Name: digital droplet pcr method for the quantification of aav transduction efficiency in murine retina
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina at JoVE.com

Vi vil gerne takke Oezkan Keles, Josephine Jüttner og Prof. Botond Roska, Institut for Molekylær og Klinisk Oftalmologi Basel, Complex Virus Platform for deres hjælp og støtte til AAV produktion. Vi vil også gerne takke Prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania for AAV8/BP2 stamme. Dyrearbejde udføres på Gebze Technical University dyreanlæg. For det takker vi Leyla Dikmetas og prof. Uygar Halis Tazebay for teknisk bistand og støtte til husdyrhold. Vi vil også gerne takke Dr. Fatma Ozdemir for hendes kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde er støttet af TUBITAK, tilskud numre 118C226 og 121N275, og Sabanci University Integration tilskud.

Alle eksperimentelle protokoller blev accepteret af Sabanci Universitys etiske komité, og forsøg blev udført i overensstemmelse med erklæringen fra 'The Association for Research in Vision and Oftalmology' til brug af dyr i forskning
1. Mindre AAV produktion12
<ol><li>Kultur HEK293T celler ved hjælp af 15 cm plader i komplet 10 mL AF DMEM/10% FBS indtil 70-80% sammenløb.</li>
	<li>Transfektionsblandingen forberedes med 20 μg hjælperplasmid (pHG...

<ol>
	<li>Herrmann, A. K., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+dissection+of+AAV-host+interactions:+The+fast+and+the+curious.">High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).</li><li>Pillay, S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+determinants+of+adeno-associated+viral+vector+entry.">Host determinants of adeno-associated viral vector entry.</a> Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).</li><li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+AAV+tropism+in+the+nervous+system+with+natural+and+engineered+capsids.">Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids.</a> Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).</li><li>Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+structure+and+cell+interactions.">AAV capsid structure and cell interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).</li><li>Han, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+tropism+and+transduction+of+adeno-associated+virus+varies+by+serotype+and+route+of+delivery+(intravitreal,+subretinal,+or+suprachoroidal)+in+rats.">Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats.</a> Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).</li><li>Muraine, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+efficiency+of+adeno-associated+virus+serotypes+after+local+injection+in+mouse+and+human+skeletal+muscle.">Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle.</a> Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).</li><li>Cronin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+and+optogenetic+stimulation+of+retinal+bipolar+cells+by+a+synthetic+adeno-associated+virus+capsid+and+promoter.">Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).</li><li>Higashimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+woodchuck+hepatitis+virus+post-transcriptional+regulatory+element+reduces+readthrough+transcription+from+retroviral+vectors.">The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Albayrak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+quantification+of+proteins+and+mrna+in+single+mammalian+cells.">Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells.</a> Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR.">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Juttner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+and+glial+cell+types+with+synthetic+promoter+AAVs+in+mice,+non-human+primates+and+humans.">Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).</li><li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing.">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li><li>Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Hif1a+rescues+cone+degeneration+and+prevents+subretinal+neovascularization+in+a+model+of+chronic+hypoxia.">Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li><li>Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+tools+for+biological+image+analysis.">Open source tools for biological image analysis.</a> Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).</li><li>Parks, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ribosomal+RNA+alleles+are+conserved+and+exhibit+tissue-specific+expression.">Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression.</a> Science Advances. 4 (2), (2018).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>Maclachlan, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+safety+evaluation+of+AAV2-sFLT01-+a+gene+therapy+for+age-related+macular+degeneration.">Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration.</a> Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).</li><li>Stieger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intact+rAAV+particles+up+to+6+years+after+successful+gene+transfer+in+the+retina+of+dogs+and+primates.">Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates.</a> Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+gene+editing+prevents+deafness+in+a+model+of+dominant+progressive+hearing+loss.">Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss.</a> Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).</li><li>Cox, D. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+editing+with+CRISPR-Cas13.">RNA editing with CRISPR-Cas13.</a> Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).</li></ol>

I denne protokol genererede vi to AAV-vektorer, der har forskellige capsidproteiner og titered dem derefter i overensstemmelse hermed. Et af de mest afgørende trin i denne protokol er at producere tilstrækkelige mængder AAVs , der vil give påviselige reporter udtryk efter transduktion12,13. 
Titering af AAVs er også en vigtig faktor til at justere doser af AAV for intravitreal injektioner. Når disse vigtige kriterier er opfyldt...

