Name: technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation
Uploaded: 2021-12-30T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation at JoVE.com

Agradecemos a los pacientes que se ofrecieron como voluntarios para participar y al personal médico y de enfermería del Hospital São Paulo. Este estudio fue apoyado por la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) y el Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasil.

El presente estudio es aprobado por el Comité de Ética de la UNIFESP (número de protocolo: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), realizado después de obtener el consentimiento informado por escrito de los pacientes de acuerdo con la Declaración de Helsinki (2004). La muestra del presente estudio está compuesta por nueve pacientes del sexo femenino, con edades de 33-50 años (edad promedio 41,5) y promedio de índice de masa corporal inicial (IMC) de 24,54 (variando entre 22,32-26,77) (Tabla 1) que...

Rendimiento de aislamiento Está bien establecido que el proceso de criopreservación, frecuentemente requerido en la terapia celular, resulta en una pérdida celular significativa, a veces superior al 50%29,30,35. Por lo tanto, una mejora técnica para obtener un alto rendimiento celular inicial en aislamiento es fundamental. El método de recolección de lipoaspirado y el método de aislamiento de las célu...

Las células madre mesenquimales humanas son ventajosas tanto en la investigación básica como en la aplicada. El uso de este tipo de células adultas supera las cuestiones éticas, en comparación con el uso de células embrionarias u otras, siendo una de las áreas de estudio más prometedoras en ingeniería de regeneración tisular autóloga y terapia celular1, como el área neoplásica, el tratamiento de enfermedades degenerativas y aplicaciones terapéuticas en el área de cirugía reconstructiva 2,3,4, 5. Se ha relatado previamente que existe una fuente abundante de células madre mesenquimales multipotentes y pluripotentes en la fracción de células vasculares estromales del tejido adiposo 6,7. Estos ADSC se consideran excelentes candidatos para su uso en terapia celular y trasplante/infusión, ya que un número considerable de células con una fuerte capacidad de expansión ex vivo se pueden obtener fácilmente con un alto rendimiento de un procedimiento mínimamente invasivo 5,8.
También se demostró que el tejido adiposo presenta una mayor capacidad para proporcionar células madre mesenquimales que otras dos fuentes (médula ósea y tejido del cordón umbilical)9. Además de ser poco inmunogénico y tener una alta capacidad para integrarse en el tejido huésped e interactuar con los tejidos circundantes4,10, el ADSC tiene una capacidad multipotente de diferenciación en líneas celulares, con informes de diferenciación condrogénica, osteogénica y miogénica en condiciones de cultivo apropiadas11,12,13, y en células, como pancreáticas, hepatocitos, y células neurogénicas14,15,16.
La comunidad científica está de acuerdo en que el efecto inmunomodulador de las células madre mesenquimales es un mecanismo de acción más relevante para la terapia celular17,18,19 que su propiedad de diferenciación. Uno de los méritos más significativos del uso de ADSC es la posibilidad de infusión autóloga o injerto, convirtiéndose en un tratamiento alternativo para varias enfermedades. Para la medicina regenerativa, ADSC ya han sido utilizados en casos de daño hepático, reconstrucción del músculo cardíaco, regeneración del tejido nervioso, mejora de la función del músculo esquelético, regeneración ósea, terapia del cáncer y tratamiento de la diabetes20,21.
Hasta la fecha, hay 263 ensayos clínicos registrados para la evaluación del potencial de ADSC, enumerados en el sitio web de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos22. Se han establecido diferentes protocolos para la recolección de tejido adiposo, pero no hay consenso en la literatura sobre un método estandarizado para aislar ADSC para uso clínico23,24. Los métodos de procesamiento de lipoaspirados durante y después de la cirugía pueden afectar directamente la viabilidad celular, el rendimiento celular final25 y la calidad de la población ADSC20. En cuanto al pretratamiento quirúrgico, no está bien establecido qué técnica quirúrgica de pretratamiento produce un número más significativo de células viables después del aislamiento o si la solución anestésica inyectada en el tejido adiposo afecta el rendimiento celular y sus funciones26. Del mismo modo, la diferencia entre las técnicas para obtener células adiposas puede conducir a una disminución de hasta el 70% en el número de ADSC20 viables. De acuerdo con la literatura, los tratamientos mecánicos para obtener poblaciones celulares con alta viabilidad, incluyendo ultrasonidos, deben ser evitados, ya que pueden descomponer el tejido adiposo20. Sin embargo, el método manual de aspiración de grasa con jeringas es menos dañino, causando menos destrucción celular, con liposucción tumescente produciendo un número significativo de células con la mejor calidad26.
