Name: digital droplet pcr method for the quantification of aav transduction efficiency in murine retina
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina at JoVE.com

Vi vil takke Oezkan Keles, Josephine Jüttner og prof. Botond Roska, Institute of Molecular and Clinical Ophthalmology Basel, Complex Viruses Platform for deres hjelp og støtte til AAV-produksjon. Vi vil også takke professor Jean Bennett, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania for AAV8/BP2-stammen. Dyrearbeid utføres ved Gebze Technical University dyreanlegg. For det takker vi Leyla Dikmetas og prof. Uygar Halis Tazebay for teknisk assistanse og støtte til husdyrhold. Vi vil også takke Dr. Fatma Ozdemir for hennes kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet støttes av TUBITAK, tilskuddsnummer 118C226 og 121N275, og Sabanci University Integration grant.

Alle eksperimentelle protokoller ble akseptert av Sabanci University etikkkomité og eksperimenter ble utført i samsvar med uttalelsen fra 'The Association for Research in Vision and Ophthalmology' for bruk av dyr i forskning.
1. Liten AAV-produksjon12
<ol><li>Kultur HEK293T celler ved hjelp av 15 cm plater i fullstendig 10 ml DMEM / 10% FBS til 70-80% samløp.</li>
	<li>Forbered transfeksjonsblandingen med 20 μg hjelperplasmid (pHGT1-Adeno1), 7 μg...

<ol>
	<li>Herrmann, A. K., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+dissection+of+AAV-host+interactions:+The+fast+and+the+curious.">High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).</li><li>Pillay, S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+determinants+of+adeno-associated+viral+vector+entry.">Host determinants of adeno-associated viral vector entry.</a> Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).</li><li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+AAV+tropism+in+the+nervous+system+with+natural+and+engineered+capsids.">Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids.</a> Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).</li><li>Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+structure+and+cell+interactions.">AAV capsid structure and cell interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).</li><li>Han, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+tropism+and+transduction+of+adeno-associated+virus+varies+by+serotype+and+route+of+delivery+(intravitreal,+subretinal,+or+suprachoroidal)+in+rats.">Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats.</a> Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).</li><li>Muraine, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+efficiency+of+adeno-associated+virus+serotypes+after+local+injection+in+mouse+and+human+skeletal+muscle.">Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle.</a> Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).</li><li>Cronin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+and+optogenetic+stimulation+of+retinal+bipolar+cells+by+a+synthetic+adeno-associated+virus+capsid+and+promoter.">Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).</li><li>Higashimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+woodchuck+hepatitis+virus+post-transcriptional+regulatory+element+reduces+readthrough+transcription+from+retroviral+vectors.">The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Albayrak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+quantification+of+proteins+and+mrna+in+single+mammalian+cells.">Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells.</a> Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR.">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Juttner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+and+glial+cell+types+with+synthetic+promoter+AAVs+in+mice,+non-human+primates+and+humans.">Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).</li><li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing.">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li><li>Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Hif1a+rescues+cone+degeneration+and+prevents+subretinal+neovascularization+in+a+model+of+chronic+hypoxia.">Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li><li>Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+tools+for+biological+image+analysis.">Open source tools for biological image analysis.</a> Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).</li><li>Parks, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ribosomal+RNA+alleles+are+conserved+and+exhibit+tissue-specific+expression.">Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression.</a> Science Advances. 4 (2), (2018).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>Maclachlan, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+safety+evaluation+of+AAV2-sFLT01-+a+gene+therapy+for+age-related+macular+degeneration.">Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration.</a> Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).</li><li>Stieger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intact+rAAV+particles+up+to+6+years+after+successful+gene+transfer+in+the+retina+of+dogs+and+primates.">Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates.</a> Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+gene+editing+prevents+deafness+in+a+model+of+dominant+progressive+hearing+loss.">Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss.</a> Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).</li><li>Cox, D. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+editing+with+CRISPR-Cas13.">RNA editing with CRISPR-Cas13.</a> Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).</li></ol>

I denne protokollen genererte vi to AAV-vektorer som har forskjellige kapsidproteiner og deretter titered dem deretter. Et av de viktigste trinnene i denne protokollen er å produsere tilstrekkelige mengder AAVer som vil gi detekterbart reporteruttrykk etter transduksjonen12,13. 
Titering av AAVs er også en viktig faktor for å justere doser av AAV for intravitreale injeksjoner. Når disse viktige kriteriene er oppnådd, er det muli...