Adeno associerede vira (AAVs) er nu almindeligt anvendt til en række retinale genterapi undersøgelser. AAVs giver en sikker og effektiv måde at genlevering med mindre immunogenicitet og færre genomintegrationer. AAV-indtræden i målcellen sker gennem endokytose, hvilket kræver binding af receptorer og co-receptorer på celleoverfladen1,2. Derfor afhænger transduktionseffektiviteten af AAVs for forskellige celletyper hovedsageligt af capsid og dens interaktioner med værtscellereceptorerne. AAVs har serotyper og hver serotype kan have forskellige cellulære / væv troper og transduktion effektivitetsgevinster. Der er også kunstige AAV serotyper og varianter genereret af kemisk modifikation af virus capsid, produktion af hybrid capsids, peptid indsættelse, capsid shuffling, rettet evolution, og rationel mutagenese3. Selv mindre ændringer i aminosyresekvens eller capsidstruktur kan have indflydelse på interaktioner med værtscellefaktorer og resultere i forskellige troper4. Ud over capsid varianter, andre faktorer som injektion rute og batch-til-batch variation af AAV produktion kan påvirke transduktion effektivitet AAVs i neuronal nethinden. Derfor er pålidelige metoder til sammenligning af transduktionshastigheder for forskellige varianter nødvendige.
De fleste af metoderne til bestemmelse af AAV transduktion effektivitet stole på reporter genekspression. Disse omfatter fluorescerende billeddannelse, immunohistochemistry, western blot, eller histokemisk analyse af reporter genprodukt5,6,7. På grund af AAVs størrelsesbegrænsning er det imidlertid ikke altid muligt at inkludere reportergener for at overvåge transduktionseffektiviteten. Brug af stærke initiativtagere som hybrid CMV forstærker / kylling beta-actin eller Woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatoriske element (WPRE) som en mRNA stabilisator sekvens yderligere komplicerer størrelsen problem8. Derfor vil det også være gavnligt at definere transduktionshastigheden for injicerede AAVs med en mere direkte metode.
Digital dråbe PCR (dd-PCR) er en kraftfuld teknik til at kvantificere mål-DNA fra små mængder prøver. dd-PCR-teknologi afhænger af indkapsling af mål-DNA- og PCR-reaktionsblandingen ved hjælp af oliedråber. Hver dd-PCR-reaktion indeholder tusindvis af dråber. Hver dråbe behandles og analyseres som en uafhængig PCR-reaktion9. Analyse af dråber gør det muligt at beregne det absolutte kopiantal af mål-DNA-molekyler i enhver prøve ved blot at bruge Poisson-algoritmen. Da transduktionseffektiviteten af AAVs er korreleret med kopinummeret af AAV-genomer i neuronal nethinden, brugte vi dd-PCR-metoden til at kvantificere AAV-genomer.
Her beskriver vi en dd-PCR-metode til beregning af transduktionseffektiviteten af AAV-vektorer fra retinal genomisk DNA6,10. For det første blev AAVs, der udtrykker tdTomato-reporter, genereret ved hjælp af protokollen i lille skala og titered af dd-PCR-metoden11. For det andet blev AAVs intravitreally injiceret i neuronal nethinden. For at demonstrere transduktionseffektiviteten kvantificerede vi først tdTomato-udtrykket ved hjælp af fluorescerende mikroskopi og ImageJ-software. Dette blev efterfulgt af isolering af genomisk DNA til kvantificering af AAV-genomer i injicerede nethinder ved hjælp af dd-PCR. Sammenligning af tdTomato-ekspressionsniveauer med de transduced AAV-genomer kvantificeret ved dd-PCR viste, at dd-PCR-metoden nøjagtigt kvantificerede AAV-vektorernes transduktionseffektivitet. Vores protokoller viste en detaljeret beskrivelse af en dd-PCR-baseret metode til at kvantificere AAV transduktionseffektivitet. I denne protokol viser vi også det absolutte antal AAV-genomer, der overføres efter intravitreale injektioner ved blot at bruge fortyndingsfaktoren efter genomisk DNA-isolering og dd-PCR-resultaterne. Samlet set giver denne protokol en kraftfuld metode, som ville være et alternativ til reporter udtryk til at kvantificere transduktion effektivitetsgevinster af AAV vektorer i nethinden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-Well Semi-Skirted ddPCR plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6JRj mice strain</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>C57BL/6JRj</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 gaskets</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863009</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864008</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604Q</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>L 1825</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generation oil eva green</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864006</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>p30-3306</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil seals for PX1 PCR Plate sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>320933</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>ADEKA <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />LA&#199; SANAY<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" /> VE T<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />CARET A.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq01v2.jpg" />.</td>
			<td>N01AB06</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector MM33</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>82-42-101-0000</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Phoenix Research Labs</td>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>S01FB01</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil Syringe 10 &#956;l</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle RN G36, 25 mm, PST 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BL-2</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI-MAX</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pHGT1-Adeno1</td>
			<td>PlasmidFactory</td>
			<td>PF1236</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24040032</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864034</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864001</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPLITTER FORCEP WATCHER 
			MAKER - LENGTH = 13.5 CM</td>
			<td>endostall medical</td>
			<td>EJN-160-0155</td>
			<td>Retina isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril Syringe Filter</td>
			<td>AISIMO</td>
			<td>ASF33PS22S</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Genomic DNA Kit</td>
			<td>EcoSpin</td>
			<td>E1070</td>
			<td>gDNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>S01CA01</td>
			<td>anti-inflammatory / antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropamid (% 0.5 tropicamide)</td>
			<td>Bilim <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />la&#231; Sanayi ve Ticaret A.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq01v2.jpg" />.</td>
			<td>S01FA06</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbonuclease</td>
			<td>Accelagen</td>
			<td>N0103L</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscotears (carbomer 2 mg/g)</td>
			<td>Bausch+Lomb</td>
			<td>S01XA20</td>
			<td>lubricant eye drop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital droplet pcr method for the quantification of aav transduction efficiency in murine retina

