Name: digital droplet pcr method for the quantification of aav transduction efficiency in murine retina
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina at JoVE.com

Wir danken Oezkan Keles, Josephine Jüttner und Prof. Botond Roska, Institut für Molekulare und Klinische Ophthalmologie Basel, Complex Viruses Platform für ihre Hilfe und Unterstützung bei der AAV-Produktion. Wir möchten uns auch bei Prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, der University of Pennsylvania, für den AAV8/BP2-Stamm bedanken. Tierarbeiten werden in der Tieranlage der Technischen Universität Gebze durchgeführt. Dafür danken wir Leyla Dikmetas und Prof. Uygar Halis Tazebay für die technische Hilfe und Unterstützung bei der Tierhaltung. Wir danken auch Dr. Fatma Özdemir für ihre Anmerkungen zum Manuskript. Diese Arbeit wird durch TUBITAK, Fördernummern 118C226 und 121N275, und Sabanci University Integration Grant unterstützt.

Alle experimentellen Protokolle wurden von der Ethikkommission der Sabanci Universität akzeptiert und die Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung der "Association for Research in Vision and Ophthalmology" für die Verwendung von Tieren in der Forschung durchgeführt
1. Kleine AAV-Produktion12
<ol><li>Kultivieren Sie HEK293T-Zellen unter Verwendung von 15-cm-Platten in vollständigen 10 ml DMEM / 10% FBS bis zu 70-80% Konfluenz.</li>...

<ol>
	<li>Herrmann, A. K., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+dissection+of+AAV-host+interactions:+The+fast+and+the+curious.">High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).</li><li>Pillay, S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+determinants+of+adeno-associated+viral+vector+entry.">Host determinants of adeno-associated viral vector entry.</a> Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).</li><li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+AAV+tropism+in+the+nervous+system+with+natural+and+engineered+capsids.">Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids.</a> Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).</li><li>Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+structure+and+cell+interactions.">AAV capsid structure and cell interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).</li><li>Han, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+tropism+and+transduction+of+adeno-associated+virus+varies+by+serotype+and+route+of+delivery+(intravitreal,+subretinal,+or+suprachoroidal)+in+rats.">Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats.</a> Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).</li><li>Muraine, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+efficiency+of+adeno-associated+virus+serotypes+after+local+injection+in+mouse+and+human+skeletal+muscle.">Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle.</a> Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).</li><li>Cronin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+and+optogenetic+stimulation+of+retinal+bipolar+cells+by+a+synthetic+adeno-associated+virus+capsid+and+promoter.">Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).</li><li>Higashimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+woodchuck+hepatitis+virus+post-transcriptional+regulatory+element+reduces+readthrough+transcription+from+retroviral+vectors.">The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Albayrak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+quantification+of+proteins+and+mrna+in+single+mammalian+cells.">Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells.</a> Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR.">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Juttner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+and+glial+cell+types+with+synthetic+promoter+AAVs+in+mice,+non-human+primates+and+humans.">Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).</li><li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing.">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li><li>Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Hif1a+rescues+cone+degeneration+and+prevents+subretinal+neovascularization+in+a+model+of+chronic+hypoxia.">Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li><li>Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+tools+for+biological+image+analysis.">Open source tools for biological image analysis.</a> Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).</li><li>Parks, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ribosomal+RNA+alleles+are+conserved+and+exhibit+tissue-specific+expression.">Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression.</a> Science Advances. 4 (2), (2018).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>Maclachlan, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+safety+evaluation+of+AAV2-sFLT01-+a+gene+therapy+for+age-related+macular+degeneration.">Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration.</a> Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).</li><li>Stieger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intact+rAAV+particles+up+to+6+years+after+successful+gene+transfer+in+the+retina+of+dogs+and+primates.">Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates.</a> Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+gene+editing+prevents+deafness+in+a+model+of+dominant+progressive+hearing+loss.">Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss.</a> Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).</li><li>Cox, D. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+editing+with+CRISPR-Cas13.">RNA editing with CRISPR-Cas13.</a> Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).</li></ol>

In diesem Protokoll haben wir zwei AAV-Vektoren mit unterschiedlichen Kapsidproteinen generiert und diese dann entsprechend titeriert. Einer der wichtigsten Schritte dieses Protokolls besteht darin, ausreichende Mengen an AAVs zu erzeugen, die nach der Transduktion12,13eine nachweisbare Reporterexpression ergeben. 
Die Titerierung von AAVs ist auch ein wichtiger Faktor, um die Dosierung von AAV für intravitreale Injektionen anzupass...