Esta técnica utiliza una solución salina con lidocaína y epinefrina que se inyecta en el área de liposucción. Por cada volumen de 3 ml de solución inyectada, se aspira 1 ml. En este estudio, se realizó la técnica de liposucción húmeda, en la que por cada 1 mL de adrenalina y solución salina inyectada, se aspiran 0,2 mL de tejido adiposo. El uso de enzimas digestivas, especialmente colagenasa, es común para el proceso de aislamiento de ADSC.
Después del primer paso de aislamiento en el laboratorio, el pellet final se llama fracción vascular estromal (SVF). Contiene diferentes tipos de células27, incluyendo células precursoras endoteliales, células endoteliales, macrófagos, células musculares lisas, linfocitos, pericitos, preadipocitos y ADSC, que son capaces de adhesión. Una vez concluido el aislamiento final a partir de cultivos in vitro , las células que no se adhirieron al plástico se eliminan en intercambios de medios. Después de ocho semanas de expansión, cambios de medio y pasajes, las ADSC representan la mayor parte de la población celular en los frascos20. Una de las ventajas más significativas del uso de células madre aisladas derivadas de tejido adiposo para una posible terapia futura es la posibilidad de criopreservación. Se demostró que el lipoaspirado criopreservado es una fuente potencial de células SVF incluso después de 6 semanas de congelación28, con actividad biológica incluso después de 2 años de criopreservación29, y plena capacidad para crecer y diferenciarse en cultivo30. Sin embargo, durante el proceso de descongelación, un porcentaje considerable de células generalmente se pierde31. Por lo tanto, el proceso de eliminación de lipoaspirado y los siguientes métodos de aislamiento celular deben garantizar el mayor rendimiento celular.
Este estudio describe una metodología más rápida para recolectar y aislar ADSC, demostrando un alto rendimiento celular y viabilidad para una mejor eficiencia de la terapéutica celular. Además, se evaluó el efecto de esta técnica mejorada después de la criopreservación de SVF a largo plazo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL cryovials</td>
			<td>Nunc Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>340711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL polyvinyl chloride transfer bag</td>
			<td>JP FARMA</td>
			<td>80146150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adrenaline (1 mg/mL)</td>
			<td>Hipolabor</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,01,647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride 10%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine gluconate 4%</td>
			<td>VIC PHARMA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,00,496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS100</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live and Dead Cell Assay</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>01-3333-41 | 01-3333-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD105</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD11B</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD19</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD34</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>747822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD45</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD73</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD90</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>553011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: HLA-DR</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>340827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile connector with one spike with needle injection site</td>
			<td>Origen Biomedical Connector, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Code mark: IBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation

Las células madre mesenquimales humanas derivadas del tejido adiposo se han vuelto cada vez más atractivas, ya que muestran características apropiadas y son una fuente accesible para aplicaciones clínicas regenerativas. Se han utilizado diferentes protocolos para obtener células madre derivadas de tejido adiposo. Este artículo describe diferentes pasos de un protocolo mejorado de ahorro de tiempo para obtener una cantidad más significativa de ADSC, mostrando cómo criopreservar y descongelar ADSC para obtener células viables para la expansión del cultivo. Se recolectaron cien mililitros de lipoaspirado, utilizando una liposucción de jeringa de 26 cm de tres orificios y calibre 3 mm, del área abdominal de nueve pacientes que posteriormente se sometieron a una abdominoplastia electiva. El aislamiento de células madre se llevó a cabo con una serie de lavados con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco suplementada con calcio y el uso de colagenasa. Las células de la fracción vascular estromal (SVF) fueron criopreservadas, y su viabilidad fue comprobada por inmunofenotipado. El rendimiento celular SVF fue de 15,7 x 105 células/ml, variando entre 6,1-26,2 células/ml. Las células SVF adherentes alcanzaron la confluencia después de un promedio de 7,5 (±4,5) días, con un rendimiento celular promedio de 12,3 (± 5,7) x 105 células/ml. La viabilidad de la FV descongelada después de 8 meses, 1 año y 2 años varió entre 23,06% -72,34% con un promedio de 47,7% (±24,64) con la viabilidad más baja correlacionada con casos de congelación a dos años. El uso de la solución de DPBS suplementada con calcio y tiempos de reposo de bolsas para la precipitación de grasas con un tiempo más corto de digestión de la colagenasa dio como resultado un aumento del rendimiento celular final de las células madre. El procedimiento detallado para obtener altos rendimientos de células madre viables fue más eficiente en cuanto a tiempo y rendimiento celular que las técnicas de estudios anteriores. Incluso después de un largo período de criopreservación, se encontraron células ADSC viables en el SVF.

La caracterización de los nueve individuos estudiados, incluyendo su edad, peso, talla e IMC, se muestra en la Tabla 1.
De acuerdo con el rendimiento celular presentado inicialmente, se calculó que el volumen celular inoculado en cultivo era lo más cercano posible a la capacidad del matraz de cultivo de 75 cm2. El volumen muestral sembrado en cada caso se describe en la Tabla 2. Luego, de acuerdo con el rendimiento celular inicial, se determinó ...

Watch this Scientific Journal Video about Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation at JoVE.com

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

El presente protocolo describe una metodología mejorada para el aislamiento de ADSC que resulta en un tremendo rendimiento celular con ganancia de tiempo en comparación con la literatura. Este estudio también proporciona un método sencillo para obtener un número relativamente grande de células viables después de la criopreservación a largo plazo.

Técnica para la obtención de células madre mesenquimales a partir de tejido adiposo y caracterización de fracciones vasculares estromales en criopreservación a largo plazo

