Name: technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation
Uploaded: 2021-12-30T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation at JoVE.com

Vi takker pasientene som meldte seg frivillig til å delta og det medisinske og pleiepersonalet på sykehuset São Paulo. Denne studien ble støttet av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasil.

Denne studien er godkjent av UNIFESPs etiske komité (protokollnummer: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), utført etter skriftlig informert samtykke fra pasientene i henhold til Helsinkideklarasjonen (2004). Utvalget av denne studien består av ni kvinnelige pasienter i alderen 33-50 år (gjennomsnittsalder 41,5) og gjennomsnittlig initial kroppsmasseindeks (BMI) på 24,54 (mellom 22,32-26,77) (tabell 1) som gjennomgikk estetisk bukplastikk på grunn av overskudd av hud etter graviditeter, ved Divisj...

Isolasjon gir Det er godt etablert at kryopreserveringsprosessen, som ofte kreves i cellulær terapi, resulterer i betydelig celletap, noen ganger større enn 50% 29,30,35. Dermed er en teknisk forbedring for å oppnå høyt innledende mobilutbytte isolert sett grunnleggende. Samlemetoden for lipoaspirat og isolasjonsmetoden til cellene må fokusere på å bevare et større antall celler, opprettholde høy le...

Humane mesenkymale stamceller er fordelaktige i både grunnleggende og anvendt forskning. Bruken av denne voksne celletypen overgår etiske problemer - sammenlignet med bruk av embryonale eller andre celler - som er et av de mest lovende studieområdene innen autolog vevregenereringsteknikk og celleterapi1, for eksempel det neoplastiske området, behandling av degenerative sykdommer og terapeutiske anvendelser i det rekonstruktive kirurgiområdet 2,3,4, 5. Det har tidligere blitt rapportert at det er en rikelig kilde til mesenkymale multipotente og pluripotente stamceller i stromal vaskulær cellefraksjon av fettvev 6,7. Disse ADSC anses som gode kandidater for bruk i celleterapi og transplantasjon / infusjon siden et betydelig antall celler med sterk kapasitet for ekspansjon ex vivo lett kan oppnås med høyt utbytte fra en minimal invasiv prosedyre 5,8.
Det ble også vist at fettvev har større kapasitet til å gi mesenkymale stamceller enn to andre kilder (benmarg og navlestrengsvev)9. Foruten å være dårlig immunogen og ha høy evne til å integrere seg i vertsvevet og samhandle med det omkringliggende vevet4,10, har ADSC en multipotent kapasitet til differensiering i cellelinjer, med rapporter om kondrogen, osteogen og myogen differensiering under passende kulturforhold11,12,13, og inn i celler, som bukspyttkjertel, hepatocytter, og nevrogene celler14,15,16.
Det vitenskapelige samfunnet er enig i at de mesenkymale stamcellenes immunmodulerende effekt er en mer relevant virkningsmekanisme for celleterapi 17,18,19 enn deres differensieringsegenskap. En av de viktigste fordelene ved ADSC-bruken er muligheten for autolog infusjon eller podning, og blir en alternativ behandling for flere sykdommer. For regenerativ medisin har ADSC allerede blitt brukt i tilfeller av leverskade, rekonstruksjon av hjertemuskel, regenerering av nervesvev, forbedring av skjelettmuskulaturfunksjon, beinregenerering, kreftbehandling og diabetesbehandling20,21.
Til dags dato er det 263 registrerte kliniske studier for evaluering av ADSCs potensial, oppført på nettstedet til USAs National Institutes of Health22. Det er etablert ulike protokoller for høsting av fettvev, men det er ingen konsensus i litteraturen om en standardisert metode for å isolere ADSC for klinisk bruk23,24. Lipoaspiratbehandlingsmetoder under og etter operasjonen kan direkte påvirke cellens levedyktighet, det endelige mobilutbyttet25 og kvaliteten på ADSC-populasjonen20. Når det gjelder kirurgisk forbehandling, er det ikke godt etablert hvilken kirurgisk forbehandlingsteknikk som gir et mer signifikant antall levedyktige celler etter isolering, eller om bedøvelsesløsningen injisert i fettvev påvirker celleutbyttet og dets funksjoner26. På samme måte kan forskjellen mellom teknikker for å oppnå fettceller føre til så mye som en 70% reduksjon i antall levedyktige ADSC20. Ifølge litteraturen bør mekaniske behandlinger for å oppnå cellepopulasjoner med høy levedyktighet - inkludert ultralyd - unngås, for de kan bryte ned fettvevet20. Den manuelle fettaspirasjonsmetoden med sprøyter er imidlertid mindre skadelig, noe som forårsaker mindre celledestruksjon, med tumescent fettsuging som gir et betydelig antall celler med best kvalitet26.
