Name: technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation
Uploaded: 2021-12-30T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation at JoVE.com

Мы благодарим пациентов, которые вызвались принять участие, а также медицинский и сестринский персонал больницы Сан-Паулу. Это исследование было поддержано Фондом организации ампаро в Пескизе Сан-Паулу (ФАПЕСП) и Национальным советом по вопросам образования и развития (CNPq), Бразилия.

Настоящее исследование одобрено Комитетом по этике UNIFESP (протокольный номер: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), выполнено после получения письменного информированного согласия от пациентов в соответствии с Хельсинкской декларацией (2004). Выборка настоящего исследования состоит из девяти пациенток...

Выход изоляции Хорошо известно, что процесс криоконсервации, часто необходимый в клеточной терапии, приводит к значительной потере клеток, иногда превышающей 50%29,30,35. Таким образом, техническое усовершенствование для получе...

Мезенхимальные стволовые клетки человека выгодны как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях. Использование этого типа взрослых клеток преодолевает этические вопросы по сравнению с использованием эмбриональных или других клеток, являясь одним из наиболее перспективных направлений исследований в области инженерии регенерации аутологичных тканей и клеточной терапии1, таких как опухолевая область, лечение дегенеративных заболеваний и терапевтические применения в области реконструктивной хирургии 2,3,4, 5. Ранее сообщалось, что существует обильный источник мезенхимальных мультипотентных и плюрипотентных стволовых клеток в стромальной сосудистой клеточной фракции жировой ткани 6,7. Эти ADSC считаются отличными кандидатами для использования в клеточной терапии и трансплантации / инфузии, поскольку значительное количество клеток с сильной способностью к расширению ex vivo может быть легко получено с высоким выходом из минимально инвазивной процедуры 5,8.
Было также продемонстрировано, что жировая ткань обладает большей способностью обеспечивать мезенхимальные стволовые клетки, чем два других источника (ткань костного мозга и пуповины)9. Помимо того, что ADSC плохо иммуногенен и обладает высокой способностью интегрироваться в ткань хозяина и взаимодействовать с окружающими тканями 4,10, ОН обладает мультипотентной способностью дифференцировки в клеточные линии, с сообщениями о хондрогенной, остеогенной и миогенной дифференцировке в соответствующих условиях культивирования 11,12,13, и в клетки, такие как поджелудочная железа, гепатоциты, и нейрогенные клетки 14,15,16.
Научное сообщество сходится во мнении, что иммуномодулирующее действие мезенхимальных стволовых клеток является более актуальным механизмом действия клеточной терапии 17,18,19, чем их свойство дифференцировки. Одним из наиболее значимых достоинств применения ADSC является возможность аутологичной инфузии или пересадки, становящейся альтернативным лечением нескольких заболеваний. Для регенеративной медицины ADSC уже применялись в случаях повреждения печени, реконструкции сердечной мышцы, регенерации нервной ткани, улучшения функции скелетных мышц, регенерации костей, терапии рака и лечения диабета20,21.
На сегодняшний день зарегистрировано 263 клинических испытания для оценки потенциала ADSC, перечисленных на веб-сайте Национальных институтов здоровья22 США. Были установлены различные протоколы сбора жировой ткани, но в литературе нет единого мнения о стандартизированном методе выделения ADSC для клинического использования23,24. Методы обработки липоаспирата во время и после операции могут непосредственно влиять на жизнеспособность клеток, конечный клеточный выход25 и качество популяции ADSC20. Что касается хирургического предварительного лечения, то не установлено, какой хирургический метод предварительного лечения дает более значительное количество жизнеспособных клеток после выделения или влияет ли раствор анестетика, введенный в жировую ткань, на выход клеток и их функции26. Аналогичным образом, разница между методами получения жировых клеток может привести к 70% уменьшению количества жизнеспособных ADSC20. Согласно литературе, следует избегать механических методов лечения для получения клеточных популяций с высокой жизнеспособностью, включая ультразвук, поскольку они могут разрушить жировуюткань 20. Тем не менее, ручной метод аспирации жира со шприцами менее вреден, вызывая меньшее разрушение клеток, при этом тумесцентная липосакция дает значительное количество клеток с лучшим качеством26.
В этой методике используется солевой раствор с лидокаином и адреналином, который вводится в область липосакции. На каждые 3 мл объема вводимого раствора аспирируется 1 мл. В этом исследовании была выполнена методика влажной липосакции, при которой на каждый 1 мл введенного адреналина и физиологического раствора аспирируется 0,2 мл жировой ткани. Использование пищеварительных ферментов, особенно коллагеназы, является общим для процесса выделения ADSC.
После первого этапа выделения в лаборатории конечная гранула называется стромальной сосудистой фракцией (SVF). Он содержит различные типы клеток27, включая эндотелиальные клетки-предшественники, эндотелиальные клетки, макрофаги, гладкомышечные клетки, лимфоциты, перициты, преадипоциты и ADSC, которые способны к адгезии. Как только окончательное выделение заключено из культур in vitro , клетки, которые не прилипли к пластику, удаляются в средах обмена. После восьми недель расширения, средних изменений и проходов, ADSC представляют большую часть клеточной популяции в колбах20. Одним из наиболее значительных преимуществ использования изолированных стволовых клеток, полученных из жировой ткани, для возможной будущей терапии является возможность криоконсервации. Было продемонстрировано, что криоконсервированный липоаспират является потенциальным источником SVF-клеток даже после 6 недель замораживания28, с биологической активностью даже после 2 лет криоконсервации29 и полной способностью расти и дифференцироваться в культуре30. Однако в процессе оттаивания значительного процента клеток обычно теряется31. Поэтому процесс удаления липоаспирата и следующие методы изоляции клеток должны обеспечивать самый высокий выход клеток.
Это исследование описывает более быструю методологию сбора и изоляции ADSC, демонстрирующую высокий клеточный выход и жизнеспособность для повышения эффективности клеточной терапии. Кроме того, был оценен эффект этого улучшенного метода после длительной криоконсервации SVF.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL cryovials</td>
			<td>Nunc Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>340711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL polyvinyl chloride transfer bag</td>
			<td>JP FARMA</td>
			<td>80146150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adrenaline (1 mg/mL)</td>
			<td>Hipolabor</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,01,647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride 10%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine gluconate 4%</td>
			<td>VIC PHARMA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,00,496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS100</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live and Dead Cell Assay</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>01-3333-41 | 01-3333-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD105</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD11B</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD19</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD34</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>747822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD45</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD73</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD90</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>553011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: HLA-DR</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>340827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile connector with one spike with needle injection site</td>
			<td>Origen Biomedical Connector, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Code mark: IBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation

