Name: technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation
Uploaded: 2021-12-30T16:00:00
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참여에 자원한 환자들과 상파울루 병원의 의료 및 간호 직원들에게 감사드립니다. 이 연구는 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)와 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)의 지원을 받았습니다.

본 연구는 UNIFESP 윤리위원회 (프로토콜 번호 : 0029/2015 CAAE : 40846215.0.0000.5505)의 승인을 받았으며, 헬싱키 선언 (2004)에 따라 환자로부터 서면 동의를받은 후 수행되었습니다. 본 연구의 샘플은 33-50 세 (평균 연령 41.5)이고 평균 초기 체질량 지수 (BMI)가 24.54 (22.32-26.77 사이) (표 1)의 9 명의 여성 환자로 구성되어 있으며, 상파울루 연방 대학교 (UNIFESP)의 성형 외과 부서에서 임신 후 피부 과?...

절연 수율 세포 치료에 자주 요구되는 동결 보존 과정은 때로는 50 % 이상의 상당한 세포 손실을 초래한다는 것이 잘 알려져 있습니다.29,30,35. 따라서, 고립 된 상태에서 높은 초기 세포 수율을 얻기위한 기술적 개선이 기본이다. 지방 흡인물의 수집 방법과 세포의 분리 방법은 세포의 장기 배양 및 조작을 고려하?...

