Name: digital droplet pcr method for the quantification of aav transduction efficiency in murine retina
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina at JoVE.com

We willen Oezkan Keles, Josephine Jüttner en Prof. Botond Roska, Institute of Molecular and Clinical Ophthalmology Basel, Complex Viruses Platform bedanken voor hun hulp en ondersteuning voor de productie van AAV. We willen ook Prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, de Universiteit van Pennsylvania bedanken voor de AAV8 / BP2-stam. Dierwerk wordt uitgevoerd in de dierenfaciliteit van de Gebze Technical University. Daarvoor bedanken we Leyla Dikmetas en Prof. Uygar Halis Tazebay voor technische assistentie en ondersteuning voor de veehouderij. We willen ook Dr. Fatma Ozdemir bedanken voor haar commentaar op het manuscript. Dit werk wordt ondersteund door TUBITAK, subsidienummers 118C226 en 121N275, en Sabanci University Integration grant.

Alle experimentele protocollen werden geaccepteerd door de ethische commissie van de Sabanci University en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de verklaring van 'The Association for Research in Vision and Ophthalmology' voor het gebruik van dieren in onderzoek
1. Kleinschalige AAV-productie12
<ol><li>Kweek HEK293T-cellen met behulp van 15 cm platen in volledige 10 ml DMEM / 10% FBS tot 70-80% confluentie.</li>
	<li>Bereid het transfe...

<ol>
	<li>Herrmann, A. K., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+dissection+of+AAV-host+interactions:+The+fast+and+the+curious.">High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).</li><li>Pillay, S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+determinants+of+adeno-associated+viral+vector+entry.">Host determinants of adeno-associated viral vector entry.</a> Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).</li><li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+AAV+tropism+in+the+nervous+system+with+natural+and+engineered+capsids.">Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids.</a> Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).</li><li>Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+structure+and+cell+interactions.">AAV capsid structure and cell interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).</li><li>Han, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+tropism+and+transduction+of+adeno-associated+virus+varies+by+serotype+and+route+of+delivery+(intravitreal,+subretinal,+or+suprachoroidal)+in+rats.">Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats.</a> Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).</li><li>Muraine, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+efficiency+of+adeno-associated+virus+serotypes+after+local+injection+in+mouse+and+human+skeletal+muscle.">Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle.</a> Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).</li><li>Cronin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+and+optogenetic+stimulation+of+retinal+bipolar+cells+by+a+synthetic+adeno-associated+virus+capsid+and+promoter.">Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).</li><li>Higashimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+woodchuck+hepatitis+virus+post-transcriptional+regulatory+element+reduces+readthrough+transcription+from+retroviral+vectors.">The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Albayrak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+quantification+of+proteins+and+mrna+in+single+mammalian+cells.">Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells.</a> Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR.">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Juttner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+and+glial+cell+types+with+synthetic+promoter+AAVs+in+mice,+non-human+primates+and+humans.">Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).</li><li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing.">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li><li>Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Hif1a+rescues+cone+degeneration+and+prevents+subretinal+neovascularization+in+a+model+of+chronic+hypoxia.">Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li><li>Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+tools+for+biological+image+analysis.">Open source tools for biological image analysis.</a> Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).</li><li>Parks, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ribosomal+RNA+alleles+are+conserved+and+exhibit+tissue-specific+expression.">Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression.</a> Science Advances. 4 (2), (2018).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>Maclachlan, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+safety+evaluation+of+AAV2-sFLT01-+a+gene+therapy+for+age-related+macular+degeneration.">Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration.</a> Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).</li><li>Stieger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intact+rAAV+particles+up+to+6+years+after+successful+gene+transfer+in+the+retina+of+dogs+and+primates.">Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates.</a> Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+gene+editing+prevents+deafness+in+a+model+of+dominant+progressive+hearing+loss.">Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss.</a> Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).</li><li>Cox, D. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+editing+with+CRISPR-Cas13.">RNA editing with CRISPR-Cas13.</a> Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).</li></ol>

In dit protocol hebben we twee AAV-vectoren gegenereerd die verschillende capsid-eiwitten hebben en ze vervolgens dienovereenkomstig getiterd. Een van de meest cruciale stappen van dit protocol is het produceren van voldoende hoeveelheden AAV's die detecteerbare reporterexpressie opleveren na de transductie12,13.
Titering van AAV's is ook een belangrijke factor om de doseringen van AAV voor intravitreale injecties aan te passen. Zodra ...