Mange retinale cellebiologi laboratorier nu rutinemæssigt bruge Adeno-associerede vira (AAVs) til genredigering og lovgivningsmæssige applikationer. Effektiviteten af AAV transduktion er normalt kritisk, hvilket påvirker de samlede eksperimentelle resultater. En af de vigtigste determinanter for transduktionseffektivitet er serotypen eller varianten af AAV-vektoren. I øjeblikket, forskellige kunstige AAV serotyper og varianter er tilgængelige med forskellige tilhørsforhold til at være vært celle overflade receptorer. For retinal genterapi resulterer dette i varierende grader af transduktionseffektivitet for forskellige retinale celletyper. Derudover kan injektionsruten og kvaliteten af AAV-produktionen også påvirke den retinale AAV-transduktionseffektivitet. Derfor er det vigtigt at sammenligne effektiviteten af forskellige varianter, batches og metoder. Den digitale dråbe PCR (dd-PCR) metode kvantificerer nukleinsyrer med høj præcision og tillader udførelse af absolut kvantificering af et givet mål uden nogen standard eller en reference. Ved hjælp af dd-PCR er det også muligt at vurdere transduktionseffektiviteten af AAVs ved absolut kvantificering af AAV-genomkopinumre i en injiceret nethinde. Her giver vi en enkel metode til at kvantificere transduktionshastigheden for AAVs i retinale celler ved hjælp af dd-PCR. Med mindre ændringer kan denne metode også danne grundlag for kvantificeringen af mitokondrie-DNA'et med kopinummeret samt vurdering af effektiviteten af baseredigering, kritisk for flere retinale sygdomme og genterapiapplikationer.

AAV-produktion i lille skala er en hurtig og effektiv metode, der giver vektorer til intravitreale injektioner (Figur 1). Mindre AAV-produktion giver normalt titere inden for intervallet 1 x 1012 GC/ml, hvilket er tilstrækkeligt til at detektere reporterudtryk i nethinden (Figur 2). Titering af AAV ved hjælp af dd-PCR giver ensartede resultater. ITR2 og WPRE specifikke primere bruges rutinemæssigt, og startkoncentrationen af hvert målmolekyle blev...

Watch this Scientific Journal Video about Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina at JoVE.com

Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina

Denne protokol præsenterer, hvordan man kvantificerer AAV transduktion effektivitet i musen nethinden ved hjælp af digital dråbe PCR (dd-PCR) sammen med lille skala AAV produktion, intravitreal injektion, retinal billeddannelse, og retinal genomisk DNA isolation.

Digital droplet PCR-metode til kvantificering af AAV Transduktionseffektivitet i Murine Retina

Many retinal cell biology laboratories now routinely use Adeno-associated viruses (AAVs) for gene editing and regulatory applications. The efficiency of ...

