Name: digital droplet pcr method for the quantification of aav transduction efficiency in murine retina
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a Oezkan Keles, Josephine Jüttner y prof. Botond Roska, Instituto de Oftalmología Molecular y Clínica de Basilea, Complex Viruses Platform por su ayuda y apoyo para la producción de AAV. También nos gustaría agradecer al Prof. Jean Bennett, de la Escuela de Medicina Perelman de la Universidad de Pensilvania por la cepa AAV8 /BP2. El trabajo con animales se realiza en las instalaciones de animales de la Universidad Técnica de Gebze. Por eso, agradecemos a Leyla Dikmetas y al Prof. Uygar Halis Tazebay por la asistencia técnica y el apoyo para la cría de animales. Fatma Ozdemir por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo cuenta con el apoyo de TUBITAK, números de subvención 118C226 y 121N275, y la beca de integración de la Universidad de Sabanci.

Todos los protocolos experimentales fueron aceptados por el comité de ética de la Universidad de Sabanci y los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la declaración de 'La Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología' para el uso de animales en la investigación.
1. Producción de AAV a pequeña escala12
<ol><li>Cultivo de células HEK293T utilizando placas de 15 cm en 10 mL completos de DMEM/10% FBS hasta un 70-80% de conf...

<ol>
	<li>Herrmann, A. K., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+dissection+of+AAV-host+interactions:+The+fast+and+the+curious.">High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).</li><li>Pillay, S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+determinants+of+adeno-associated+viral+vector+entry.">Host determinants of adeno-associated viral vector entry.</a> Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).</li><li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+AAV+tropism+in+the+nervous+system+with+natural+and+engineered+capsids.">Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids.</a> Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).</li><li>Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+structure+and+cell+interactions.">AAV capsid structure and cell interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).</li><li>Han, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+tropism+and+transduction+of+adeno-associated+virus+varies+by+serotype+and+route+of+delivery+(intravitreal,+subretinal,+or+suprachoroidal)+in+rats.">Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats.</a> Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).</li><li>Muraine, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+efficiency+of+adeno-associated+virus+serotypes+after+local+injection+in+mouse+and+human+skeletal+muscle.">Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle.</a> Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).</li><li>Cronin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+and+optogenetic+stimulation+of+retinal+bipolar+cells+by+a+synthetic+adeno-associated+virus+capsid+and+promoter.">Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).</li><li>Higashimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+woodchuck+hepatitis+virus+post-transcriptional+regulatory+element+reduces+readthrough+transcription+from+retroviral+vectors.">The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Albayrak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+quantification+of+proteins+and+mrna+in+single+mammalian+cells.">Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells.</a> Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR.">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Juttner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+and+glial+cell+types+with+synthetic+promoter+AAVs+in+mice,+non-human+primates+and+humans.">Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).</li><li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing.">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li><li>Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Hif1a+rescues+cone+degeneration+and+prevents+subretinal+neovascularization+in+a+model+of+chronic+hypoxia.">Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li><li>Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+tools+for+biological+image+analysis.">Open source tools for biological image analysis.</a> Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).</li><li>Parks, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ribosomal+RNA+alleles+are+conserved+and+exhibit+tissue-specific+expression.">Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression.</a> Science Advances. 4 (2), (2018).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>Maclachlan, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+safety+evaluation+of+AAV2-sFLT01-+a+gene+therapy+for+age-related+macular+degeneration.">Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration.</a> Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).</li><li>Stieger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intact+rAAV+particles+up+to+6+years+after+successful+gene+transfer+in+the+retina+of+dogs+and+primates.">Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates.</a> Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+gene+editing+prevents+deafness+in+a+model+of+dominant+progressive+hearing+loss.">Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss.</a> Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).</li><li>Cox, D. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+editing+with+CRISPR-Cas13.">RNA editing with CRISPR-Cas13.</a> Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).</li></ol>

En este protocolo, generamos dos vectores AAV que tienen diferentes proteínas de cápside y luego los titulamos en consecuencia. Uno de los pasos más cruciales de este protocolo es producir cantidades suficientes de AAV que produzcan una expresión detectable del reportero después de la transducción12,13. 
La titulación de los AAV también es un factor importante para ajustar las dosis de AAV para las inyecciones intravítreas. ...

