Name: technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation
Uploaded: 2021-12-30T16:00:00
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Agradecemos aos pacientes que se ofereceram para participar e à equipe médica e de enfermagem do Hospital São Paulo. Este estudo foi apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasil.

O presente estudo é aprovado pelo Comitê de Ética da UNIFESP (número de protocolo: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), realizado após a obtenção do termo de consentimento livre e esclarecido dos pacientes de acordo com a Declaração de Helsinque (2004). A amostra do presente estudo é composta por nove pacientes do sexo feminino, com idades entre 33 e 50 anos (média de idade de 41,5) e índice de massa corporal (IMC) inicial médio de 24,54 (variando entre 22,32-26,77) (Tabela 1) que foram su...

Rendimento de isolamento Está bem estabelecido que o processo de criopreservação, frequentemente necessário na terapia celular, resulta em perda celular significativa, às vezes superior a 50%29,30,35. Assim, um aprimoramento técnico para a obtenção de alto rendimento celular inicial isoladamente é fundamental. O método de coleta de lipoaspirado e o método de isolamento das células devem se concent...

As células-tronco mesenquimais humanas são vantajosas tanto na pesquisa básica quanto na aplicada. O uso desse tipo de célula adulta supera questões éticas - em comparação com o uso de células embrionárias ou outras - sendo uma das áreas de estudo mais promissoras em engenharia de regeneração de tecidos autólogos e terapia celular1, como a área neoplásica, o tratamento de doenças degenerativas e aplicações terapêuticas na área de cirurgia reconstrutiva 2,3,4, 5. Já foi relatado anteriormente que existe uma fonte abundante de células-tronco mesenquimais multipotentes e pluripotentes na fração celular vascular estromal do tecido adiposo 6,7. Esses ADSC são considerados grandes candidatos para uso em terapia celular e transplante/infusão, uma vez que um número considerável de células com forte capacidade de expansão ex vivo pode ser facilmente obtido com alto rendimento a partir de um procedimento minimamente invasivo 5,8.
Também foi demonstrado que o tecido adiposo apresenta maior capacidade de fornecer células-tronco mesenquimais do que duas outras fontes (medula óssea e tecido do cordão umbilical)9. Além de ser pouco imunogênica e de ter alta capacidade de integração no tecido hospedeiro e de interação com os tecidos circundantes4,10, a ADSC possui uma capacidade multipotente de diferenciação em linhagens celulares, com relatos de diferenciação condrogênica, osteogênica e miogênica em condições de cultura adequadas 11,12,13, e em células, como pancreáticas, hepatócitos, e células neurogênicas14,15,16.
A comunidade científica concorda que o efeito imunomodulador das células-tronco mesenquimais é um mecanismo de ação mais relevante para a terapia celular17,18,19 do que sua propriedade de diferenciação. Um dos méritos mais significativos do uso do ADSC é a possibilidade de infusão ou enxerto autólogo, tornando-se uma alternativa de tratamento para diversas doenças. Para a medicina regenerativa, o ADSC já tem sido utilizado em casos de lesão hepática, reconstrução do músculo cardíaco, regeneração do tecido nervoso, melhora da função muscular esquelética, regeneração óssea, terapia do câncer e tratamento do diabetes20,21.
Até o momento, existem 263 ensaios clínicos registrados para a avaliação do potencial do ADSC, listados no site dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos22. Diferentes protocolos para a colheita de tecido adiposo têm sido estabelecidos, mas não há consenso na literatura sobre um método padronizado para isolar a ADSC para uso clínico23,24. Os métodos de processamento de lipoaspirados durante e após a cirurgia podem afetar diretamente a viabilidade celular, o rendimento celular final25 e a qualidade da população de ADSC20. Em relação ao pré-tratamento cirúrgico, não está bem estabelecido qual técnica cirúrgica de pré-tratamento produz um número mais significativo de células viáveis após o isolamento ou se a solução anestésica injetada no tecido adiposo afeta o rendimento celular e suas funções26. Da mesma forma, a diferença entre as técnicas de obtenção de células adiposas pode levar a uma diminuição de até 70% no número de ADSC viáveis20. De acordo com a literatura, tratamentos mecânicos para obtenção de populações celulares com alta viabilidade - incluindo ultrassonografia - devem ser evitados, pois podem decompor o tecido adiposo20. No entanto, o método de aspiração manual de gordura com seringas é menos prejudicial, causando menor destruição celular, com a lipoaspiração tumescente produzindo um número significativo de células com a melhor qualidade26.
Esta técnica utiliza uma solução salina com lidocaína e epinefrina que é injetada na área de lipoaspiração. Para cada volume de 3 ml de solução injetada, 1 ml é aspirado. Neste estudo, foi realizada a técnica de lipoaspiração úmida, na qual para cada 1 mL de adrenalina e solução salina injetados, 0,2 mL de tecido adiposo é aspirado. O uso de enzimas digestivas, especialmente a colagenase, é comum para o processo de isolamento do ADSC.
Após a primeira etapa de isolamento em laboratório, o pellet final é chamado de fração vascular estromal (SVF). Contém diferentes tipos de células27, incluindo células precursoras endoteliais, células endoteliais, macrófagos, células musculares lisas, linfócitos, pericitos, pré-adipócitos e ADSCs, que são capazes de aderência. Uma vez concluído o isolamento final a partir de culturas in vitro , as células que não aderiram ao plástico são eliminadas em trocas médias. Após oito semanas de expansão, mudanças de meio e passagens, os ADSCs representam a maior parte da população celular nos frascos20. Uma das vantagens mais significativas do uso de células-tronco isoladas derivadas de tecido adiposo para uma possível terapia futura é a possibilidade de criopreservação. Demonstrou-se que o lipoaspirado criopreservado é uma fonte potencial de células SVF mesmo após 6 semanas de congelamento28, com atividade biológica mesmo após 2 anos de criopreservação29, e plena capacidade de crescimento e diferenciação em cultura30. No entanto, durante o processo de descongelamento, uma porcentagem considerável de células geralmente é perdida31. Portanto, o processo de remoção de lipoaspirados e os seguintes métodos de isolamento celular devem garantir o maior rendimento celular.
Este estudo descreve uma metodologia mais rápida para coleta e isolamento de ADSC, demonstrando alto rendimento celular e viabilidade para melhor eficiência da terapêutica celular. Além disso, avaliou-se o efeito dessa técnica aprimorada após a criopreservação da SVF em longo prazo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL cryovials</td>
			<td>Nunc Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>340711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL polyvinyl chloride transfer bag</td>
			<td>JP FARMA</td>
			<td>80146150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adrenaline (1 mg/mL)</td>
			<td>Hipolabor</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,01,647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride 10%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine gluconate 4%</td>
			<td>VIC PHARMA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,00,496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS100</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live and Dead Cell Assay</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>01-3333-41 | 01-3333-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD105</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD11B</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD19</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD34</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>747822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD45</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD73</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD90</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>553011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: HLA-DR</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>340827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile connector with one spike with needle injection site</td>
			<td>Origen Biomedical Connector, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Code mark: IBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation

As células-tronco mesenquimais humanas derivadas do tecido adiposo tornaram-se cada vez mais atraentes, pois apresentam características apropriadas e são uma fonte acessível para aplicações clínicas regenerativas. Diferentes protocolos têm sido utilizados para a obtenção de células-tronco derivadas de tecido adiposo. Este artigo descreve diferentes etapas de um protocolo de economia de tempo aprimorado para obter uma quantidade mais significativa de ADSC, mostrando como criopreservar e descongelar o ADSC para obter células viáveis para expansão da cultura. Cem mililitros de lipoaspirado foram coletados, utilizando-se lipoaspiração de seringa de 26 cm de três orifícios e calibre de 3 mm, da região abdominal de nove pacientes que posteriormente foram submetidos à abdominoplastia eletiva. O isolamento das células-tronco foi realizado com uma série de lavagens com solução de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco suplementada com cálcio e o uso de colagenase. As células da Fração Vascular Estromal (SVF) foram criopreservadas, e sua viabilidade foi verificada por imunofenotipagem. O rendimento celular de SVF foi de 15,7 x 105 células/mL, variando entre 6,1-26,2 células/mL. As células SVF aderentes atingiram confluência após uma média de 7,5 (±4,5) dias, com um rendimento celular médio de 12,3 (± 5,7) x 105 células/mL. A viabilidade da FSV descongelada após 8 meses, 1 ano e 2 anos variou entre 23,06%-72,34%, com média de 47,7% (±24,64) com a menor viabilidade correlacionando-se com os casos de congelamento em dois anos. O uso de solução de DPBS suplementada com cálcio e tempos de repouso da bolsa para precipitação de gordura com menor tempo de digestão da colagenase resultou em um aumento do rendimento celular final de células-tronco. O procedimento detalhado para obtenção de altas produtividades de células-tronco viáveis foi mais eficiente em relação ao tempo e rendimento celular do que as técnicas de estudos anteriores. Mesmo após um longo período de criopreservação, células ADSC viáveis foram encontradas na SVF.

A caracterização dos nove indivíduos estudados, incluindo idade, peso, altura e IMC, está apresentada na Tabela 1.
De acordo com o rendimento celular inicialmente apresentado, o volume celular inoculado em cultura foi calculado para ser o mais próximo possível da capacidade do frasco de cultura de 75 cm2. O volume amostral semeado em cada caso está descrito na Tabela 2. Em seguida, de acordo com o rendimento celular inicial, foi determinado u...