I denne video vil vi vise, hvordan du kvantificerer AAV-transduktion i muse nethinden ved hjælp af digital dråbe PCR-metode, som er ekstremt følsom og gør absolut kvantificering af mål-DNA'et. Vi har udviklet denne metode primært til store AVV konstruktioner, der ikke tillader os at bruge en reporter gen som CRISPR baserede konstruktioner. Ved at bruge denne metode kan vi simpelthen kvantificere transduktionshastigheden for AAVs i nethinden.Denne metode bygger på følsomhed og absolut kvantificering af den digitale dråbe PCR og giver ligetil resultater. I denne video vil vi vise, hvordan du kvantificerer AAV-transduktion i muse nethinden ved hjælp af digital dråbe PCR-metode, som er ekstremt følsom og gør absolut kvantificering af mål-DNA'et. Vi har udviklet denne metode primært til store områdekonstruktioner, der ikke tillader os at bruge et reporter-gen som CRISPR-baserede konstruktioner.Ved at bruge denne metode kan vi simpelthen kvantificere transduktionshastigheden for AAVs i nethinden. Denne metode bygger på følsomhed og absolut kvantificering af de to droplet PCR og giver ligetil resultater. På grund af effektiviteten af den digitale dråbe PCR-metode skifter flere laboratorier allerede fra kvantitativ pcr i realtid til digital dråbe PCR- eller AAV-titrering.Denne metode kan også danne grundlag for mitokondrie DNA kvantificering i nethinden, samt kontrollere effektiviteten af CRISPR baseret mutation korrektion for genterapi i musen nethinden. Forbered transfection blanding med AAV hjælper plasmid, AAV capsid plasmid, AAV vektor, og PI løsning i fem milliliter efterspørgsel. Tilsæt de fem milliliter tilberedt transfection blanding i kultur medier.Inkubér transfected celler ved 37 grader celsius. Saml medierne på 48 til 60 timer efter transfection. Fordøje medierne med DNAs i en endelig koncentration af 250 enheder per milliliter i 30 minutter ved 37 grader Celsius og en centrifuge det på 4.000 g fire grader Celsius i 30 minutter.For våd den regenererede cellulosemembran med PBS. Filtrer mediet med 0,22 mikrometer sprøjtefilter i den forbehandlede regenererede cellulosemembran til 100 kilo Daltons. Centrifugere den regenererede cellulosemembran ved 4.000 G fire grader Celsius i 30 minutter og kassér mediet.Vask og centrifuge den regenererede cellulosemembran med PBS indeholdende 0,001% pluronic F68 tre gange ved 4000 G fire grader Celsius i 30 minutter. Saml koncentrerede AAVs fra den øverste del af den regenererede cellulosemembran og fordel til videre brug. Her viste vi, hvordan man laver en mindre AAV-produktion.Efter at have undersøgt denne protokol, bør du være i stand til at gøre AVVs, der er tilstrækkelig til at se reporter udtryk i nethinden. Du kan også følge protokollen for digital PCR at være i stand til at titer producere AAVs. Påfør en dråbe 0,5% tropicamid og 2,5% phenylephrinehydrochlorid, der indeholder øjendråbe før anæstesi, til at spile eleverne.Bedøve mus med isoflurane og kontrollere reflekserne. Påfør 0,3% tobramycin og 0,1% dexamethason sterile oftalmologiske opløsning øjenfald til hvert øje før injektionsproceduren. Brug den kirurgiske krog til at stabilisere det øverste øjenlåg.Træk lidt tilbage for at eksponere den dorsale del af øjet. Tape krogen til bandet for at holde på plads. Fjern bindehinden med den buede iris saks til at udsætte sclera af øjet.Brug en frisk og steril 30G insulinsprøjte til at punktere scleraen. Sæt mikrosprøjtens nål gennem den samme punktering ved hjælp af mikromanipulator. Placer spidsen af nålen bag linsen i midten af øjet kop.Indsprøjt en mikro liter AAV-opløsning langsomt ind i øjets glaslegeme. Lad nålen være på plads i et minut og træk langsomt nålen tilbage. Påfør antiinflammatorisk og antibakteriel aktuel gelbehandling, der indeholder 0,3% tobramycin og 0,1% dexamethason til øjenkoppen.Påfør en drop off 0,5% tropicamid. Og 2,5% phenylephrinehydrochlorid indeholdende øjendråbe før anæstesi til at spile eleverne. Påfør carbamid to milligram pr gram aktuel gel på overfladen af øjnene.Juster musestativet efter behov for at centrere museøjet. Udfør fundus- og fluorescensbilleddannelse på begge øjne for at følge TdTomato-udtrykket en uge og to uger efter intravitreal injektion. Aflive dyrene ved hjælp af kuldioxid indånding før proceduren.Skift øje bolden fremad ved hjælp af en 13,5 centimeter splitter sammentrak. Fjern linsen sammen med den resterende glaslegeme. Skær forbindelsen af øjeæblet til synsnerven med en præcision buet