Name: technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation
Uploaded: 2021-12-30T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation at JoVE.com

Vi tackar de patienter som frivilligt deltog och den medicinska och omvårdnadspersonalen på sjukhuset São Paulo. Denna studie stöddes av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) och Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasilien.

Denna studie är godkänd av UNIFESP:s etikkommitté (protokollnummer: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), utförd efter skriftligt informerat samtycke från patienterna enligt Helsingforsdeklarationen (2004). Urvalet i den aktuella studien består av nio kvinnliga patienter i åldern 33-50 år (medelålder 41,5) och genomsnittligt initialt kroppsmassindex (BMI) på 24,54 (mellan 22,32-26,77) (tabell 1) som genomgick estetisk bukplastik på grund av överskott av hud efter graviditeter, vid avdelninge...

Isolering utbyte Det är väl etablerat att kryokonserveringsprocessen, som ofta krävs vid cellterapi, resulterar i signifikant cellförlust, ibland större än 50%29,30,35. Således är en teknisk förbättring för att erhålla högt initialt cellulärt utbyte isolerat grundläggande. Uppsamlingsmetoden för lipoaspirat och cellernas isoleringsmetod måste fokusera på att bevara ett större antal celler, ...

Mänskliga mesenkymala stamceller är fördelaktiga i både grundforskning och tillämpad forskning. Användningen av denna vuxna celltyp överträffar etiska problem - jämfört med användningen av embryonala eller andra celler - som är ett av de mest lovande studieområdena inom autolog vävnadsregenereringsteknik och cellterapi1, såsom det neoplastiska området, behandling av degenerativa sjukdomar och terapeutiska tillämpningar inom rekonstruktiv kirurgi område 2,3,4, 5. Det har tidigare rapporterats att det finns en riklig källa till mesenkymala multipotenta och pluripotenta stamceller i den stromala vaskulära cellfraktionen i fettvävnad 6,7. Dessa ADSC anses vara bra kandidater för användning i cellterapi och transplantation/infusion eftersom ett betydande antal celler med en stark expansionskapacitet ex vivo lätt kan erhållas med ett högt utbyte från ett minimalt invasivt förfarande 5,8.
Det visades också att fettvävnad uppvisar en större kapacitet att tillhandahålla mesenkymala stamceller än två andra källor (benmärg och navelsträngsvävnad)9. Förutom att vara dåligt immunogen och ha en hög förmåga att integrera sig i värdvävnaden och att interagera med de omgivande vävnaderna4,10, har ADSC en multipotent kapacitet för differentiering i cellinjer, med rapporter om kondrogenisk, osteogen och myogen differentiering under lämpliga odlingsförhållanden11,12,13 och i celler, såsom bukspottkörtel, hepatocyter, och neurogena celler14,15,16.
Det vetenskapliga samfundet är överens om att de mesenkymala stamcellernas immunmodulerande effekt är en mer relevant verkningsmekanism för cellterapi17,18,19 än deras differentieringsegenskap. En av de viktigaste fördelarna med ADSC-användningen är möjligheten till autolog infusion eller ympning, som blir en alternativ behandling för flera sjukdomar. För regenerativ medicin har ADSC redan använts vid leverskador, rekonstruktion av hjärtmuskeln, regenerering av nervvävnad, förbättring av skelettmuskelfunktionen, benregenerering, cancerbehandling och diabetesbehandling20,21.
Hittills finns det 263 registrerade kliniska prövningar för utvärdering av ADSC: s potential, listade på webbplatsen för United States National Institutes of Health22. Olika protokoll för att skörda fettvävnad har upprättats, men det finns ingen konsensus i litteraturen om en standardiserad metod för att isolera ADSC för klinisk användning23,24. Lipoaspiratbearbetningsmetoder under och efter operationen kan direkt påverka cellviabiliteten, det slutliga cellulära utbytet25 och kvaliteten på ADSC-populationen20. När det gäller den kirurgiska förbehandlingen är det inte väl fastställt vilken kirurgisk förbehandlingsteknik som ger ett mer betydande antal livskraftiga celler efter isolering eller om bedövningslösningen som injiceras i fettvävnad påverkar cellutbytet och dess funktioner26. På samma sätt kan skillnaden mellan tekniker för att erhålla fettceller leda till så mycket som en 70% minskning av antalet livskraftiga ADSC20. Enligt litteraturen bör mekaniska behandlingar för att erhålla cellpopulationer med hög livskraft - inklusive ultraljud - undvikas, för de kan bryta ner fettvävnaden20. Den manuella fettaspirationsmetoden med sprutor är dock mindre skadlig och orsakar mindre cellförstöring, med tumescent fettsugning som ger ett betydande antal celler med bästa kvalitet26.