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Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

O presente protocolo descreve uma metodologia aprimorada para o isolamento de ADSC, resultando em um tremendo rendimento celular com ganho de tempo em comparação com a literatura. Este estudo também fornece um método simples para a obtenção de um número relativamente grande de células viáveis após a crioppreservação a longo prazo.

Técnica para obtenção de células-tronco mesenquimais a partir da caracterização do tecido adiposo e da fração vascular estromal em criopreservação a longo prazo

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Aqui, demonstramos o protocolo de obtenção e preservação das células boas e viáveis para usos de etapas terapêuticas, como a infusão de células mesenquimais pluripotentes. A principal vantagem disso, é que usando esta técnica, podemos obter o volume celular viável versus o tempo ganho na etapa de isolamento das células do tecido coletado. Esta técnica pode ser estendida para todas as doenças ou condições em que a medicina heterogênica e a terapia celular são aplicadas.Este método também pode ser aplicado a testes de estabilidade citogenômica em áreas como testes de drogas, onde culturas de células de longo prazo podem ser encorajadas. Sempre que manipular as células vivas, seja calmo e confiante. Tome extremo cuidado com a sepse e esteja constantemente alerta com os olhos de um cientista para observar qualquer adversidade e tomar boas decisões.Comece pesando o saco e medindo a temperatura com um termômetro clínico infravermelho digital sem contato. Deixe o saco por cinco minutos dentro da câmara de fluxo laminar para precipitar as camadas mais gordurosas e separar o tecido que contém as células. Injete 100 mililitros de DPBS com cálcio no saco de transferência e misture-o com as mãos.Deixe repousar por cinco minutos. Em seguida, use uma seringa de 60 mililitros anexada ao adaptador do saco para descartar a maior parte do líquido basal que precipita. Repita esse processo duas vezes.Adicione 100 mililitros da solução de digestão ao saco e deixe-o a 37 graus Celsius por 30 minutos sob agitação lenta. Em seguida, transfira todo o conteúdo do saco para quatro tubos cônicos de 50 mililitros e centrifuja-os a 400G por 10 minutos a 22 graus Celsius. Descarte o sobrenadante e adicione 5 mililitros de DMEM de baixa glicose suplementada com 20% de soro bovino fetal ao pellet celular.Misture uma solução fresca de 10 microlitros de azul de tripano a 0,05% em água destilada com 10 microlitros de suspensão celular durante cinco minutos. Use um microscópio de luz invertida com ampliação de 20X e conte as células viáveis em uma câmara de contagem de células de Neubauer. Suspenda o pellet celular em um meio crioprotetor a uma concentração de 1 milhão de células por mililitro.Em seguida, coloque 1 mililitro desta mistura em frascos criogênicos. Use um recipiente de congelamento com uma taxa de resfriamento de 1 grau Celsius por minuto e armazene a 80 graus Celsius por um ano. Após um ano, armazene-o em caixas de padrão imersas na fase de vapor de nitrogênio líquido.Os dados das diferentes etapas do procedimento dos nove pacientes são apresentados nesta tabela. De acordo com o rendimento celular inicial, determinou-se um volume variável de células para cada amostra. 1 mililitro de amostras com maior rendimento celular, 1,1 mililitros para amostras com rendimento celular intermediário e 2 mililitros por amostra com menor rendimento celular.O rendimento celular antes da passagem variou amplamente, mesmo quando a mesma confluência antes da tripsinização foi observada. Portanto, aqui as células podem ter crescido em camadas. A imagem representativa mostra os ADSCs mesenquimais aderentes ao plástico na primeira passagem após o isolamento à microscopia de luz.As células apresentam adesão à morfologia plástica e fibroblástica. As células viáveis contadas na câmara de Neubauer no ensaio azul de tripano são mostradas aqui. Os dados da citometria de fluxo de seis pacientes são apresentados nesta tabela.A partir dessas células CD45 negativas, determinou-se a porcentagem de ADSCs com diferentes combinações de marcadores de células-tronco. As imagens representativas mostram a subpopulação de células positivas para marcadores associados a células-tronco na SVF do caso nove após oito meses de criopreservação. Aqui, R1 é a região celular total analisada no gráfico de dispersão para frente versus dispersão lateral.E R2 é a região negativa CD45. As populações de CD73, CD90 e CD105 são positivas nesta região. A diferenciação de ADSC em condrócitos, osteócitos e adipócitos é mostrada aqui.Ao tentar este procedimento, lembre-se de mexer lentamente, de preferência com as mãos, deixando a 37 graus Celsius por 30 minutos para observar as aderências e bolhas. Mantenha a temperatura da sala de trabalho em torno de 25 graus Celsius e evite qualquer choque térmico a temperaturas muito maiores. A técnica que mostramos aqui pode ser usada para isolar com sucesso as células mesenquimais pluripotentes de outros tecidos.

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