인간 중간엽 줄기세포는 기초 및 응용 연구 모두에서 유리합니다. 이 성체 세포 유형의 사용은 배아 또는 다른 세포의 사용과 비교하여 윤리적 문제를 능가하며, 신생물 영역, 퇴행성 질환 치료 및 재건 수술 영역의 치료 응용 분야와 같은자가 조직 재생 공학 및 세포 치료1에서 가장 유망한 연구 분야중 하나입니다 2,3,4, 5. 지방 조직의 기질 혈관 세포 분획에 중간엽 다능성 및 만능 줄기 세포의 풍부한 공급원이 있다고 이전에 보고되었습니다 6,7. 이러한 ADSC는 최소 침습적 절차5,8에서 높은 수율로 생체 외 확장 능력을 가진 상당한 수의 세포를 쉽게 얻을 수 있기 때문에 세포 치료 및 이식/주입에 사용하기에 훌륭한 후보로 간주됩니다.
또한 지방 조직은 다른 두 가지 공급원(골수 및 탯줄 조직)보다 중간엽 줄기 세포를 제공할 수 있는 더 큰 능력을 제공한다는 것이 입증되었습니다9. ADSC는 면역원성이 낮고 숙주 조직에 통합되고 주변 조직과 상호 작용하는 능력이 높을 뿐만 아니라4,10, 적절한 배양 조건11,12,13 및 췌장, 간세포와 같은 세포로의 연골성, 골인성 및 근원성 분화에 대한 보고와 함께 세포주로의 분화 다분화능을 가지고 있습니다. 및 신경성 세포14,15,16.
과학계는 중간엽 줄기세포의 면역 조절 효과가 분화 특성보다 세포 치료17,18,19에 더 관련성이 높은 작용 메커니즘이라는 데 동의합니다. ADSC 사용의 가장 중요한 장점 중 하나는이 자가 주입 또는 이식의 가능성으로 여러 질병에 대한 대체 치료법이됩니다. 재생 의학의 경우 ADSC는 이미 간 손상, 심장 근육 재건, 신경 조직 재생, 골격근 기능 개선, 뼈 재생, 암 치료 및 당뇨병 치료20,21의 경우에 사용되었습니다.
현재까지 ADSC의 잠재력 평가를 위해 등록 된 임상 시험은 263 건이며 미국 국립 보건원22 웹 사이트에 나와 있습니다. 지방 조직을 수확하기위한 다른 프로토콜이 확립되었지만, 임상 사용을 위해 ADSC를 분리하는 표준화 된 방법에 대한 문헌에는 합의가 없다23,24. 수술 중 및 수술 후의 지방 흡인 처리 방법은 세포 생존율, 최종 세포 수율25 및 ADSC 집단20의 품질에 직접적인 영향을 미칠 수 있습니다. 외과적 전처리와 관련하여, 어떤 외과적 전처리 기술이 분리 후 더 많은 수의 생존 세포를 생성하는지 또는 지방 조직에 주입된 마취액이 세포 수율 및 그 기능에 영향을 미치는지 여부는 잘 확립되어 있지 않다26. 유사하게, 지방 세포를 얻기 위한 기술 사이의 차이는 생존 가능한 ADSC(20)의 수의70%만큼 감소를 초래할 수 있다. 문헌에 따르면, 초음파를 포함하여 높은 생존력을 갖는 세포 집단을 얻기위한 기계적 처리는 지방 조직(20)을 분해 할 수 있기 때문에 피해야한다. 그러나 주사기를 사용한 수동 지방 흡인 방법은 덜 해롭기 때문에 세포 파괴가 적으며 격렬한 지방 흡입술은 최고의 품질을 가진 상당한 수의 세포를 생성합니다26.
이 기술은 지방 흡입 부위에 주입되는 리도카인과 에피네프린이 함유 된 식염수를 사용합니다. 주입 된 용액 3mL 부피마다 1mL가 흡인됩니다. 이 연구에서는 아드레날린과 식염수 1mL를 주입 할 때마다 0.2mL의 지방 조직을 흡인하는 습식 지방 흡입 기술을 수행했습니다. 소화 효소, 특히 콜라게나 제의 사용은 ADSC를 분리하는 과정에서 일반적입니다.
실험실에서 첫 번째 분리 단계 후 최종 펠릿을 기질 혈관 분획(SVF)이라고 합니다. 그것은 내피 전구체 세포, 내피 세포, 대식세포, 평활근 세포, 림프구, 혈관주위세포, 예비지방세포 및 ADSC를 포함하는, 부착이 가능한 상이한 세포 유형(27)을 함유한다. 시험관 내 배양에서 최종 분리가 완료되면 플라스틱에 부착되지 않은 세포는 배지 교환에서 제거됩니다. 8주간의 팽창, 배지 변화, 및 계대 배양 후, ADSC는 플라스크(20) 내의 대부분의 세포 집단을 나타낸다. 가능한 미래 치료를 위해 분리 된 지방 유래 줄기 세포를 사용하는 가장 중요한 이점 중 하나는 동결 보존의 가능성입니다. 냉동 보존 된 지방 흡인물은 6 주간의 냉동28 후에도 SVF 세포의 잠재적 공급원이며, 2 년의 냉동 보존29 후에도 생물학적 활성이 있으며, 배양30에서 성장하고 분화 할 수있는 완전한 능력을 가지고 있음이 입증되었습니다. 그러나, 해동 과정 동안, 상당한 비율의 세포가 보통 손실된다(31). 따라서 지방 흡인 제거 과정과 다음과 같은 세포 분리 방법은 최고의 세포 수율을 보장해야합니다.
이 연구는 ADSC를 수집하고 분리하는 더 빠른 방법론을 설명하여 세포 치료제의 효율성을 높이기 위해 높은 세포 수율과 생존력을 보여줍니다. 또한, 장기 SVF 동결 보존 후이 개선 된 기술의 효과가 평가되었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL cryovials</td>
			<td>Nunc Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>340711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL polyvinyl chloride transfer bag</td>
			<td>JP FARMA</td>
			<td>80146150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adrenaline (1 mg/mL)</td>
			<td>Hipolabor</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,01,647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride 10%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine gluconate 4%</td>
			<td>VIC PHARMA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,00,496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS100</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live and Dead Cell Assay</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>01-3333-41 | 01-3333-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD105</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD11B</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD19</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD34</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>747822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD45</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD73</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD90</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>553011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: HLA-DR</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>340827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile connector with one spike with needle injection site</td>
			<td>Origen Biomedical Connector, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Code mark: IBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation

지방 조직에서 유래한 인간 중간엽 줄기세포는 적절한 특징을 보여주고 재생 임상 적용을 위한 접근 가능한 공급원이 됨에 따라 점점 더 매력적이 되고 있습니다. 지방 유래 줄기 세포를 얻기 위해 다른 프로토콜이 사용되었습니다. 이 기사에서는 더 많은 양의 ADSC를 얻기 위해 개선된 시간 절약 프로토콜의 여러 단계를 설명하고 배양 확장을 위한 생존 가능한 세포를 얻기 위해 ADSC를 냉동 보존 및 해동하는 방법을 보여줍니다. 26cm 3 구멍 및 3mm 구경 주사기 지방 흡입술을 사용하여 선택적 복부 성형술을받은 9 명의 환자의 복부에서 100 밀리리터의 지방 흡인물을 수집했습니다. 줄기 세포 분리는 칼슘이 보충 된 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS) 용액과 콜라게나 제를 사용하여 일련의 세척으로 수행되었습니다. 기질 혈관 분획 (SVF) 세포를 냉동 보존하고 면역 표현형으로 생존력을 확인했습니다. SVF 세포 수율은 15.7 x 105 세포 / mL, 6.1-26.2 세포 / mL 범위였습니다. 부착 SVF 세포는 평균 7.5 (±4.5) 일 후에 합류에 도달했으며 평균 세포 수율은 12.3 (± 5.7) x 105 세포 / mL입니다. 8 개월, 1 년 및 2 년 후 해동 된 SVF의 생존력은 23.06 % -72.34 % 사이였으며 평균 47.7 % (±24.64)로 2 년 동결 사례와 관련하여 가장 낮은 생존력을 보였다. 칼슘이 보충 된 DPBS 용액과 콜라게나제 소화 시간이 짧은 지방 침전을위한 가방 휴식 시간을 사용하면 줄기 세포의 최종 세포 수율이 증가했습니다. 생존 가능한 줄기 세포의 높은 수율을 얻기위한 상세한 절차는 이전 연구의 기술보다 시간과 세포 수율과 관련하여 더 효율적이었습니다. 장기간의 동결 보존 후에도 SVF에서 생존 가능한 ADSC 세포가 발견되었습니다.

나이, 체중, 키 및 BMI를 포함하여 연구 된 9 명의 개인의 특성은 표 1에 나와 있습니다.
초기에 제시된 세포 수율에 따라, 배양물에 접종된 세포 부피는 75cm2 배양 플라스크의 용량에 가능한 한 근접한 것으로 계산되었다. 각 경우에 시딩된 샘플 부피는 표 2에 설명되어 있습니다. 그런 다음 초기 세포 수율에 따라 각 샘플에 대한 다양한 세포 부?...

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Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

본 프로토콜은 ADSC 단리를 위한 개선된 방법론을 기술하여 문헌에 비해 시간 이득과 함께 엄청난 세포 수율을 초래한다. 이 연구는 또한 장기 동결보존 후 비교적 많은 수의 생존 가능한 세포를 얻기 위한 간단한 방법을 제공합니다.