Denna teknik använder en saltlösning med lidokain och adrenalin som injiceras i fettsugningsområdet. För varje 3 ml volym injicerad lösning aspireras 1 ml. I denna studie utfördes den våta fettsugningstekniken, där för varje 1 ml adrenalin och saltlösning som injiceras aspireras 0,2 ml fettvävnad. Användningen av matsmältningsenzymer, särskilt kollagenas, är vanligt för processen att isolera ADSC.
Efter det första isoleringssteget i laboratoriet kallas den slutliga pelleten stromal vaskulär fraktion (SVF). Den innehåller olika celltyper27, inklusive endotelprekursorceller, endotelceller, makrofager, glattmuskelceller, lymfocyter, pericyter, pre-adipocyter och ADSC, som kan vidhäfta. När den slutliga isoleringen har avslutats från in vitro-kulturer elimineras celler som inte fäster vid plasten i medelstora utbyten. Efter åtta veckors expansion, medelstora förändringar och passager representerar ADSC större delen av cellpopulationen i kolvarna20. En av de viktigaste fördelarna med att använda isolerade fett-härledda stamceller för en eventuell framtida terapi är möjligheten till kryokonservering. Det visades att kryokonserverad lipoaspirat är en potentiell källa till SVF-celler även efter 6 veckors frysning28, med biologisk aktivitet även efter 2 års kryokonservering29, och full förmåga att växa och differentiera i odling30. Under upptiningsprocessen förloras emellertid vanligtvis en betydande andel celler31. Därför måste lipoaspiratborttagningsprocessen och följande metoder för cellisolering säkerställa högsta cellutbyte.
Denna studie beskriver en snabbare metod för att samla in och isolera ADSC, vilket visar högt cellulärt utbyte och livskraft för bättre effektivitet av cellulära terapier. Dessutom utvärderades effekten av denna förbättrade teknik efter långvarig SVF-kryokonservering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.8 mL cryovials</td>
			<td>Nunc Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>340711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL polyvinyl chloride transfer bag</td>
			<td>JP FARMA</td>
			<td>80146150059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adrenaline (1 mg/mL)</td>
			<td>Hipolabor</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,01,647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride 10%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine gluconate 4%</td>
			<td>VIC PHARMA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11966025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1285601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1,00,496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse TS100</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live and Dead Cell Assay</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>01-3333-41 | 01-3333-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD105</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD11B</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD19</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>745907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD34</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>747822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD45</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>M0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD73</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>746000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: CD90</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>553011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody: HLA-DR</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>340827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1007201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile connector with one spike with needle injection site</td>
			<td>Origen Biomedical Connector, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Code mark: IBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution 0.4%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technique for obtaining mesenchymal stem cell from adipose tissue and stromal vascular fraction characterization in long-term cryopreservation