Мезенхимальные стволовые клетки человека, полученные из жировой ткани, становятся все более привлекательными, поскольку они демонстрируют соответствующие особенности и являются доступным источником для регенеративных клинических применений. Различные протоколы были использованы для получения стволовых клеток, полученных из жировой ткани. В этой статье описываются различные этапы улучшенного протокола экономии времени для получения более значительного количества ADSC, показывая, как криоконсервировать и размораживать ADSC для получения жизнеспособных клеток для расширения культуры. Сто миллилитров липоаспирата были собраны с помощью липосакции шприца калибра 26 см и калибра 3 мм из области живота девяти пациентов, которые впоследствии прошли плановую абдоминопластику. Выделение стволовых клеток проводилось серией промывок раствором фосфатного буферного физиологического раствора (DPBS) Dulbecco, дополненным кальцием, и использованием коллагеназы. Клетки стромальной сосудистой фракции (SVF) были криоконсервированы, и их жизнеспособность была проверена иммунофенотипированием. Клеточный выход SVF составлял 15,7 x 105 клеток/мл, в диапазоне от 6,1 до 26,2 клеток/мл. Адгезивные клетки SVF достигали слияния в среднем через 7,5 (±4,5) дней, со средним клеточным выходом 12,3 (± 5,7) х 105 клеток / мл. Жизнеспособность размороженного SVF через 8 месяцев, 1 год и 2 года колебалась между 23,06%-72,34% в среднем 47,7% (±24,64) с самой низкой жизнеспособностью, коррелирующей со случаями двухлетней заморозки. Использование раствора DPBS, дополненного кальцием и временем отдыха мешков для осаждения жира с более коротким временем переваривания коллагеназы, привело к увеличению конечного клеточного выхода стволовых клеток. Детальная процедура получения высоких урожаев жизнеспособных стволовых клеток была более эффективной с точки зрения времени и клеточного выхода, чем методы из предыдущих исследований. Даже после длительного периода криоконсервации в SVF были обнаружены жизнеспособные клетки ADSC.

Характеристика девяти изученных лиц, включая их возраст, вес, рост и ИМТ, приведена в таблице 1.
В соответствии с первоначально представленным клеточным выходом, объем клеток, привитых в культуре, был рассчитан как максимально приближенный к емкости колбы культу?...

Watch this Scientific Journal Video about Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation at JoVE.com

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Настоящий протокол описывает улучшенную методологию изоляции ADSC, приводящую к огромному клеточному выходу с увеличением времени по сравнению с литературой. Это исследование также предоставляет простой метод получения относительно большого количества жизнеспособных клеток после длительной криоконсервации.

Методика получения мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани и характеристика стромальной сосудистой фракции при длительной криоконсервации