Adeno-geassocieerde virussen (AAV's) worden nu vaak gebruikt voor een verscheidenheid aan retinale gentherapiestudies. AAV's bieden een veilige en efficiënte manier van genafgifte met minder immunogeniciteit en minder genoomintegraties. AAV-toegang tot de doelcel vindt plaats door endocytose, die binding van receptoren en co-receptoren op het celoppervlak vereist1,2. Daarom hangt de transductie-efficiëntie van AAV's voor verschillende celtypen voornamelijk af van de capsid en zijn interacties met de gastheercelreceptoren. AAV's hebben serotypen en elk serotype kan verschillende cellulaire / weefseltropismen en transductie-efficiëntie hebben. Er zijn ook kunstmatige AAV-serotypen en varianten gegenereerd door chemische modificatie van de viruscapside, productie van hybride capsiden, peptide-insertie, capsid schuifelen, gerichte evolutie en rationele mutagenese3. Zelfs kleine veranderingen in aminozuurvolgorde of capsidstructuur kunnen een invloed hebben op interacties met gastheercelfactoren en resulteren in verschillende tropismen4. Naast capsid-varianten kunnen andere factoren zoals injectieroute en batch-to-batchvariatie van AAV-productie de transductie-efficiëntie van AAV's in het neuronale netvlies beïnvloeden. Daarom zijn betrouwbare methoden voor de vergelijking van transductiesnelheden voor verschillende varianten noodzakelijk.
De meeste methoden voor het bepalen van de AAV-transductie-efficiëntie zijn afhankelijk van reporter-genexpressie. Deze omvatten fluorescerende beeldvorming, immunohistochemie, western blot of histochemische analyse van het reporter-genproduct5,6,7. Vanwege de groottebeperking van AAV's is het echter niet altijd haalbaar om reportergenen op te nemen om de transductie-efficiëntie te bewaken. Het gebruik van sterke promotors zoals de hybride CMV-versterker / kip beta-actine of Woodchuck hepatitis post-transcriptioneel regulerend element (WPRE) als een mRNA-stabilisatorsequentie compliceert het grootteprobleemverder 8. Daarom zal het ook nuttig zijn om de transductiesnelheid van geïnjecteerde AAV's te definiëren met een meer directe methodologie.
Digitale druppel PCR (dd-PCR) is een krachtige techniek om doel-DNA te kwantificeren uit minuscule hoeveelheden monsters. dd-PCR-technologie is afhankelijk van de inkapseling van het doel-DNA en het PCR-reactiemengsel door oliedruppeltjes. Elke dd-PCR-reactie bevat duizenden druppeltjes. Elke druppel wordt verwerkt en geanalyseerd als een onafhankelijke PCR-reactie9. Analyse van druppels maakt het mogelijk om het absolute aantal doel-DNA-moleculen in elk monster te berekenen door simpelweg het Poisson-algoritme te gebruiken. Omdat de transductie-efficiëntie van de AAV's gecorreleerd is met het kopieaantal AAV-genomen in het neuronale netvlies, gebruikten we de dd-PCR-methode om AAV-genomen te kwantificeren.
Hier beschrijven we een dd-PCR-methodologie om de transductie-efficiëntie van AAV-vectoren te berekenen uit retinaal genomisch DNA6,10. Ten eerste werden AAV's die tdTomato reporter uitdrukken gegenereerd met behulp van het kleinschalige protocol en getiterd door de dd-PCR-methode11. Ten tweede werden AAV's intravitreally geïnjecteerd in het neuronale netvlies. Om de transductie-efficiëntie aan te tonen, hebben we eerst tdTomato-expressie gekwantificeerd met behulp van fluorescerende microscopie en ImageJ-software. Dit werd gevolgd door de isolatie van genomisch DNA voor de kwantificering van AAV-genomen in geïnjecteerde netvliezen met behulp van dd-PCR. Vergelijking van tdTomato-expressieniveaus met de getransduceerde AAV-genomen gekwantificeerd door de dd-PCR toonde aan dat de dd-PCR-methode de transductie-efficiëntie van AAV-vectoren nauwkeurig kwantificeerde. Onze protocollen toonden een gedetailleerde beschrijving van een op dd-PCR gebaseerde methodologie om de efficiëntie van AAV-transductie te kwantificeren. In dit protocol tonen we ook het absolute aantal AAV-genomen dat wordt getransduceerd na intravitreale injecties door simpelweg de verdunningsfactor te gebruiken na genomische DNA-isolatie en de dd-PCR-resultaten. Over het algemeen biedt dit protocol een krachtige methode, die een alternatief zou zijn voor reporterexpressie om transductie-efficiëntie van AAV-vectoren in het netvlies te kwantificeren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-Well Semi-Skirted ddPCR plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6JRj mice strain</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>C57BL/6JRj</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 gaskets</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863009</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864008</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604Q</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>L 1825</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generation oil eva green</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864006</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>p30-3306</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil seals for PX1 PCR Plate sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>320933</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>ADEKA <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />LA&#199; SANAY<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" /> VE T<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />CARET A.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq01v2.jpg" />.</td>
			<td>N01AB06</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector MM33</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>82-42-101-0000</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Phoenix Research Labs</td>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>S01FB01</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil Syringe 10 &#956;l</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle RN G36, 25 mm, PST 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BL-2</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI-MAX</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pHGT1-Adeno1</td>
			<td>PlasmidFactory</td>
			<td>PF1236</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24040032</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864034</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864001</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPLITTER FORCEP WATCHER 
			MAKER - LENGTH = 13.5 CM</td>
			<td>endostall medical</td>
			<td>EJN-160-0155</td>
			<td>Retina isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril Syringe Filter</td>
			<td>AISIMO</td>
			<td>ASF33PS22S</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Genomic DNA Kit</td>
			<td>EcoSpin</td>
			<td>E1070</td>
			<td>gDNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>S01CA01</td>
			<td>anti-inflammatory / antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropamid (% 0.5 tropicamide)</td>
			<td>Bilim <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />la&#231; Sanayi ve Ticaret A.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq01v2.jpg" />.</td>
			<td>S01FA06</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbonuclease</td>
			<td>Accelagen</td>
			<td>N0103L</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscotears (carbomer 2 mg/g)</td>
			<td>Bausch+Lomb</td>
			<td>S01XA20</td>
			<td>lubricant eye drop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital droplet pcr method for the quantification of aav transduction efficiency in murine retina