Adeno-assoziierte Viren (AAVs) werden heute häufig für eine Vielzahl von retinalen Gentherapiestudien verwendet. AAVs bieten eine sichere und effiziente Art der Genabgabe mit weniger Immunogenität und weniger Genomintegrationen. Der AAV-Eintritt in die Zielzelle erfolgt durch Endozytose, die eine Bindung von Rezeptoren und Co-Rezeptoren auf der Zelloberfläche erfordert1,2. Daher hängt die Transduktionseffizienz von AAVs für verschiedene Zelltypen hauptsächlich vom Kapsid und seinen Wechselwirkungen mit den Wirtszellrezeptoren ab. AAVs haben Serotypen und jeder Serotyp kann unterschiedliche Zell- / Gewebetropismen und Transduktionseffizienzen aufweisen. Es gibt auch künstliche AAV-Serotypen und -Varianten, die durch chemische Modifikation des Viruskapsids, Produktion von Hybridkasiden, Peptidinsertion, Kapsidmuffling, gerichtete Evolution und rationale Mutagenese erzeugt werden3. Selbst geringfügige Veränderungen der Aminosäuresequenz oder der Kapsidstruktur können einen Einfluss auf Wechselwirkungen mit Wirtszellfaktoren haben und zu unterschiedlichen Tropismen führen4. Neben Kapsidvarianten können andere Faktoren wie der Injektionsweg und die Batch-to-Batch-Variation der AAV-Produktion die Transduktionseffizienz von AAVs in der neuronalen Netzhaut beeinflussen. Daher sind zuverlässige Methoden für den Vergleich von Transduktionsraten für verschiedene Varianten notwendig.
Die Mehrheit der Methoden zur Bestimmung der AAV-Transduktionseffizienz beruht auf der Expression des Reportergens. Dazu gehören fluoreszierende Bildgebung, Immunhistochemie, Western Blot oder histochemische Analyse des Reportergenprodukts5,6,7. Aufgrund der Größenbeschränkung von AAVs ist es jedoch nicht immer möglich, Reportergene einzubeziehen, um die Transduktionseffizienz zu überwachen. Die Verwendung starker Promotoren wie dem hybriden CMV-Enhancer/Chicken Beta-Actin oder woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element (WPRE) als mRNA-Stabilisatorsequenz verkompliziert das Größenproblemweiter 8. Daher wird es auch von Vorteil sein, die Transduktionsrate von injizierten AAVs mit einer direkteren Methodik zu definieren.
Die digitale Tröpfchen-PCR (dd-PCR) ist eine leistungsstarke Technik zur Quantifizierung der Ziel-DNA aus winzigen Probenmengen. Die dd-PCR-Technologie hängt von der Verkapselung der Ziel-DNA und der PCR-Reaktionsmischung durch Öltröpfchen ab. Jede dd-PCR-Reaktion enthält Tausende von Tröpfchen. Jedes Tröpfchen wird als eigenständige PCR-Reaktion aufbereitet und analysiert9. Die Analyse von Tröpfchen ermöglicht die Berechnung der absoluten Kopienzahl von Ziel-DNA-Molekülen in jeder Probe mithilfe des Poisson-Algorithmus. Da die Transduktionseffizienz der AAVs mit der Kopienzahl von AAV-Genomen in der neuronalen Netzhaut korreliert, verwendeten wir die dd-PCR-Methode, um AAV-Genome zu quantifizieren.
Hier beschreiben wir eine dd-PCR-Methodik zur Berechnung der Transduktionseffizienz von AAV-Vektoren aus retinaler genomischer DNA6,10. Erstens wurden AAVs, die tdTomato-Reporter exprimieren, unter Verwendung des Small-Scale-Protokolls generiert und durch die dd-PCR-Methode11titeriert. Zweitens wurden AAVs intravitreal in die neuronale Netzhaut injiziert. Um die Transduktionseffizienz zu demonstrieren, haben wir zunächst die tdTomato-Expression mit Fluoreszenzmikroskopie und ImageJ-Software quantifiziert. Es folgte die Isolierung genomischer DNA zur Quantifizierung von AAV-Genomen in injizierten Netzhäuten mittels dd-PCR. Der Vergleich der tdTomato-Expressionsniveaus mit den transduzierten AAV-Genomen, die durch die dd-PCR quantifiziert wurden, zeigte, dass die dd-PCR-Methode die Transduktionseffizienz von AAV-Vektoren genau quantifizierte. Unsere Protokolle zeigten eine detaillierte Beschreibung einer dd-PCR-basierten Methodik zur Quantifizierung der AAV-Transduktionseffizienz. In diesem Protokoll zeigen wir auch die absolute Anzahl der AAV-Genome, die nach intravitrealen Injektionen transduziert werden, indem einfach der Verdünnungsfaktor nach der genomischen DNA-Isolierung und die dd-PCR-Ergebnisse verwendet werden. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine leistungsfähige Methode, die eine Alternative zur Reporterexpression wäre, um die Transduktionseffizienz von AAV-Vektoren in der Netzhaut zu quantifizieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-Well Semi-Skirted ddPCR plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6JRj mice strain</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>C57BL/6JRj</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 gaskets</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863009</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864008</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604Q</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>L 1825</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generation oil eva green</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864006</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>p30-3306</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil seals for PX1 PCR Plate sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>320933</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>ADEKA <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />LA&#199; SANAY<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" /> VE T<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />CARET A.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq01v2.jpg" />.</td>
			<td>N01AB06</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector MM33</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>82-42-101-0000</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Phoenix Research Labs</td>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>S01FB01</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil Syringe 10 &#956;l</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle RN G36, 25 mm, PST 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BL-2</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI-MAX</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pHGT1-Adeno1</td>
			<td>PlasmidFactory</td>
			<td>PF1236</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24040032</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864034</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864001</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPLITTER FORCEP WATCHER 
			MAKER - LENGTH = 13.5 CM</td>
			<td>endostall medical</td>
			<td>EJN-160-0155</td>
			<td>Retina isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril Syringe Filter</td>
			<td>AISIMO</td>
			<td>ASF33PS22S</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Genomic DNA Kit</td>
			<td>EcoSpin</td>
			<td>E1070</td>
			<td>gDNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>S01CA01</td>
			<td>anti-inflammatory / antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropamid (% 0.5 tropicamide)</td>
			<td>Bilim <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />la&#231; Sanayi ve Ticaret A.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq01v2.jpg" />.</td>
			<td>S01FA06</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbonuclease</td>
			<td>Accelagen</td>
			<td>N0103L</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscotears (carbomer 2 mg/g)</td>
			<td>Bausch+Lomb</td>
			<td>S01XA20</td>
			<td>lubricant eye drop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital droplet pcr method for the quantification of aav transduction efficiency in murine retina