Mänskliga mesenkymala stamceller som härrör från fettvävnad har blivit alltmer attraktiva eftersom de uppvisar lämpliga egenskaper och är en tillgänglig källa för regenerativa kliniska tillämpningar. Olika protokoll har använts för att erhålla fett-härledda stamceller. Den här artikeln beskriver olika steg i ett förbättrat tidsbesparande protokoll för att få en mer betydande mängd ADSC, som visar hur man kryokonserverar och tinar ADSC för att erhålla livskraftiga celler för odlingsutvidgning. Ett hundra milliliter lipoaspirat samlades in med hjälp av en 26 cm trehåls- och 3 mm kalibersprutfettsugning från bukområdet hos nio patienter som därefter genomgick elektiv bukplastik. Stamcellsisoleringen utfördes med en serie tvättar med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) kompletterad med kalcium och användning av kollagenas. Stromal vaskulär fraktion (SVF) -celler kryokonserverades och deras livskraft kontrollerades genom immunofenotypning. SVF-cellutbytet var 15,7 x 105 celler / ml, mellan 6,1-26,2 celler / ml. Adherenta SVF-celler nådde sammanflöde efter i genomsnitt 7,5 (±4,5) dagar, med ett genomsnittligt cellulärt utbyte på 12,3 (± 5,7) x 105 celler/ml. Livskraften för tinad SVF efter 8 månader, 1 år och 2 år varierade mellan 23,06% -72,34% med i genomsnitt 47,7% (±24,64) med den lägsta livskraften som korrelerade med fall av två års frysning. Användningen av DPBS-lösning kompletterad med kalcium- och påsvilotider för fettutfällning med en kortare tid av kollagenassmältning resulterade i ett ökat stamcells slutliga cellulära utbyte. Det detaljerade förfarandet för att erhålla höga utbyten av livskraftiga stamceller var effektivare när det gäller tid och cellulär avkastning än teknikerna från tidigare studier. Även efter en lång period av kryokonservering hittades livskraftiga ADSC-celler i SVF.

Karakteriseringen av de nio studerade individerna, inklusive deras ålder, vikt, längd och BMI, visas i tabell 1.
Enligt det cellulära utbytet som ursprungligen presenterades beräknades cellvolymen som ympades i odling för att vara så nära kapaciteten hos 75 cm 2-odlingskolven som möjligt. Den urkärna volymen i varje enskilt fall beskrivs i tabell 2. Sedan, enligt det initiala cellulära utbytet, bestämdes en variabel volym celler för varj...

Watch this Scientific Journal Video about Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation at JoVE.com

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Detta protokoll beskriver en förbättrad metod för ADSC-isolering som resulterar i ett enormt cellulärt utbyte med tidsvinst jämfört med litteraturen. Denna studie ger också en enkel metod för att erhålla ett relativt stort antal livskraftiga celler efter långvarig kryokonservering.

Teknik för att erhålla mesenkymal stamcell från fettvävnad och stromal vaskulär fraktionskaraktärisering vid långvarig kryokonservering