Veel retinale celbiologische laboratoria gebruiken nu routinematig Adeno-geassocieerde virussen (AAV's) voor genbewerking en regulerende toepassingen. De efficiëntie van AAV-transductie is meestal van cruciaal belang, wat de algehele experimentele resultaten beïnvloedt. Een van de belangrijkste determinanten voor transductie-efficiëntie is het serotype of de variant van de AAV-vector. Momenteel zijn verschillende kunstmatige AAV-serotypen en varianten beschikbaar met verschillende affiniteiten om celoppervlakreceptoren te hosten. Voor retinale gentherapie resulteert dit in verschillende gradaties van transductie-efficiëntie voor verschillende retinale celtypen. Bovendien kunnen de injectieroute en de kwaliteit van de AAV-productie ook van invloed zijn op de retinale AAV-transductie-efficiëntie. Daarom is het essentieel om de efficiëntie van verschillende varianten, batches en methodologieën te vergelijken. De digitale druppel PCR (dd-PCR) methode kwantificeert de nucleïnezuren met hoge precisie en maakt het mogelijk om absolute kwantificering van een bepaald doel uit te voeren zonder enige standaard of referentie. Met behulp van dd-PCR is het ook mogelijk om de transductie-efficiëntie van AAV's te beoordelen door absolute kwantificering van AAV-genoomkopieën in een geïnjecteerd netvlies. Hier bieden we een eenvoudige methode om de transductiesnelheid van AAV's in retinale cellen te kwantificeren met behulp van dd-PCR. Met kleine aanpassingen kan deze methodologie ook de basis vormen voor de kwantificering van het aantal kopieën van mitochondriaal DNA en het beoordelen van de efficiëntie van base editing, cruciaal voor verschillende retinale ziekten en gentherapietoepassingen.