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Здесь мы продемонстрировали протокол получения и сохранения хороших и жизнеспособных клеток для использования терапевтических этапов, таких как инфузия плюрипотентных мезенхимальных клеток. Основным преимуществом этого является то, что с помощью этой методики мы можем получить жизнеспособный клеточный объем по сравнению со временем, полученным на этапе выделения клеток из собранной ткани. Этот метод может быть распространен на все заболевания или состояния, где применяется гетерогенная медицина и клеточная терапия.Этот метод также может быть применен для тестирования цитогеномной стабильности в таких областях, как тестирование на наркотики, где могут поощряться долгосрочные клеточные культуры. Всякий раз, когда вы манипулируете живыми клетками, будьте спокойны и уверены в себе. Будьте предельно осторожны при сепсисе и будьте постоянно бдительны глазами ученого, чтобы наблюдать за любыми невзгодами и принимать правильные решения.Начните с взвешивания сумки и измерения температуры с помощью цифрового бесконтактного инфракрасного клинического термометра. Оставьте мешок на пять минут внутри ламинарной камеры потока, чтобы высадить более жирные слои и отделить ткань, содержащую клетки. Введите 100 миллилитров DPBS с кальцием в переносной мешок и перемешайте его руками.Дайте ему постоять пять минут. Затем используйте 60-миллилитровый шприц, прикрепленный к адаптеру мешка, чтобы выбросить большую часть базальной жидкости, которая выпадает в осадок. Повторите этот процесс два раза.Добавьте в пакет 100 миллилитров раствора для пищеварения и оставьте при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут при медленном перемешивании. Затем переложите все содержимое пакета в четыре конические трубки по 50 миллилитров и центрифугируйте их при 400G в течение 10 минут при 22 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и добавьте 5 миллилитров DMEM с низким содержанием глюкозы, дополненной 20% фетальной бычьей сывороткой в клеточную гранулу.Смешайте свежий раствор 10 микролитров трипан-синего под 0,05% в дистиллированной воде с 10 микролитрами клеточной суспензии в течение пяти минут. Используйте инвертированный световой микроскоп с 20-кратным увеличением и подсчитывайте жизнеспособные клетки в камере подсчета клеток Нойбауэра. Суспендировать клеточную гранулу в криозащитной среде в концентрации 1 млн клеток на миллилитр.Затем поместите 1 миллилитр этой смеси в криопузырьки. Используйте морозильный контейнер со скоростью охлаждения 1 градус Цельсия в минуту и храните при 80 градусах Цельсия в течение одного года. Через год храните его в стандартных кассетных коробках, погруженных в фазу паров жидкого азота.Данные о различных этапах процедуры от девяти пациентов представлены в этой таблице. В соответствии с начальным клеточным выходом определяли переменный объем клеток для каждого образца. 1 миллилитр образцов с более высоким клеточным выходом, 1,1 миллилитра для образцов с промежуточным клеточным выходом и 2 миллилитра на образцы с более низким клеточным выходом.Клеточный выход перед прохождением один широко варьировался даже тогда, когда наблюдалось такое же слияние до трипсинизации. Поэтому здесь клетки, возможно, выросли слоями. На репрезентативном изображении показаны пластически адгезивные мезенхимальные АЦДК при первом прохождении после выделения при световой микроскопии.Клетки демонстрируют адгезию к пластической и фибробластоподобной морфологии. Жизнеспособные клетки, подсчитанные в камере Нойбауэра в трипановом синем анализе, показаны здесь. Данные проточной цитометрии шести пациентов представлены в этой таблице.Из этих CD45 отрицательных клеток определяли процент ADSC с различными комбинациями маркеров стволовых клеток. Репрезентативные изображения показывают субпопуляцию клеток, положительных на маркеры, связанные со стволовыми клетками, в SVF девятого случая после восьми месяцев криоконсервации. Здесь R1 представляет собой общую клеточную область, проанализированную на диаграмме прямого рассеяния против бокового рассеяния.А R2 — это отрицательная область CD45. Популяции CD73, CD90 и CD105 являются положительными в этом регионе. Дифференцировка ADSC в хондроцитах, остеоцитах и адипоцитах показана здесь.Во время этой процедуры не забывайте медленно помешивать, желательно руками, оставляя при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут, чтобы наблюдать спайки и волдыри. Поддерживайте температуру в рабочем помещении около 25 градусов по Цельсию и избегайте теплового удара при гораздо более высоких температурах. Методика, которую мы показали здесь, может быть использована для успешного выделения плюрипотентных мезенхимальных клеток из других тканей.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Выделение ядер кардиомиоцитов с Посмертные тканей

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Выделение, характеристика и сравнительный Дифференциация по правам зубных стволовых клеток, полученных из целлюлозы постоянных зубов с помощью двух различных методов

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Surgical Placement of Catheters for Long-term Cardiovascular Exercise Testing in Swine

Хирургическое Размещение Катетеры для долгосрочного сердечно-сосудистой тестирования физических упражнений у свиней

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

Техника для подкожной жировой ткани брюшной биопсии через метод Non диатермия

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Stromal Vascular Fraction-enriched Fat Grafting for the Treatment of Symptomatic End-neuromata

Стромальные сосудистой фракция обогащенный жира прививки для лечения симптоматических конец neuromata

The purpose of this study was to methodically illustrate and highlight the crucial steps of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Трансплантация стволовых клеток жировой ткани производные листа для уменьшения утечки после частичное колэктомия в мышиной модели

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Характеристика иммунных клеток в жировых тканях человека с помощью проточной цитометрии

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Клинический протокол производства жировой ткани производные стромальные сосудистой дроби для потенциальных регенерации хряща

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Метод, свободный от ферментов для изоляции и расширения человеческих адипосальных стволовых клеток

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Выделение жизнеспособных адипоцитов и стромально-васкулярной фракции из висцеральной жировой ткани человека, пригодных для анализа РНК и фенотипирования макрофагов

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...