지방 조직에서 중간엽 줄기세포를 얻는 기술 및 장기 냉동 보존에서 기질 혈관 분획 특성 분석

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

여기에서 우리는 만능 중간엽 세포의 주입과 같은 치료 단계의 사용을 위해 양호하고 생존 가능한 세포를 얻고 보존하기 위한 프로토콜을 시연했습니다. 이것의 주요 이점은이 기술을 사용하여 수집 된 조직으로부터 세포의 분리 단계에서 얻은 시간 대비 생존 가능한 세포 부피를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 기술은 이형 의학 및 세포 요법이 적용되는 모든 질병 또는 상태로 확장 될 수 있습니다.이 방법은 장기 세포 배양이 장려 될 수있는 약물 검사와 같은 영역에서 세포 게놈 안정성 검사에도 적용될 수 있습니다. 살아있는 세포를 조작 할 때마다 침착하고 자신감을 가지십시오. 패혈증에 극도의 주의를 기울이고 역경을 관찰하고 올바른 결정을 내리기 위해 과학자의 눈으로 끊임없이 경계하십시오.가방의 무게를 측정하고 디지털 비접촉 적외선 임상 온도계로 온도를 측정하는 것으로 시작하십시오. 층류 챔버 내부에 5 분 동안 백을 두어 기름기 층을 침전시키고 세포가 들어있는 조직을 분리합니다. 칼슘이 든 DPBS 100ml를 이송 백에 넣고 손으로 섞습니다.5 분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 백 어댑터에 부착 된 60 밀리리터 주사기를 사용하여 침전되는 대부분의 기본 액체를 버립니다. 이 과정을 두 번 반복하십시오.소화 용액 100 밀리리터를 백에 넣고 천천히 저어 주면서 섭씨 37도에서 30 분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 가방의 모든 내용물을 4 개의 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 섭씨 22도에서 10 분 동안 400G에서 원심 분리합니다. 상청액을 버리고 20% 태아 소 혈청이 보충된 DMEM 저혈당 5밀리리터를 세포 펠릿에 추가합니다.증류수에 0.05 % 10 마이크로 리터의 트리판 블루의 신선한 용액을 10 마이크로 리터의 세포 현탁액과 5 분 동안 혼합합니다. 20X 배율의 도립 광학 현미경을 사용하고 Neubauer 세포 계수 챔버에서 생존 가능한 세포를 계수합니다. 세포 펠릿을 밀리리터당 100만 세포 농도의 냉동 보호 배지에 현탁합니다.그런 다음이 혼합물 1 밀리리터를 냉동 바이알에 넣으십시오. 분당 섭씨 1 도의 냉각 속도로 냉동 용기를 사용하고 섭씨 80도에서 1 년 동안 보관하십시오. 1 년 후 액체 질소 증기상에 담근 표준 카세트 상자에 보관하십시오.9 명의 환자로부터의 절차의 다른 단계의 데이터가이 표에 제시되어있다. 초기 세포 수율에 따라, 각 샘플에 대한 세포의 가변 부피가 결정되었다. 세포 수율이 높은 샘플 1 밀리리터, 중간 세포 수율을 가진 샘플의 경우 1.1 밀리리터, 세포 수율이 낮은 샘플 당 2 밀리리터.통과 전의 세포 수율은 트립신화 전에 동일한 합류가 관찰된 경우에도 광범위하게 다양했습니다. 따라서 여기서 세포는 층으로 성장했을 수 있습니다. 대표 이미지는 광학 현미경에서 분리 후 첫 번째 통로에서 플라스틱 부착 중간엽 ADSC를 보여줍니다.세포는 플라스틱 및 섬유 아세포와 같은 형태에 대한 접착력을 보여줍니다. 트리판 블루 분석에서 Neubauer 챔버에서 계수된 생존 세포가 여기에 표시됩니다. 6 명의 환자로부터의 유세포 분석 데이터가이 표에 제시되어있다.이들 CD45 음성 세포로부터, 줄기 세포 마커의 상이한 조합을 갖는 ADSC의 백분율이 결정되었다. 대표적인 이미지는 8개월간의 냉동 보존 후 사례 9의 SVF에서 줄기 세포 관련 마커에 대해 양성인 세포의 하위 집단을 보여줍니다. 여기서, R1은 순방향 산란 대 측면 산점도에서 분석된 전체 세포 영역이다.R2는 CD45 음성 영역이다. CD73, CD90 및 CD105 인구는 이 지역에서 양성입니다. 연골 세포, 골 세포 및 지방 세포에서의 ADSC 분화가 여기에 표시됩니다.이 절차를 시도하는 동안 천천히, 가급적이면 손으로 저어주고 섭씨 37도에서 30분 동안 방치하여 유착과 물집을 관찰하는 것을 잊지 마십시오. 작업실 온도를 섭씨 25도 정도로 유지하고 훨씬 더 큰 온도에서 열 충격을 피하십시오. 여기에 표시된 기술은 만능 중간엽 세포를 다른 조직에서 성공적으로 분리하는 데 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

사후 조직에서 Cardiomyocyte 핵의 분리

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

연구

의학

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Surgical Placement of Catheters for Long-term Cardiovascular Exercise Testing in Swine

돼지의 장기 심장 혈관 운동 테스트를위한 카테터의 외과 배치

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early ...

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비 투 열 방법을 통해 복 부 피하 지방 조직 생 검에 대 한 기술

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Stromal Vascular Fraction-enriched Fat Grafting for the Treatment of Symptomatic End-neuromata

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Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

쥐 모델에 부분 Colectomy 후 누설을 줄이기 위해 지방 조직 유래 줄기 세포의 이식

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Cytometry 사용 하 여 인간 지방 조직에서 면역 세포의 특성

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

지방 조직 유래 Stromal 혈관 분수 잠재적인 연골 재생을 위한 생산의 임상 프로토콜

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

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인간 지방분지 유래 중간엽 줄기 세포의 분리 및 확장을 위한 효소 없는 방법

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

RNA 분석 및 대식세포 표현형에 적합한 인간 내장 지방 조직에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획 분리

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...