Kleinschalige AAV-productie is een snelle en efficiënte methode die vectoren levert voor intravitreale injecties(figuur 1). Kleinschalige AAV-productie geeft meestal titers binnen het bereik van 1 x 1012 GC / ml, wat voldoende is om reporterexpressie in het netvlies te detecteren(figuur 2). Titering van AAV met behulp van dd-PCR geeft consistente resultaten. ITR2- en WPRE-specifieke primers worden routinematig gebruikt en de startconcentratie van elk...

Watch this Scientific Journal Video about Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina at JoVE.com

Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina

Dit protocol presenteert hoe AAV-transductie-efficiëntie in het netvlies van muizen kan worden gekwantificeerd met behulp van digitale druppel PCR (dd-PCR) samen met kleinschalige AAV-productie, intravitreale injectie, retinale beeldvorming en retinale genomische DNA-isolatie.

Digitale druppel PCR-methode voor de kwantificering van AAV-transductie-efficiëntie in murine retina

Many retinal cell biology laboratories now routinely use Adeno-associated viruses (AAVs) for gene editing and regulatory applications. The efficiency of ...

In deze video laten we zien hoe aav-transductie in het netvlies van muizen kan worden gekwantificeerd met behulp van de digitale druppel-PCR-methode, die extreem gevoelig is en absolute kwantificering van het doel-DNA doet. We hebben deze methode voornamelijk ontwikkeld voor grote AVV-constructies waarmee we geen reportage-gen zoals CRISPR-gebaseerde constructen kunnen gebruiken. Door deze methode te gebruiken, kunnen we eenvoudig de transductiesnelheid van AAV's in het netvlies kwantificeren.Deze methode is gebaseerd op gevoeligheid en absolute kwantificering van de digitale druppel PCR en levert eenvoudige resultaten op. In deze video laten we zien hoe aav-transductie in het netvlies van muizen kan worden gekwantificeerd met behulp van de digitale druppel-PCR-methode, die extreem gevoelig is en absolute kwantificering van het doel-DNA doet. We hebben deze methode voornamelijk ontwikkeld voor constructies met een groot gebied waarmee we geen reportage-gen zoals CRISPR-gebaseerde constructies kunnen gebruiken.Door deze methode te gebruiken, kunnen we eenvoudig de transductiesnelheid van AAV's in het netvlies kwantificeren. Deze methode is gebaseerd op gevoeligheid en absolute kwantificering van de twee druppels PCR en levert eenvoudige resultaten op. Vanwege de efficiëntie van de digitale druppel PCR-methodologie schakelen verschillende laboratoria al over van kwantitatieve real-time PCR naar digitale druppel-PCR- of AAV-titrering.Deze methode kan ook een basis bieden voor mitochondriale DNA-kwantificering in het netvlies, evenals het controleren van de efficiëntie van de op CRISPR gebaseerde mutatiecorrectie voor gentherapie in het netvlies van de muis. Bereid transfectiemengsel met AAV-helperplasmide, AAV-capsidplasmide, AAV-vector en PI-oplossing in vijf milliliter vraag. Voeg de vijf milliliter bereide transfectiemengsel toe aan kweekmedia.Incubeer getransfecteerde cellen bij 37 graden Celsius. Verzamel de media 48 tot 60 uur na transfectie. Verteer de media met DNA's in een eindconcentratie van 250 eenheden per milliliter gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en centrifugeer het gedurende 30 minuten bij 4.000 g vier graden Celsius.Bevochtig het geregenereerde cellulosemembraan voor met PBS. Filtreer de media met 0,22 micrometer spuitfilter in het voorbevochtigde geregenereerde cellulosemembraan voor 100 kilo Dalton. Centrifugeer het geregenereerde cellulosemembraan bij 4.000 G vier graden Celsius gedurende 30 minuten en gooi de