Viele Labore für netzhautzellbiologie verwenden heute routinemäßig Adeno-assoziierte Viren (AAVs) für Gen-Editing und regulatorische Anwendungen. Die Effizienz der AAV-Transduktion ist in der Regel kritisch, was sich auf die gesamten experimentellen Ergebnisse auswirkt. Eine der Hauptdeterminanten für die Transduktionseffizienz ist der Serotyp oder die Variante des AAV-Vektors. Derzeit sind verschiedene künstliche AAV-Serotypen und -Varianten mit unterschiedlichen Affinitäten zu Wirtszelloberflächenrezeptoren verfügbar. Für die retinale Gentherapie führt dies zu unterschiedlichen Transduktionswirkungsgraden für verschiedene retinale Zelltypen. Darüber hinaus können der Injektionsweg und die Qualität der AAV-Produktion auch die retinale AAV-Transduktionseffizienz beeinflussen. Daher ist es wichtig, die Effizienz verschiedener Varianten, Chargen und Methoden zu vergleichen. Die digitale Tröpfchen-PCR-Methode (dd-PCR) quantifiziert die Nukleinsäuren mit hoher Präzision und ermöglicht die durchführung einer absoluten Quantifizierung eines bestimmten Ziels ohne Standard oder Referenz. Mit hilfe der dd-PCR ist es auch möglich, die Transduktionseffizienzen von AAVs durch absolute Quantifizierung der AAV-Genomkopienzahlen innerhalb einer injizierten Netzhaut zu bewerten. Hier stellen wir eine einfache Methode zur Quantifizierung der Transduktionsrate von AAVs in Netzhautzellen mittels dd-PCR zur Verfügung. Mit geringfügigen Modifikationen kann diese Methodik auch die Grundlage für die Kopienzahlquantifizierung der mitochondrialen DNA sowie für die Bewertung der Effizienz der Basenbearbeitung sein, die für mehrere Netzhauterkrankungen und Gentherapieanwendungen von entscheidender Bedeutung ist.