Adeno assosierte virus (AAVs) brukes nå ofte til en rekke retinal genterapistudier. AAVer gir en sikker og effektiv måte å levere gen på med mindre immunogenisitet og færre genomintegrasjoner. AAV-oppføring i målcellen skjer gjennom endokytose, som krever binding av reseptorer og koreseptorer på celleoverflaten1,2. Derfor avhenger transduksjonseffektiviteten til AAVer for forskjellige celletyper hovedsakelig av capsid og dens interaksjoner med vertscellereseptorene. AAVer har serotyper og hver serotype kan ha distinkte cellulære / vevtropismer og transduksjonseffektivitet. Det er også kunstige AAV-serotyper og varianter generert av kjemisk modifikasjon av viruskapsiden, produksjon av hybridkapsider, peptidinnsetting, kapsidstokking, rettet evolusjon og rasjonell mutagenese3. Selv mindre endringer i aminosyresekvens eller kapsidstruktur kan ha innflytelse på interaksjoner med vertscellefaktorer og resultere i forskjellige tropismer4. I tillegg til capsid-varianter kan andre faktorer som injeksjonsrute og batch-til-batch-variasjon av AAV-produksjon påvirke transduksjonseffektiviteten til AAVer i nevronal netthinnen. Derfor er pålitelige metoder for sammenligning av transduksjonshastigheter for forskjellige varianter nødvendig.
De fleste metodene for å bestemme AAV-transduksjonseffektivitet er avhengige av reportergenuttrykk. Disse inkluderer fluorescerende avbildning, immunhiistokjemi, vestlig blot eller histokjemisk analyse av reportergenproduktet5,6,7. På grunn av størrelsesbegrensningen til AAVer er det imidlertid ikke alltid mulig å inkludere reportergener for å overvåke transduksjonseffektiviteten. Bruk av sterke promotorer som hybrid CMV enhancer / kylling beta-actin eller Woodchuck hepatitt posttranskripsjonelt regulatorisk element (WPRE) som en mRNA-stabilisatorsekvens kompliserer ytterligere størrelsesproblemet8. Derfor vil det også være gunstig å definere transduksjonshastigheten til injiserte AAVer med en mer direkte metodikk.
Digital droplet PCR (dd-PCR) er en kraftig teknikk for å kvantifisere mål-DNA fra små mengder prøver. dd-PCR-teknologi avhenger av innkapsling av målet DNA og PCR reaksjon blanding av oljedråper. Hver dd-PCR-reaksjon inneholder tusenvis av dråper. Hver dråpe behandles og analyseres som en uavhengig PCR-reaksjon9. Analyse av dråper gjør det mulig å beregne absolutt kopi antall mål-DNA-molekyler i en hvilken som helst prøve ved å bruke Poisson-algoritmen. Siden transduksjonseffektiviteten til AAVene er korrelert med kopinummeret til AAV-genomer i nevronal netthinnen, brukte vi dd-PCR-metoden for å kvantifisere AAV-genomer.
Her beskriver vi en dd-PCR-metodikk for å beregne transduksjonseffektiviteten til AAV-vektorer fra retinal genomisk DNA6,10. Først ble AAVer som uttrykker tdTomato reporter generert ved hjelp av den lille skalaprotokollen, og titered av dd-PCR-metoden11. For det andre ble AAVs intravitrealt injisert i nevronal netthinnen. For å demonstrere transduksjonseffektiviteten kvantifiserte vi først tdTomato-uttrykket ved hjelp av fluorescerende mikroskopi og ImageJ-programvare. Dette ble etterfulgt av isolering av genomisk DNA for kvantifisering av AAV-genomer injisert netthinner ved hjelp av dd-PCR. Sammenligning av tdTomato-uttrykksnivåer med de transinduserte AAV-genomene kvantifisert av dd-PCR viste at dd-PCR-metoden nøyaktig kvantifiserte transduksjonseffektiviteten til AAV-vektorer. Våre protokoller viste en detaljert beskrivelse av en dd-PCR-basert metodikk for å kvantifisere AAV-transduksjonseffektivitet. I denne protokollen viser vi også det absolutte antallet AAV-genomer som transduseres etter intravitreale injeksjoner ved ganske enkelt å bruke fortynningsfaktoren etter genomisk DNA-isolasjon og dd-PCR-resultatene. Totalt sett gir denne protokollen en kraftig metode, som ville være et alternativ til reporteruttrykk for å kvantifisere transduksjonseffektivitet av AAV-vektorer i netthinnen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-Well Semi-Skirted ddPCR plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6JRj mice strain</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>C57BL/6JRj</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 gaskets</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863009</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864008</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604Q</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>L 1825</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generation oil eva green</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864006</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>p30-3306</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil seals for PX1 PCR Plate sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>320933</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>ADEKA <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />LA&#199; SANAY<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" /> VE T<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />CARET A.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq01v2.jpg" />.</td>
			<td>N01AB06</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector MM33</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>82-42-101-0000</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Phoenix Research Labs</td>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>S01FB01</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil Syringe 10 &#956;l</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle RN G36, 25 mm, PST 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BL-2</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI-MAX</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pHGT1-Adeno1</td>
			<td>PlasmidFactory</td>
			<td>PF1236</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24040032</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864034</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864001</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPLITTER FORCEP WATCHER 
			MAKER - LENGTH = 13.5 CM</td>
			<td>endostall medical</td>
			<td>EJN-160-0155</td>
			<td>Retina isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril Syringe Filter</td>
			<td>AISIMO</td>
			<td>ASF33PS22S</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Genomic DNA Kit</td>
			<td>EcoSpin</td>
			<td>E1070</td>
			<td>gDNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>S01CA01</td>
			<td>anti-inflammatory / antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropamid (% 0.5 tropicamide)</td>
			<td>Bilim <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />la&#231; Sanayi ve Ticaret A.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq01v2.jpg" />.</td>
			<td>S01FA06</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbonuclease</td>
			<td>Accelagen</td>
			<td>N0103L</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscotears (carbomer 2 mg/g)</td>
			<td>Bausch+Lomb</td>
			<td>S01XA20</td>
			<td>lubricant eye drop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital droplet pcr method for the quantification of aav transduction efficiency in murine retina