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Aquí, hemos demostrado el protocolo para obtener y preservar las células buenas y viables para usos de pasos terapéuticos, como la infusión de células mesenquimales pluripotentes. La principal ventaja de esto, es que utilizando esta técnica, podemos obtener el volumen celular viable frente al tiempo ganado en la etapa de aislamiento de las células del tejido recolectado. Esta técnica se puede extender a todas las enfermedades o afecciones en las que se aplican medicamentos heterogénicos y terapia celular.Este método también se puede aplicar a las pruebas de estabilidad citogenómica en áreas como las pruebas de drogas, donde se pueden alentar los cultivos celulares a largo plazo. Siempre que manipule las células vivas, mantenga la calma y la confianza. Tenga mucho cuidado con la sepsis y esté constantemente alerta con los ojos de un científico para observar cualquier adversidad y tomar buenas decisiones.Comience pesando la bolsa y midiendo la temperatura con un termómetro clínico infrarrojo digital sin contacto. Deje la bolsa durante cinco minutos dentro de la cámara de flujo laminar para precipitar las capas grasas y separar el tejido que contiene las células. Inyecte 100 mililitros de DPBS con calcio en la bolsa de transferencia y mézclela con las manos.Déjalo reposar durante cinco minutos. Luego use una jeringa de 60 mililitros conectada al adaptador de bolsa para desechar la mayor parte del líquido basal que precipita. Repita este proceso dos veces.Agregue 100 mililitros de la solución de digestión a la bolsa y déjela a 37 grados centígrados durante 30 minutos bajo agitación lenta. Luego transfiera todo el contenido de la bolsa a cuatro tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugarlos a 400 G durante 10 minutos a 22 grados centígrados. Deseche el sobrenadante y agregue 5 mililitros de DMEM bajo en glucosa suplementado con 20% de suero bovino fetal al pellet celular.Mezclar una solución fresca de 10 microlitros de azul de tripano al 0,05% en agua destilada con 10 microlitros de suspensión celular durante cinco minutos. Utilice un microscopio de luz invertida con un aumento de 20X y cuente las células viables en una cámara de conteo de células Neubauer. Suspender el pellet celular en un medio crioprotector a una concentración de 1 millón de células por mililitro.Luego coloque 1 mililitro de esta mezcla en viales criogénicos. Use un recipiente de congelación con una velocidad de enfriamiento de 1 grado centígrado por minuto y guárdelo a 80 grados centígrados durante un año. Después de un año, guárdelo en cajas de cassette estándar sumergidas en fase de vapor de nitrógeno líquido.Los datos de los diferentes pasos del procedimiento de los nueve pacientes se presentan en esta tabla. De acuerdo con el rendimiento celular inicial, se determinó un volumen variable de células para cada muestra. 1 mililitro de muestras con mayor rendimiento celular, 1,1 mililitros para muestras con rendimiento celular intermedio y 2 mililitros por muestra con menor rendimiento celular.El rendimiento celular antes del paso uno varió ampliamente incluso cuando se observó la misma confluencia antes de la tripsinización. Por lo tanto, aquí las células pueden haber crecido en capas. La imagen representativa muestra las ADSC mesenquimales adherentes al plástico en el primer paso después del aislamiento en microscopía óptica.Las células muestran adhesión a la morfología plástica y fibroblásica. Las células viables contadas en la cámara de Neubauer en el ensayo de azul de tripano se muestran aquí. Los datos de citometría de flujo de seis pacientes se presentan en esta tabla.A partir de estas células CD45 negativas, se determinó el porcentaje de ADSC con diferentes combinaciones de marcadores de células madre. Las imágenes representativas muestran la subpoblación de células positivas para marcadores asociados a células madre en SVF del caso nueve después de ocho meses de criopreservación. Aquí, R1 es la región celular total analizada en el gráfico de dispersión directa versus dispersión lateral.Y R2 es la región CD45 negativa. Las poblaciones de CD73, CD90 y CD105 son positivas en esta región. La diferenciación ADSC en condrocitos, osteocitos y adipocitos se muestra aquí.Al intentar este procedimiento, recuerde remover lentamente, preferiblemente con las manos, mientras se deja a 37 grados centígrados durante 30 minutos para observar las adherencias y ampollas. Mantenga la temperatura ambiente de trabajo alrededor de 25 grados centígrados y evite cualquier choque térmico a temperaturas mucho mayores. La técnica que hemos mostrado aquí se puede utilizar para aislar con éxito las células mesenquimales pluripotentes de otros tejidos.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

El aislamiento de núcleos de cardiomiocitos a partir de tejidos post-mortem

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Investigación

Medicina

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Surgical Placement of Catheters for Long-term Cardiovascular Exercise Testing in Swine

La colocación quirúrgica de catéteres de larga duración cardiovascular prueba de esfuerzo en los cerdos

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

Una técnica para biopsia de tejido adiposo Abdominal subcutáneo mediante un método no-diatermia

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Stromal Vascular Fraction-enriched Fat Grafting for the Treatment of Symptomatic End-neuromata

Estroma Vascular fracción enriquecida Lipo para el tratamiento de neuromas de extremo sintomáticos

The purpose of this study was to methodically illustrate and highlight the crucial steps of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Trasplante de células madre derivadas de tejido adiposo hoja para reducir fugas después de colectomía parcial en un modelo de rata

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Caracterización de células inmunes en el tejido adiposo humano mediante el uso de citometría de flujo

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Protocolo clínico de producir fracción Vascular estromal derivadas de tejido adiposo para potencial regeneración del cartílago

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Un método libre de enzimas para el aislamiento y la expansión de las células madre mesenquimales derivadas de adiposo humano

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Aislamiento de adipocitos viables y fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo visceral humano adecuado para análisis de ARN y fenotipado de macrófagos

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...