Die AAV-Produktion im kleinen Maßstab ist eine schnelle und effiziente Methode, die Vektoren für intravitreale Injektionen liefert (Abbildung 1). Die AAV-Produktion im kleinen Maßstab ergibt in der Regel Titer im Bereich von 1 x 1012 GC/ml, was ausreicht, um die Reporterexpression in der Netzhaut nachzuweisen (Abbildung 2). Die Titerierung von AAV mittels dd-PCR liefert konsistente Ergebnisse. ITR2- und WPRE-spezifische Primer werden routinemäßig...

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Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina

Dieses Protokoll zeigt, wie die AAV-Transduktionseffizienz in der Netzhaut der Maus mittels digitaler Tröpfchen-PCR (dd-PCR) in Verbindung mit AAV-Produktion im kleinen Maßstab, intravitrealer Injektion, retinaler Bildgebung und retinaler genomischer DNA-Isolierung quantifiziert werden kann.

Digitale Tropfen-PCR-Methode zur Quantifizierung der AAV-Transduktionseffizienz in der Murinen Netzhaut

Many retinal cell biology laboratories now routinely use Adeno-associated viruses (AAVs) for gene editing and regulatory applications. The efficiency of ...

In diesem Video zeigen wir, wie die AAV-Transduktion in der Netzhaut der Maus mit der digitalen Tröpfchen-PCR-Methode quantifiziert werden kann, die extrem empfindlich ist und eine absolute Quantifizierung der Ziel-DNA durchführt. Wir haben diese Methode hauptsächlich für große AVV-Konstrukte entwickelt, die es uns nicht erlauben, ein Reportergen wie CRISPR-basierte Konstrukte zu verwenden. Mit dieser Methode können wir einfach die Transduktionsrate von AAVs in der Netzhaut quantifizieren.Diese Methode beruht auf der Sensitivität und absoluten Quantifizierung der digitalen Tröpfchen-PCR und liefert einfache Ergebnisse. In diesem Video zeigen wir, wie die AAV-Transduktion in der Netzhaut der Maus mit der digitalen Tröpfchen-PCR-Methode quantifiziert werden kann, die extrem empfindlich ist und eine absolute Quantifizierung der Ziel-DNA durchführt. Wir haben diese Methode hauptsächlich für großflächige Konstrukte entwickelt, die es uns nicht erlauben, ein Reportergen wie CRISPR-basierte Konstrukte zu verwenden.Mit dieser Methode können wir einfach die Transduktionsrate von AAVs in der Netzhaut quantifizieren. Diese Methode beruht auf der Sensitivität und absoluten Quantifizierung der PCR mit zwei Tröpfchen und liefert einfache Ergebnisse. Aufgrund der Effizienz der digitalen Tröpfchen-PCR-Methodik wechseln bereits mehrere Labore von der quantitativen Real-Time-PCR zur digitalen Tröpfchen-PCR oder AAV-Titrierung.Diese Methode kann auch eine Grundlage für die mitochondriale DNA-Quantifizierung in der Netzhaut sowie die Überprüfung der Effizienz der CRISPR-basierten Mutationskorrektur für die Gentherapie in der Netzhaut der Maus liefern. Bereiten Sie eine Transfektionsmischung mit AAV-Hilfsplasmid, AAV-Kapsidplasmid, AAV-Vektor und PI-Lösung in fünf Millilitern vor. Die fünf Milliliter vorbereitete Transfektionsmischung in Nährmedien geben.Transfizierte Zellen bei 37 Grad Celsius inkubieren. Sammeln Sie das Medium 48 bis 60 Stunden nach der Transfektion. Das Medium mit DNAs in einer Endkonzentration von 250 Einheiten pro Milliliter für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius aufbereiten und bei 4.000 g vier Grad Celsius 30 Minuten lang zentrifugieren.Benetzen Sie die regenerierte Cellulosemembran mit PBS vor. Filtern Sie das Medium mit 0,22 Mikrometer Spritzenfilter in die vorbenetzte regenerierte Cellulosemembran für 100 Kilo Dalton. Die regenerierte Cellulosemembran bei 4.000 G vier Grad Celsius 30 Minuten lang zentrifugieren und das Medium entsorgen.Waschen und zentrifugieren Sie die regenerierte Cellulosemembran mit PBS, das 0,001% pluronic F68 enthält, dreimal