Mange retinal cellebiologiske laboratorier bruker nå rutinemessig Adeno-tilknyttede virus (AAVs) for genredigering og regulatoriske applikasjoner. Effektiviteten til AAV-transduksjon er vanligvis kritisk, noe som påvirker de generelle eksperimentelle resultatene. En av de viktigste determinantene for transduksjonseffektivitet er serotypen eller varianten av AAV-vektoren. For tiden er ulike kunstige AAV-serotyper og varianter tilgjengelige med forskjellige affiniteter for å være vert for celleoverflatereseptorer. For retinal genterapi resulterer dette i varierende grad av transduksjonseffektivitet for forskjellige netthinnecelletyper. I tillegg kan injeksjonsruten og kvaliteten på AAV-produksjonen også påvirke retinal AAV-transduksjonseffektiviteten. Derfor er det viktig å sammenligne effektiviteten til forskjellige varianter, partier og metoder. Den digitale dråpe-PCR-metoden (dd-PCR) kvantifiserer nukleinsyrene med høy presisjon og gjør det mulig å utføre absolutt kvantifisering av et gitt mål uten standard eller referanse. Ved hjelp av dd-PCR er det også mulig å vurdere transduksjonseffektiviteten til AAVer ved absolutt kvantifisering av AAV-genomkopinumre i en injisert netthinne. Her tilbyr vi en enkel metode for å kvantifisere transduksjonshastigheten til AAVer i retinalceller ved hjelp av dd-PCR. Med mindre modifikasjoner kan denne metodikken også være grunnlaget for kopieringsnummer kvantifisering av mitokondrie-DNA samt vurdere effektiviteten av baseredigering, kritisk for flere netthinnesykdommer og genterapiapplikasjoner.