media weg.Was en centrifugeer het geregenereerde cellulosemembraan met PBS dat 0,001% pluronic F68 bevat driemaal bij 4000 G vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Verzamel geconcentreerde AAV's uit het bovenste deel van het geregenereerde cellulosemembraan en wijs toe voor verder gebruik. Hier hebben we laten zien hoe je een kleinschaligere AAV-productie kunt maken.Na het doorlichten van dit protocol, zou u avv's moeten kunnen maken die voldoende zijn om de expressie van de verslaggever in het netvlies te zien. U kunt ook het protocol voor digitale PCR volgen om de AAV's te kunnen titeren. Breng een druppel van 0,5% tropicamide en 2,5% fenylefrinehydrochloride bevattende oogdruppel vóór anesthesie aan om pupillen te verwijden.Verdoof muizen met isofluraan en verifieer de reflexen. Breng 0,3% tobramycine en 0,1% dexamethason steriele oogdruppel van de oogdruppel aan op elk oog vóór de injectieprocedure. Gebruik de chirurgische haak om het bovenste ooglid te stabiliseren.Trek iets naar achteren om het dorsale deel van het oog bloot te leggen. Plak de haak vast aan de band om op zijn plaats te houden. Verwijder conjunctiva met de gebogen irisschaar om de sclera van het oog bloot te leggen.Gebruik een verse en steriele insulinespuit van 30 G om de sclera te doorboren. Steek de naald van de microspuit door dezelfde punctie met behulp van een micromanipulator. Plaats de punt van de naald achter de lens in het midden van de oogschelp.Injecteer een micro liter AAV-oplossing langzaam in het glasvocht van het oog. Laat de naald een minuut op zijn plaats en trek de naald langzaam terug. Breng ontstekingsremmende en antibacteriële topische gelbehandeling met 0,3% tobramycine en 0,1% dexamethason aan op de oogschelp.Breng één druppel 0,5% tropicamide aan. En 2,5% fenylefrinehydrochloride bevattende oogdruppel vóór anesthesie om pupillen te verwijden. Breng carbamide twee milligram per gram topische gel aan op het oppervlak van de ogen.Pas de muisstandaard indien nodig aan om het muisoog te centreren. Voer fundus- en fluorescentiebeeldvorming uit op beide ogen om de TdTomato-expressie één week en twee weken na intravitreale injectie te volgen. Euthanaseer de dieren met behulp van kooldioxide-inhalatie vóór de procedure.Schuif de oogbol naar voren met behulp van een splittertang van 13,5 centimeter. Verwijder de lens samen met het overgebleven glasvocht. Knip de verbinding van de oogbol met de oogzenuw met een nauwkeurig gebogen tang en knijp zachtjes in het netvlies met dezelfde gebogen tang.Isoleer genomisch DNA met een gecommercialiseerde proteïnase K verteer film-gebaseerde weefsel genomische DNA kit. Verteer het netvlies bij 55 graden Celsius 200 G gedurende 30 minuten met proteïnase K.Lyse retina volledig en volg het protocol van de fabrikant. In deze protocollen hebben we intravitreale injectie fundus florescence imaging aangetoond, evenals retina- en genomische DNA-isolatie.Dit zijn zeer kritieke procedures voor het netvlies en door dit protocol te volgen, zou u in staat moeten zijn om de geproduceerde AAV's te injecteren en hun expressieprofiel op te volgen. En schep die transductie-efficiëntie door AAV-genomen in retinaal genomisch DNA te kwantificeren. Hier zie je de basistoepassing van digitale druppel PCR, waarbij je een absolute kwantificering kunt maken van het AAV-genoom dat transduceert in de retinale cellen.Verdun genomische DNA's uit geïnjecteerde netvliezen in 0,05% pluronische F 68-oplossing om een eindconcentratie van één nanogram per microliter voor elk monster te bereiken. Voer druppelgeneratie uit in een PCR-reactiemix van 20 microliter, inclusief één nanogram genomisch