bei 4000 G vier Grad Celsius für 30 Minuten. Sammeln Sie konzentrierte AAVs aus dem oberen Teil der regenerierten Cellulosemembran und verteilen Sie sie für die weitere Verwendung. Hier haben wir gezeigt, wie man eine kleinere AAV-Produktion herstellt.Nach der Überprüfung dieses Protokolls sollten Sie in der Lage sein, AVVs zu erstellen, die ausreichen, um den Reporterausdruck in der Netzhaut zu sehen. Sie können auch dem Protokoll für die digitale PCR folgen, um die produzierten AAVs titeren zu können. Tragen Sie vor der Narkose einen Tropfen 0,5% Tropicamid und 2,5% Phenylephrinhydrochlorid mit Augentropfen auf, um die Pupillen zu erweitern.Betäuben Sie Mäuse mit Isofluran und überprüfen Sie die Reflexe. Tragen Sie vor dem Injektionsvorgang 0,3% Tobramycin und 0,1% Dexamethason sterile ophthalmologische Lösung Augentropfen auf jedes Auge auf. Verwenden Sie den Operationshaken, um das obere Augenlid zu stabilisieren.Ziehen Sie sich leicht zurück, um den dorsalen Teil des Auges freizulegen. Kleben Sie den Haken an das Band, um ihn in Position zu halten. Entfernen Sie die Bindehaut mit der gebogenen Irisschere, um die Sklera des Auges freizulegen.Verwenden Sie eine frische und sterile 30G Insulinspritze, um die Sklera zu punktieren. Führen Sie die Nadel der Mikrospritze mit einem Mikromanipulator durch dieselbe Punktion. Platzieren Sie die Nadelspitze hinter der Linse in der Mitte der Augenmuschel.Injizieren Sie einen Mikroliter AAV-Lösung langsam in den Glaskörper des Auges. Lassen Sie die Nadel für eine Minute an Ort und Stelle und ziehen Sie die Nadel langsam zurück. Tragen Sie eine entzündungshemmende und antibakterielle topische Gelbehandlung mit 0,3% Tobramycin und 0,1% Dexamethason auf die Augenmuschel auf.Tragen Sie einen Tropfen 0,5% Tropicamid auf. Und 2,5% Phenylephrinhydrochlorid mit Augentropfen vor der Anästhesie, um die Pupillen zu erweitern. Tragen Sie Carbamid zwei Milligramm pro Gramm topisches Gel auf die Oberfläche der Augen auf.Stellen Sie den Mausständer nach Bedarf ein, um das Mausauge zu zentrieren. Führen Sie eine Fundus- und Fluoreszenzbildgebung an beiden Augen durch, um die TdTomato-Expression eine Woche und zwei Wochen nach der intravitrealen Injektion zu verfolgen. Euthanasie der Tiere durch Kohlendioxid-Inhalation vor dem Eingriff.Verschieben Sie den Augapfel mit Hilfe einer 13,5 Zentimeter großen Splitterzange nach vorne. Entfernen Sie die Linse zusammen mit dem übrig gebliebenen Glaskörper. Schneiden Sie die Verbindung des Augapfels zum Sehnerv mit einer präzise gekrümmten Pinzette ab und drücken Sie die Netzhaut vorsichtig mit der gleichen gekrümmten Pinzette zusammen.Isolieren Sie genomische DNA mit einem kommerzialisierten Proteinase-K-Digest-Film-basierten genomischen DNA-Kit für Gewebe. Verdauen Sie die Netzhaut bei 55 Grad Celsius 200 G für 30 Minuten mit Proteinase K.Lyse Netzhaut vollständig und folgen Sie dem Sprotocol des Herstellers. In diesen Protokollen haben wir eine intravitreale Injektion von Fundusblütenbildgebung sowie eine Netzhaut- und genomische DNA-Isolierung gezeigt.Dies sind sehr kritische Verfahren für die Netzhaut, und wenn Sie dieses Protokoll befolgen, sollten Sie in der Lage sein, die produzierten AAVs zu injizieren und ihr Expressionsprofil zu verfolgen. Und diese Transduktionseffizienz durch die Quantifizierung von AAV-Genomen in retinaler genomischer DNA. Hier können Sie die grundlegende Anwendung der digitalen Tröpfchen-PCR sehen, bei der Sie eine absolute Quantifizierung des AAV-Genoms vornehmen können, das in den Netzhautzellen transduziert.Verdünnung genomischer DNAs aus injizierter Netzhaut in 0,05% pluronischer F 68-Lösung, um eine Endkonzentration von einem Nanogramm pro Mikroliter für jede