AAV-produksjon i liten skala er en rask og effektiv metode som gir vektorer for intravitreale injeksjoner (figur 1). Litenskala AAV-produksjon gir vanligvis titere innenfor området 1 x 1012 GC/ml som er tilstrekkelig til å oppdage reporteruttrykk i netthinnen (figur 2). Titering av AAV ved bruk av dd-PCR gir konsistente resultater. ITR2- og WPRE-spesifikke primere brukes rutinemessig, og startkonsentrasjonen av hvert målmolekyl ble beregnet med dd-...

Watch this Scientific Journal Video about Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina at JoVE.com

Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina

Denne protokollen presenterer hvordan du kvantifiserer AAV-transduksjonseffektivitet i musenett ved hjelp av digital dråpe PCR (dd-PCR) sammen med liten AAV-produksjon, intravitreal injeksjon, retinal avbildning og retinal genomisk DNA-isolasjon.

Digital Droplet PCR-metode for kvantifisering av AAV-transduksjonseffektivitet i Murine Retina

Many retinal cell biology laboratories now routinely use Adeno-associated viruses (AAVs) for gene editing and regulatory applications. The efficiency of ...

I denne videoen vil vi vise hvordan du kvantifiserer AAV-transduksjon i mus netthinnen ved hjelp av digital dråpe PCR-metode, som er ekstremt følsom og gjør absolutt kvantifisering av målet DNA. Vi har utviklet denne metoden hovedsakelig for store AVV-konstruksjoner som ikke tillater oss å bruke et reportergen som CRISPR-baserte konstruksjoner. Ved å bruke denne metoden kan vi ganske enkelt kvantifisere transduksjonshastigheten til AAVer i netthinnen.Denne metoden er avhengig av følsomhet og absolutt kvantifisering av den digitale dråpe-PCR og gir resultater rett frem. I denne videoen vil vi vise hvordan du kvantifiserer AAV-transduksjon i mus netthinnen ved hjelp av digital dråpe PCR-metode, som er ekstremt følsom og gjør absolutt kvantifisering av målet DNA. Vi har utviklet denne metoden hovedsakelig for store områdekonstruksjoner som ikke tillater oss å bruke et reportergen som CRISPR-baserte konstruksjoner.Ved å bruke denne metoden kan vi ganske enkelt kvantifisere transduksjonshastigheten til AAVer i netthinnen. Denne metoden er avhengig av følsomhet og absolutt kvantifisering av de to dråpe-PCR og gir resultater rett frem. På grunn av effektiviteten til PCR-metodikken for digitale dråper, bytter flere laboratorier allerede fra kvantitativ PCR i sanntid til digital dråpe-PCR eller AAV-titrering.Denne metoden kan også gi grunnlag for mitokondrie DNA-kvantifisering i netthinnen, samt sjekke effektiviteten til CRISPR-basert mutasjonskorreksjon for genterapi i mus netthinnen. Forbered transfeksjonsblanding med AAV-hjelperplasmid, AAV-kapsid plasmid, AAV-vektor og PI-løsning i fem milliliters etterspørsel. Tilsett de fem milliliter tilberedt transfeksjonsblanding i kulturmedier.Inkuber transfekterte celler ved 37 grader celsius. Samle mediet på 48 til 60 timer etter transfeksjon. Fordøye media med DNAer ved en endelig konsentrasjon på 250 enheter per milliliter i 30 minutter ved 37 grader Celsius og en sentrifuger den ved 4000 g fire grader Celsius i 30 minutter.For-våt den regenererte cellulosemembranen med PBS. Filtrer mediet med 0,22 mikrometer sprøytefilter inn i den for-fuktede regenererte cellulosemembranen for 100 kilo Daltons. Sentrifuger den regenererte cellulosemembranen ved 