Denne teknikken bruker en saltoppløsning med lidokain og epinefrin som injiseres i fettsugingsområdet. For hvert 3 ml volum oppløsning som injiseres, aspireres 1 ml. I denne studien ble den våte fettsugingsteknikken utført, hvor for hver 1 ml adrenalin og saltoppløsning injisert, aspireres 0,2 ml fettvev. Bruken av fordøyelsesenzymer, spesielt kollagenase, er vanlig for prosessen med å isolere ADSC.
Etter det første isolasjonstrinnet i laboratoriet kalles den endelige pelleten stromal vaskulær fraksjon (SVF). Den inneholder forskjellige celletyper27, inkludert endotelformede forløperceller, endotelceller, makrofager, glatte muskelceller, lymfocytter, pericytter, pre-adipocytter og ADSC, som er i stand til adhesjon. Når den endelige isoleringen er avsluttet fra in vitro-kulturer , elimineres celler som ikke festet seg til plasten i middels utveksling. Etter åtte uker med ekspansjon, middels endringer og passasjer, representerer ADSC-er det meste av cellepopulasjonen i kolber20. En av de viktigste fordelene ved å bruke isolerte fettavledede stamceller for en mulig fremtidig terapi er muligheten for kryopreservering. Det ble vist at kryopreservert lipoaspirat er en potensiell kilde til SVF-celler selv etter 6 ukers frysing28, med biologisk aktivitet selv etter 2 år med kryopreservering29, og full evne til å vokse og differensiere i kultur30. Under tiningsprosessen går imidlertid en betydelig prosentandel av cellene vanligvis tapt31. Derfor må lipoaspiratfjerningsprosessen og følgende metoder for celleisolasjon sikre det høyeste celleutbyttet.
Denne studien beskriver en raskere metodikk for innsamling og isolering av ADSC, som demonstrerer høyt cellulært utbytte og levedyktighet for bedre effektivitet av cellulære terapier. Videre ble effekten av denne forbedrede teknikken etter langvarig SVF-kryopreservering evaluert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL cryovials</td>
			<td>Nunc Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>340711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL polyvinyl chloride transfer bag</td>
			<td>JP FARMA</td>
			<td>80146150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adrenaline (1 mg/mL)</td>
			<td>Hipolabor</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,01,647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride 10%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine gluconate 4%</td>
			<td>VIC PHARMA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,00,496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS100</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live and Dead Cell Assay</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>01-3333-41 | 01-3333-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD105</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD11B</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD19</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD34</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>747822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD45</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD73</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD90</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>553011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: HLA-DR</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>340827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile connector with one spike with needle injection site</td>
			<td>Origen Biomedical Connector, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Code mark: IBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation

Humane mesenkymale stamceller avledet fra fettvev har blitt stadig mer attraktive ettersom de viser passende egenskaper og er en tilgjengelig kilde for regenerative kliniske anvendelser. Ulike protokoller har blitt brukt for å oppnå fettavledede stamceller. Denne artikkelen beskriver ulike trinn i en forbedret tidsbesparende protokoll for å oppnå en mer betydelig mengde ADSC, som viser hvordan du kryopreserverer og tiner ADSC for å oppnå levedyktige celler for kulturutvidelse. Ett hundre milliliter lipoaspirat ble samlet, ved hjelp av en 26 cm tre-hulls og 3 mm kaliber sprøyte fettsuging, fra bukområdet på ni pasienter som senere gjennomgikk elektiv bukplastikk. Stamcelleisolasjonen ble utført med en serie vasker med Dulbeccos fosfatbufrede saltoppløsning (DPBS) supplert med kalsium og bruk av kollagenase. Stromal vaskulær fraksjon (SVF) celler ble kryopreservert, og deres levedyktighet ble kontrollert ved immunfenotyping. SVF-celleutbyttet var 15,7 x 105 celler/ml, fra 6,1-26,2 celler/ml. Assosierte SVF-celler nådde sammenløp etter gjennomsnittlig 7,5 (±4,5) dager, med et gjennomsnittlig mobilutbytte på 12,3 (± 5,7) x 105 celler / ml. Levedyktigheten til tint SVF etter 8 måneder, 1 år og 2 år varierte mellom 23,06% -72,34% med et gjennomsnitt på 47,7% (±24,64) med den laveste levedyktigheten korrelert med tilfeller av toårig frysing. Bruken av DPBS-løsning supplert med kalsium- og posehviletider for fettutfelling med kortere tid med kollagenasefordøyelse resulterte i økt stamcelle endelig cellulært utbytte. Den detaljerte prosedyren for å oppnå høye utbytter av levedyktige stamceller var mer effektiv med hensyn til tid og cellulært utbytte enn teknikkene fra tidligere studier. Selv etter en lang periode med kryopreservering ble levedyktige ADSC-celler funnet i SVF.

Karakteriseringen av de ni undersøkte individene, inkludert alder, vekt, høyde og BMI, er vist i tabell 1.
I henhold til det cellulære utbyttet som opprinnelig ble presentert, ble cellevolumet inokulert i kultur beregnet til å være så nært som mulig til kapasiteten til 75 cm2 kulturkolben. Prøvevolumet som er sådd i hvert enkelt tilfelle er beskrevet i tabell 2. Deretter, i henhold til det opprinnelige cellulære utbyttet, ble et variabelt ...

Watch this Scientific Journal Video about Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation at JoVE.com

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Denne protokollen beskriver en forbedret metodikk for ADSC-isolasjon som resulterer i et enormt cellulært utbytte med tidsøkning sammenlignet med litteraturen. Denne studien gir også en enkel metode for å oppnå et relativt stort antall levedyktige celler etter langvarig kryopreservering.

Teknikk for å oppnå mesenkymal stamcelle fra fettvev og stromal vaskulær fraksjonskarakterisering ved langvarig kryopreservering