Probe zu erreichen. Führen Sie Tröpfchengenerierung in einer 20 Mikroliter PCR-Reaktionsmischung durch, einschließlich eines Nanogramms genomischer DNA 125 Nanomolar-Primer und 2X immergrüner Supermischung. Laden Sie die Probenmischung zur Tröpfchenerzeugung in den mittleren Teil der Kartusche.Anschließend werden 70 Mikroliter Tröpfchenerzeugungsöl in die untere Reihe der Kartusche gegeben. Setzen Sie die Dichtung auf die Patrone. Stellen Sie sicher, dass kein Spalt zwischen der Dichtung und der Kartusche besteht.Legen Sie es dann in den Tröpfchengenerator. Nehmen Sie vorsichtig etwa 40 Mikroliter Tröpfchen, die in der oberen Glocke erzeugt werden. Geben Sie die Tröpfchenlösung in die halbseitige 96-Well-PCR-Reaktionsplatte.Versiegeln Sie die PCR-Platte mit einem PCR-Plattenversiegeler unter Verwendung von Aluminium-Dichtfolie. Legen Sie die PCR-Platte in den 96-Well heißversiegelten Thermocycler. Verwenden Sie das im Artikel angegebene ddPCR-Protokoll.Legen Sie die PCR-Platte in den Tröpfchenleser, um die Daten zu analysieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, grundlegende digitale PCR-Techniken durchzuführen. Sie können auch beanspruchte Zellen mit geringen Materialmengen verwenden, was ideal für die digitale PCR-Technik ist.Sie sollten jedoch die Ziel-DNA-Menge sorgfältig anpassen, um die Grenze der digitalen Tröpfchen-PCR nicht zu überschreiten. Hier ist das Flussdiagramm für das experimentelle Verfahren. Wir führten eine AAV-Produktion im kleinen Maßstab durch, gefolgt von der AAV-Titerierung.Dann führten wir eine intravitreale Injektion durch. Anschließend quantifizierten wir die Fluoreszenzintensität durch Fundusfluoreszenzbildgebung. Dann isolierte sich die Netzhaut der Maus und extrahierte genomische DNA aus der Netzhaut für ddPCR.Die Titerierung von AAV ist auch entscheidend, um die AAV-Transduktion korrekt quantifizieren zu können. ddPCR hängt von der Erzeugung von Tröpfchen ab, die das Ziel-AAV-Genom verdünnt haben. Repräsentative ddPCR-Ergebnisse zeigen positive und negative Tröpfchen für das AVV-Genom.Positiv über dem Schwellenwert und negativ ist darunter. Nach der Multiplikation mit den Verdünnungsfaktoren wurde festgestellt, dass der Titer der AAVs 10 zu den 12 in Genomkopien pro Milliliter betrug. Um die AAV-Tranduktionseffizienz korrekt zu quantifizieren, wurden mehrere Netzhäute injiziert.Injizierte Tiere wurden abgebildet und die mittlere Fluoreszenzintensität wurde berechnet. Nach zwei Wochen wurde die Netzhaut isoliert. Und ddPCR wurde mit WPRE und 18 S Primern durchgeführt.Die Fluoreszenzintensität der injizierten AAV-Netzhaut korrelierte mit AAV-Genomberechnungen, was die Leistungsfähigkeit der Methodik zeigt. Hier haben wir verschiedene Techniken gezeigt, einschließlich der intravitrealen Injektion der AAV-Vorbereitung im kleinen Maßstab.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Forschung

Neurowissenschaften

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Beurteilung der Gefäß Regeneration im ZNS Verwenden der Maus Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Okuläre Kinematik gemessen durch In-vitro- Stimulation der Hirnnerven in die Schildkröte

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Eine Volumetrische Methode zur Quantifizierung der zerebralen Vasospasmus in einem Mausmodell der Subarachnoidalblutung

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

Zwei Peeling-Methoden zur Isolierung von Photorezeptor-Zellkompartimenten in der Netzhaut der Maus zur Proteinanalyse

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Im lebenden Organismus Gefäßverletzungsanzeigen in der Netzhaut der Maus zur Förderung der Reproduzierbarkeit

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...