sammentrikken og forsigtigt klemme nethinden med de samme buede sammenkrikken.Isoler genomisk DNA med en kommercialiseret proteinase K fordøje filmbaseret væv genomisk DNA-kit. Digest nethinden ved 55 grader Celsius 200 G i 30 minutter med proteinase K.Lyse nethinden helt og følg producentensprotocol. I disse protokoller, har vi vist intravitreal injektion fundus florescence imaging, samt nethinden og genomisk DNA isolation.Disse er meget kritiske procedurer for nethinden, og ved at følge denne protokol, bør du være i stand til at injicere de producerede AAVs og følge op på deres udtryk profil. Og slev, at transduktion effektivitet ved at kvantificere AAV genomer i retinal genomisk DNA. Her kan du se den grundlæggende anvendelse af digital dråbe PCR, hvor du kan lave en absolut kvantificering af AAV-genom, der transduce i retinale celler.Fortynd genomiske DNAs fra injicerede nethinder i 0,05% pluronic F 68 løsning for at nå en endelig koncentration af et nanogram pr. mikroliter for hver prøve. Udfør dråbegenerering i en 20 mikroliters PCR-reaktionsblanding, herunder et nanogram genomisk DNA 125 nanomolars primere og 2X stedsegrønne super mix. Læg prøveblandingen til den midterste del af patronen til dråbegenerering.Derefter tilsættes 70 mikroliter dråbe generation olie i den nederste række af patron. Sæt pakningen oven på patronen. Sørg for, at der ikke er mellemrum mellem pakningen og patronen.Sæt den derefter i dråbegeneratoren. Tag forsigtigt ca. 40 mikroliter dråber, der genereres i den øverste klokke. Tilføj dråbeløsning til semi skirted 96-Well PCR reaktion plade.Forsegl PCR-pladen med en PCR-pladeforsegling ved hjælp af aluminiumsforseglingsfolie. Placer PCR-pladen i den 96-Brønd varmeforseglet termiske cycler. Brug den ddPCR-protokol, der er angivet i artiklen.Placer PCR-plade i dråbelæseren for at analysere data. Efter at have set denne video, bør du være i stand til at udføre grundlæggende digital PCR-teknik. Du kan også bruge øvede celler med mindre mængder materiale, som er ideel til digital PCR-teknik.Du bør dog omhyggeligt justere mål-DNA-mængden, så den ikke overskrider grænsen for digital dråbe PCR. Her er rutediagrammet for forsøgsproceduren. Vi udførte små AAV produktion, som efterfølges af AAV titering.Derefter udførte vi intravitreal injektion. Bagefter kvantificerede vi fluorescerende intensitet ved fundus fluorescensbilleddannelse. Derefter isolerede musen nethinder og ekstraheret genomisk DNA fra nethinder for ddPCR.Titering AAV er også afgørende for at kunne kvantificere AAV-transduktion korrekt. ddPCR afhænger af generering af dråber, der har fortyndet mål AAV genom. Repræsentative ddPCR-resultater viser positive og negative dråber for AVV-genomet.Positiv over tærsklen og negativ er under. Efter at have multipliceret med fortyndingsfaktorerne blev titer af AAVs fundet at være 10 til 12 i genomkopier pr. milliliter. For korrekt at kvantificere AAV tranduktion effektivitet, flere nethinder blev injiceret.Injicerede dyr blev afbildet, og fluorescens middelintensitet blev beregnet. På to uger tidspunkt, nethinden blev isoleret. Og ddPCR blev udført ved hjælp af WPRE og 18 S primere.Fluorescensintensiteten af AAV injicerede nethinder var korreleret med AAV-genomberegninger, der viste metodens effekt. Her har vi vist flere teknikker, herunder små AAV-præparat intravitreal injektion.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Vurdering af Vascular Regeneration i CNS Brug af musen Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventrikulær Viral Injektion af Neonatal Mouse Hjerne for Vedvarende og Udbredt Neuronal transduktion

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics i Cone Lysmodtageren Axon Terminals i Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Okulær kinematik målt ved In Vitro Stimulation af hjernenerver i skildpadden

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

En volumetriske metode til kvantificering af Cerebral vasospasme i en Murine Model af subaraknoid blødning

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupillær to-foton In vivo Billeddannelse af musens nethinde

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

To peelingmetoder til isolering af fotoreceptorcellerum i musenehinden til proteinanalyse

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

In vivo Aflæsninger af vaskulær skade i musens nethinde for at fremme reproducerbarhed

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...