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Her har vi demonstrert protokollen for å skaffe og bevare de gode og levedyktige cellene for bruk av terapeutiske trinn, som infusjon av pluripotente mesenkymale celler. Den største fordelen med dette, at ved hjelp av denne teknikken kan vi oppnå det levedyktige cellevolumet versus tiden som er oppnådd i isolasjonstrinnet av cellene fra det oppsamlede vevet. Denne teknikken kan utvides mot alle sykdommer eller tilstander der heterogen medisin og celleterapi brukes.Denne metoden kan også brukes til cytogenomisk stabilitetstesting på områder som narkotikatesting, hvor langsiktige cellekulturer kan oppmuntres. Når du manipulerer levende celler, vær rolig og selvsikker. Vær ekstremt forsiktig med sepsis og vær konstant våken med en forskers øyne for å observere motgang og ta gode beslutninger.Begynn med å veie posen og måle temperaturen med et digitalt berøringsfritt infrarødt klinisk termometer. La posen stå i fem minutter inne i det laminære strømningskammeret for å utfelle de fetere lagene og skille vevet som inneholder cellene. Injiser 100 ml DPBS med kalsium i overføringsposen og bland den med hendene.La det stå i fem minutter. Bruk deretter en 60 milliliter sprøyte festet til poseadapteren for å kaste bort det meste av basalvæsken som faller ut. Gjenta denne prosessen to ganger.Tilsett 100 ml av fordøyelsesløsningen i posen, og la den stå ved 37 grader Celsius i 30 minutter under langsom omrøring. Overfør deretter alt posens innhold til fire 50 milliliter koniske rør og sentrifuger dem ved 400G i 10 minutter ved 22 grader Celsius. Kast supernatanten og tilsett 5 milliliter DMEM lav glukose supplert med 20% føtalt bovint serum til cellepelleten.Bland en frisk løsning av 10 mikroliter trypanblå ved 0,05% i destillert vann med 10 mikroliter cellulær suspensjon i fem minutter. Bruk et omvendt lysmikroskop ved 20X forstørrelse og telle de levedyktige cellene i et Neubauer-celletellingskammer. Suspendere cellepelleten i et kryobeskyttende medium ved en konsentrasjon på 1 million celler per milliliter.Legg deretter 1 milliliter av denne blandingen i kryoflasker. Bruk en frysebeholder med en kjølehastighet på 1 grad Celsius per minutt og oppbevar ved 80 grader Celsius i ett år. Etter et år, oppbevar den i standard kassettbokser nedsenket i flytende nitrogendampfase.Data fra ulike trinn i prosedyren fra de ni pasientene er presentert i denne tabellen. I henhold til det opprinnelige cellulære utbyttet ble et variabelt volum av celler for hver prøve bestemt. 1 milliliter prøver med høyere cellulært utbytte, 1,1 milliliter for prøver med mellomliggende cellulært utbytte og 2 milliliter per prøver med lavere cellulært utbytte.Celleutbyttet før passering varierte bredt selv når samme sammenløp før trypsinisering ble observert. Derfor kan cellene her ha vokst i lag. Det representative bildet viser plastholdige mesenkymale ADSC-er ved første passasje etter isolering ved lysmikroskopi.Cellene viser vedheft til plast- og fibroblastlignende morfologi. De levedyktige cellene som telles i Neubauer-kammeret i trypanblå analyse er vist her. Flowcytometridata fra seks pasienter er presentert i denne tabellen.Fra disse CD45-negative cellene ble prosentandelen av ADSC-er med forskjellige kombinasjoner av stamcellemarkører bestemt. De representative bildene viser subpopulasjonen av celler som er positive for stamcelleassosierte markører i SVF i tilfelle ni etter åtte måneders kryokonservering. Her er R1 den totale cellulære regionen analysert i fremover scatter versus side scatter plot.Og R2 er CD45-negativ region. CD73-, CD90- og CD105-populasjoner er positive i denne regionen. ADSC-differensiering i kondrocytter, osteocytter og adipocytter er vist her.Mens du prøver denne prosedyren, husk å røre sakte, helst med hendene, mens du forlater ved 37 Celsius grader i 30 minutter for å observere adhesjonene og blærene. Hold arbeidsromtemperaturen rundt 25 grader Celsius, og unngå termisk sjokk ved mye større temperaturer. Teknikken som vi har vist her, kan brukes til å isolere de pluripotente mesenkymale cellene fra andre vev.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolering av Cardiomyocyte kjerner fra Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolasjon, karakterisering og Comparative Differensiering av Human tannpulpa stamceller hentet fra permanente tenner ved hjelp av to ulike metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Surgical Placement of Catheters for Long-term Cardiovascular Exercise Testing in Swine

Kirurgisk Plassering av katetre for langsiktig kardiovaskulær trening Testing i Swine

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

En teknikk for Subcutaneous Abdominal fettvev biopsi via en ikke-diathermy-metode

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Stromal Vascular Fraction-enriched Fat Grafting for the Treatment of Symptomatic End-neuromata

Stromal vaskulær brøk-beriket fett pode for behandling av symptomatisk slutten-neuromata

The purpose of this study was to methodically illustrate and highlight the crucial steps of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Transplantasjon av fettvev-avledet stilk cellen ark å redusere lekkasje etter delvis Colectomy i en rotte modell

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Karakteristikk av immunceller i menneskelig fettvev ved hjelp av flowcytometri

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Klinisk protokollen produsere fettvev-avledet pancreatic for potensielle brusk gjenfødelse

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Et enzym-fri metode for isolering og utvidelse av Human fett-avledet Mesenchymal stamceller

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Isolering av levedyktige adipocytter og stromalvaskulær fraksjon fra humant visceralt fettvev egnet for RNA-analyse og makrofagfenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...