4000 G fire grader Celsius i 30 minutter og kast mediet.Vask og sentrifuger den regenererte cellulosemembranen med PBS som inneholder 0,001% pluronic F68 tre ganger ved 4000 G fire grader Celsius i 30 minutter. Samle konsentrertE AAVer fra den øverste delen av den regenererte cellulosemembranen og alloker for videre bruk. Her viste vi hvordan man lager en mindre AAV-produksjon.Etter å ha undersøkt denne protokollen, bør du kunne lage AVVs som er tilstrekkelig til å se reporteruttrykket i netthinnen. Du kan også følge protokollen for digital PCR for å kunne titere de produsere AAVene. Påfør en dråpe 0,5% tropicamid og 2,5% fenylefrinhydroklorid som inneholder øyedråpe før anestesi for å utvide elevene.Bedøv mus med isofluran og verifiser refleksene. Påfør 0,3% tobramycin og 0,1% deksametason steril oftalmisk løsning øyedråpe til hvert øye før injeksjonsprosedyren. Bruk den kirurgiske kroken til å stabilisere øvre øyelokk.Trekk litt tilbake for å eksponere den dorsale delen av øyet. Teip kroken til båndet for å holde den på plass. Fjern konjunktiver med den buede iris saksen for å eksponere øyets sclera.Bruk en frisk og steril 30G insulinsprøyte for å punktere scleraen. Sett nålen på mikrosprøyten gjennom den samme punkteringen ved hjelp av mikromanipulator. Plasser spissen av nålen bak linsen midt i øyekoppen.Injiser en mikro liter AAV-løsning sakte inn i øyets glasslegeme. La nålen stå på plass i ett minutt og trekk kanylen langsomt tilbake. Påfør antiinflammatorisk og antibakteriell lokal gelbehandling som inneholder 0,3% tobramycin og 0,1% deksametason til øyekopp.Påfør en avlevering 0,5% tropicamid. Og 2,5% fenylefrinhydroklorid som inneholder øyedråpe før anestesi for å utvide elevene. Påfør karbamid to milligram per gram aktuell gel på overflaten av øynene.Juster musestativet etter behov for å midtstille museøyet. Utfør fundus og fluorescensavbildning på begge øynene for å følge TdTomato-uttrykket en uke og to uker etter intravitreal injeksjon. Avlivet dyrene ved hjelp av karbondioksidinnånding før prosedyren.Skift øyekulen fremover ved hjelp av en 13,5 centimeter splitter tang. Fjern linsen sammen med den resterende glasslegemet. Klipp tilkoblingen av øyebollet til synsnerven med en presisjonsbuede tang og klem forsiktig netthinnen med de samme buede tangene.Isoler genomisk DNA med et kommersialisert proteinase K fordøye filmbasert vev genomisk DNA-sett. Fordøye netthinnen ved 55 grader Celsius 200 G i 30 minutter med proteinase K.Lyse netthinne helt og følg produsentensprotocol. I disse protokollene har vi vist intravitreal injeksjon fundus florescence imaging, samt netthinne og genomisk DNA-isolasjon.Dette er svært kritiske prosedyrer for netthinne, og ved å følge denne protokollen, bør du kunne injisere de produserte AAVene og følge opp uttrykksprofilen deres. Og ladle som transduksjon effektivitet ved å kvantifisere AAV genomer i retinal genomisk DNA. Her kan du se den grunnleggende anvendelsen av digital dråpe PCR, hvor du kan lage en absolutt kvantifisering av AAV-genomet som transduserer i retinalcellene.Fortynn genomiske DNAer fra injiserte netthinner i 0,05% pluronic F 68-løsning for å nå en endelig konsentrasjon på ett nanogram per mikroliter for hver prøve. Utfør dråpegenerering i en 20 mikroliters PCR-reaksjonsblanding, inkludert ett nanogram genomisk DNA 125 nanomolars