DNA 125 nanomol primers en 2x groenblijvende supermix. Laad de monstermix naar het middelste deel van de cartridge voor het genereren van druppels.Voeg daarna 70 microliter druppelgeneratie olie toe aan de onderste rij van de cartridge. Leg de pakking op de cartridge. Zorg ervoor dat er geen opening is tussen de pakking en de patroon.Plaats het vervolgens in de druppelgenerator. Neem voorzichtig ongeveer 40 microliter druppels die in de bovenste bel worden gegenereerd. Voeg druppeloplossing toe aan de semi-omrande 96-Well PCR-reactieplaat.Sluit de PCR-plaat af met een PCR-platensealer met behulp van aluminium afdichtfolie. Plaats de PCR-plaat in de 96-Well warmte afgedichte thermische cycler. Gebruik het ddPCR-protocol dat in het artikel wordt aangegeven.Plaats de PCR-plaat in de druppellezer om gegevens te analyseren. Na het bekijken van deze video zou u in staat moeten zijn om de basis digitale PCR-techniek uit te voeren. U kunt ook gebruikte cellen met kleine hoeveelheden materiaal gebruiken, wat ideaal is voor digitale PCR-techniek.U moet echter de hoeveelheid doel-DNA zorgvuldig aanpassen om de limiet van digitale druppel PCR niet te overschrijden. Hier is het stroomdiagram voor de experimentele procedure. We voerden kleinschalige AAV-productie uit, gevolgd door AAV-titering.Vervolgens voerden we intravitreale injectie uit. Daarna hebben we de fluorescerende intensiteit gekwantificeerd door fundusfluorescentiebeeldvorming. Vervolgens isoleerde de netvliezen van de muis en haalde genomisch DNA uit netvliezen voor ddPCR.Het titeren van AAV is ook van cruciaal belang om AAV-transductie correct te kunnen kwantificeren. ddPCR is afhankelijk van het genereren van druppels die de doel-AAV-genom hebben verdund. Representatieve ddPCR-resultaten tonen positieve en negatieve druppels voor het AVV-genoom.Positief boven de drempel en negatief is eronder. Na vermenigvuldiging met de verdunningsfactoren bleek de titer van AAV's 10 tot de 12 in genoomkopieën per milliliter te zijn. Om de efficiëntie van AAV-tranductie correct te kwantificeren, werden verschillende netvliezen geïnjecteerd.Geïnjecteerde dieren werden in beeld gebracht en de gemiddelde intensiteit van fluorescentie werd berekend. Op een tijdstip van twee weken werden de netvliezen geïsoleerd. En ddPCR werd uitgevoerd met behulp van WPRE en 18 S primers.Fluorescentie-intensiteit van AAV-geïnjecteerde netvliezen was gecorreleerd met AAV-genoomberekeningen, wat de kracht van de methodologie aantoont. Hier hebben we verschillende technieken getoond, waaronder kleinschalige AAV-voorbereiding intravitreale injectie.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Elektroporatie van de ontwikkelingslanden Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Beoordeling van de Vasculaire Regeneratie in het CZS met de muis Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamiek in Cone fotoreceptorcellen Axon Terminals van de Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Oogbeschadigingen en/of Kinematics gemeten door In Vitro stimulatie van de craniale zenuwen in de schildpad

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Een volumetrische methode voor de kwantificering van cerebrale Vasospasm in een lymfkliertest Model van subarachnoïdale bloeding

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

Twee peelingmethoden voor de isolatie van fotoreceptorcelcompartimenten in het netvlies van de muis voor eiwitanalyse

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

In vivo Vasculaire letseluitlezingen in het netvlies van muizen om de reproduceerbaarheid te bevorderen

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...