0.05%の蒸留水と10マイクロリットルの細胞懸濁液と5分間混合します。20倍の倍率で倒立光学顕微鏡を使用し、ノイバウアー細胞計数チャンバー内の生細胞をカウントします。細胞ペレットを1ミリリットルあたり100万細胞の濃度の凍結保護培地に懸濁します。次に、この混合物1ミリリットルをクライオバイアルに入れます。1分間に1°Cの冷却速度で冷凍容器を使用し、80°Cで1年間保管してください。1年後、液体窒素気相に浸した標準的なカセットボックスに保管してください。9人の患者からの処置の異なるステップからのデータがこの表に示されている。初期細胞収量に従って、各試料の可変体積の細胞が決定された。細胞収量の高いサンプルは1ミリリットル、細胞収量は中間のサンプルの場合は1.1ミリリットル、細胞収量が低いサンプルは1ミリリットルです。継代前の細胞収率は、トリプシン処理前に同じコンフルエントが観察された場合でも大きく変動した。したがって、ここで細胞は層状に成長している可能性があります。代表的な画像は、光学顕微鏡で単離した後の最初の通過におけるプラスチック付着性間葉系ADSCを示しています。細胞は、プラスチックおよび線維芽細胞様形態への接着を示す。トリパンブルーアッセイでノイバウアーチャンバーでカウントされた生細胞をここに示します。6人の患者からのフローサイトメトリーデータをこの表に示します。これらのCD45陰性細胞から、幹細胞マーカーの異なる組み合わせを有するADSCの割合が決定された。代表的な画像は、8ヶ月間の凍結保存後の症例9のSVFにおける幹細胞関連マーカー陽性の細胞の亜集団を示す。ここで、R1は、前方散乱対側散布図で分析された全細胞領域です。そしてR2はCD45陰性領域である。CD73、CD90、およびCD105集団はこの地域で陽性です。軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞におけるADSC分化をここに示します。この手順を試みるときは、癒着と水ぶくれを観察するために摂氏37度で30分間放置しながら、できれば手でゆっくりとかき混ぜることを忘れないでください。作業室の温度を摂氏25度前後に保ち、はるかに大きな温度での熱衝撃を避けてください。ここで示した技術は、多能性間葉系細胞を他の組織から首尾よく単離するために使用することができる。

Research

JoVE Journal

Medicine

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