primere og 2X eviggrønn supermiks. Last prøveblandingen til den midterste delen av patronen for dråpegenerering.Deretter tilsetter du 70 mikroliter dråpegenereringsolje i den nederste raden med patron. Sett pakningen oppå patronen. Pass på at det ikke er noe mellomrom mellom pakningen og patronen.Plasser den deretter i dråpegeneratoren. Ta forsiktig ca. 40 mikroliter dråper som genereres i toppklokken. Tilsett dråpeoppløsning i halvskjørt 96-Brønn PCR reaksjonsplate.Forsegle PCR-platen med en PCR-plateforsegler ved hjelp av aluminiumsforseglingsfolie. Plasser PCR-platen i 96-brønns varmeforseglet termisk syklist. Bruk ddPCR-protokollen som er angitt i artikkelen.Plasser PCR-platen i dråpeleseren for å analysere data. Etter å ha sett denne videoen, bør du kunne utføre grunnleggende digital PCR-teknikk. Du kan også bruke utøvde celler med mindre mengder materiale, noe som er ideelt for digital PCR-teknikk.Du bør imidlertid nøye justere mål-DNA-beløpet for ikke å overskride grensen for digital dråpe PCR. Her er flytskjemaet for den eksperimentelle prosedyren. Vi utførte småskala AAV-produksjon, som etterfølges av AAV-titering.Deretter utførte vi intravitreal injeksjon. Etterpå kvantifiserte vi fluorescerende intensitet ved fundus fluorescensavbildning. Deretter isolerte musen netthinner og ekstrahert genomisk DNA fra netthinner for ddPCR.Titering av AAV er også avgjørende for å kunne kvantifisere AAV-transduksjon på riktig måte. ddPCR avhenger av generering av dråper som har fortynnet mål AAV genom. Representative ddPCR-resultater viser positive og negative dråper for AVV-genomet.Positiv over terskelen og negativ er under. Etter å ha multiplisert med fortynningsfaktorene, ble titer av AAVs funnet å være 10 til 12 i genomkopier per milliliter. For å kunne kvantifisere AAV-transduksjonseffektiviteten riktig, ble flere netthinner injisert.Injiserte dyr ble avbildet, og fluorescens gjennomsnittlig intensitet ble beregnet. Ved to ukers tid ble netthinner isolert. Og ddPCR ble utført ved hjelp av WPRE og 18 S primere.Fluorescensintensiteten til AAV-injiserte netthinner var korrelert med AAV-genomberegninger, som viste metodikkens kraft. Her har vi vist flere teknikker, inkludert småskala AAV-preparat intravitreal injeksjon.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Assessment of Vascular Regeneration i CNS Bruke musen Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventrikulær Viral Injeksjon av Neonatal Mouse Brain for Vedvarende og Utbredt Neuronal Transduksjon

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics i Cone fotoreseptor Axon terminaler Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Okulære kinematikk målt ved In Vitro stimulering av Hjernenerve i Turtle

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Volumetrisk metode for kvantifisering av Cerebral vasospasme i en Murine modell av Hjernehinneblødning

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupillary To-foton In vivo Avbildning av musens netthinne

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

To peeling metoder for isolering av photoreceptor celle rom i musen netthinnen for protein analyse

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

In vivo Vaskulær skade avlesninger i mus netthinnen for å fremme reproduserbarhet

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...