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Här har vi visat protokollet för att erhålla och bevara de goda och livskraftiga cellerna för användning av terapeutiska steg, som infusion av pluripotenta mesenkymala celler. Den största fördelen med detta, att vi med hjälp av denna teknik kan erhålla den livskraftiga cellvolymen kontra tiden som erhållits i cellernas isoleringssteg från den uppsamlade vävnaden. Denna teknik kan utvidgas mot alla sjukdomar eller tillstånd där heterogen medicin och cellterapi tillämpas.Denna metod kan också tillämpas på cytogenomisk stabilitetstestning inom områden som drogtestning, där långsiktiga cellkulturer kan uppmuntras. När du manipulerar de levande cellerna, var lugn och säker. Var extremt försiktig med sepsis och var ständigt vaken med en forskares ögon för att observera eventuella motgångar och fatta bra beslut.Börja med att väga påsen och mäta temperaturen med en digital beröringsfri infraröd klinisk termometer. Lämna påsen i fem minuter inuti den laminära flödeskammaren för att fälla ut de fetare skikten och separera vävnaden som innehåller cellerna. Injicera 100 ml DPBS med kalcium i överföringspåsen och blanda den med händerna.Låt det stå i fem minuter. Använd sedan en 60 ml spruta fäst vid påsadaptern för att kasta det mesta av basalvätskan som fälls ut. Upprepa denna process två gånger.Tillsätt 100 ml av matsmältningslösningen till påsen och låt den stå vid 37 grader Celsius i 30 minuter under långsam omrörning. Överför sedan allt påsens innehåll till fyra 50 ml koniska rör och centrifugera dem vid 400 G i 10 minuter vid 22 grader Celsius. Kassera supernatanten och tillsätt 5 ml DMEM låg glukos kompletterad med 20% fetalt bovint serum till cellpelleten.Blanda en ny lösning av 10 mikroliter trypanblå vid 0,05% i destillerat vatten med 10 mikroliter cellulär suspension i fem minuter. Använd ett inverterat ljusmikroskop med 20X förstoring och räkna de livskraftiga cellerna i en Neubauer-cellräkningskammare. Suspendera cellpelleten i ett kryoskyddande medium i en koncentration av 1 miljon celler per milliliter.Placera sedan 1 ml av denna blandning i kryoflaskor. Använd en frysbehållare med en kylhastighet på 1 grad Celsius per minut och förvara vid 80 grader Celsius i ett år. Efter ett år, förvara den i vanliga kassettlådor nedsänkta i flytande kväveångfas.Data från olika steg i proceduren från de nio patienterna presenteras i denna tabell. Enligt det initiala cellulära utbytet bestämdes en variabel volym celler för varje prov. 1 ml prover med högre cellutbyte, 1,1 ml för prover med mellanliggande cellulärt utbyte och 2 ml per prov med lägre cellutbyte.Det cellulära utbytet före passage ett varierade i stort sett även när samma sammanflöde före trypsinisering observerades. Därför kan cellerna här ha vuxit i lager. Den representativa bilden visar de plasthäftande mesenkymala ADSC: erna vid den första passagen efter isolering vid ljusmikroskopi.Cellerna visar vidhäftning till den plast- och fibroblastliknande morfologin. De livskraftiga cellerna som räknas i Neubauer-kammaren i trypanblå analys visas här. Flödescytometridata från sex patienter presenteras i denna tabell.Från dessa CD45-negativa celler bestämdes andelen ADSC med olika kombinationer av stamcellsmarkörer. De representativa bilderna visar delpopulationen av celler som är positiva för stamcellsassocierade markörer i SVF av fall nio efter åtta månaders kryokonservering. Här är R1 den totala cellulära regionen som analyseras i det framåtriktade spridningsdiagrammet kontra sidospridningsdiagrammet.Och R2 är den negativa regionen CD45. CD73-, CD90- och CD105-populationerna är positiva i denna region. ADSC-differentiering i kondrocyter, osteocyter och adipocyter visas här.När du försöker denna procedur, kom ihåg att röra långsamt, helst med händerna, medan du lämnar vid 37 grader Celsius i 30 minuter för att observera vidhäftningar och blåsor. Håll arbetsrumstemperaturen runt 25 grader Celsius och undvik termisk chock vid mycket större temperaturer. Tekniken som vi har visat här kan användas för att framgångsrikt isolera de pluripotenta mesenkymala cellerna från andra vävnader.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolering av kardiomyocetisk Kärnor från Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolering, karakterisering och jämförande differentiering av mänskliga Dental celler Pulp Stem Härstammar från permanenta tänder med hjälp av två olika metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Surgical Placement of Catheters for Long-term Cardiovascular Exercise Testing in Swine

Kirurgisk placering av katetrar för långsiktigt konditionsträning Testning i svin

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

En teknik för subkutan buken fettvävnad biopsi via en icke-diatermi metod

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Stromal Vascular Fraction-enriched Fat Grafting for the Treatment of Symptomatic End-neuromata

Stromaceller vaskulär bråkdel-berikad fett ympning för behandling av symtomatisk slutet-neuromata

The purpose of this study was to methodically illustrate and highlight the crucial steps of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Transplantation av fettvävnad-Derived stamceller blad att minska läckage efter partiell kolektomi i en råtta modell

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Karakterisering av immunceller i mänsklig fettvävnad med hjälp av flödescytometri

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Kliniska protokoll för att producera fettvävnad-Derived Stromal vaskulär bråkdel för potentiella brosk regenerering

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

En enzym fri metod för isolering och expansion av humana adipose-härledda mesenkymala stamceller

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Isolering av livskraftiga adipocyter och stromal vaskulär fraktion från human visceral fettvävnad lämplig för RNA-analys och makrofagfenotypning

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...