Los virus adeno asociados (AVA) ahora se usan comúnmente para una variedad de estudios de terapia génica retiniana. Los AAV proporcionan una forma segura y eficiente de administración de genes con menos inmunogenicidad y menos integraciones del genoma. La entrada de AAV en la célula diana se produce a través de la endocitosis, que requiere la unión de receptores y co-receptores en la superficie celular1,2. Por lo tanto, la eficiencia de transducción de los AV para diferentes tipos de células depende principalmente de la cápside y sus interacciones con los receptores de la célula huésped. Los AAV tienen serotipos y cada serotipo puede tener tropismos celulares / tisulares distintos y eficiencias de transducción. También existen serotipos y variantes artificiales de AAV generados por modificación química de la cápside del virus, producción de cápsides híbridas, inserción de péptidos, barajado de la cápside, evolución dirigida y mutagénesis racional3. Incluso cambios menores en la secuencia de aminoácidos o la estructura de la cápside pueden influir en las interacciones con los factores de la célula huésped y dar lugar a diferentes tropismos4. Además de las variantes de la cápside, otros factores como la ruta de inyección y la variación de lote a lote de la producción de AAV pueden afectar la eficiencia de transducción de los AV en la retina neuronal. Por lo tanto, se necesitan métodos fiables para la comparación de las tasas de transducción para diferentes variantes.
La mayoría de los métodos para determinar la eficiencia de la transducción AAV se basan en la expresión génica del informador. Estos incluyen imágenes fluorescentes, inmunohistoquímica, western blot o análisis histoquímico del producto del gen reportero5,6,7. Sin embargo, debido a la restricción de tamaño de los AAV, no siempre es factible incluir genes reporteros para monitorear la eficiencia de la transducción. El uso de promotores fuertes como el potenciador híbrido cmV / beta-actina de pollo o el elemento regulador post-transcripcional de la hepatitis de Woodchuck (WPRE) como una secuencia estabilizadora de ARNm complica aún más el problema de tamaño8. Por lo tanto, también será beneficioso definir la tasa de transducción de los AV inyectados con una metodología más directa.
La PCR digital de gotas (dd-PCR) es una técnica poderosa para cuantificar el ADN objetivo a partir de cantidades diminutas de muestras. La tecnología dd-PCR depende de la encapsulación de la mezcla de reacción de ADN y PCR objetivo mediante gotas de aceite. Cada reacción dd-PCR contiene miles de gotas. Cada gota se procesa y analiza como una reacción PCR independiente9. El análisis de gotas permite calcular el número de copia absoluta de moléculas de ADN objetivo en cualquier muestra simplemente utilizando el algoritmo de Poisson. Dado que la eficiencia de transducción de los AAV se correlaciona con el número de copias de los genomas de AAV en la retina neuronal, utilizamos el método dd-PCR para cuantificar los genomas de AAV.
Aquí, describimos una metodología de dd-PCR para calcular la eficiencia de transducción de vectores AAV a partir de ADN genómico retiniano6,10. En primer lugar, los AAV que expresan tdTomato reporter se generaron utilizando el protocolo a pequeña escala, y se titularon mediante el método dd-PCR11. En segundo lugar, los AV se inyectaron intravítreamente en la retina neuronal. Para demostrar la eficiencia de la transducción, primero cuantificamos la expresión de tdTomato utilizando microscopía fluorescente y software ImageJ. Esto fue seguido por el aislamiento del ADN genómico para la cuantificación de genomas AAV en retinas inyectadas mediante dd-PCR. La comparación de los niveles de expresión de tdTomato con los genomas de AAV transducidos cuantificados por la dd-PCR mostró que el método de dd-PCR cuantificó con precisión la eficiencia de transducción de los vectores AAV. Nuestros protocolos demostraron una descripción detallada de una metodología basada en dd-PCR para cuantificar las eficiencias de transducción AAV. En este protocolo, también mostramos el número absoluto de genomas AAV que se transducen después de las inyecciones intravítreas simplemente utilizando el factor de dilución después del aislamiento genómico del ADN y los resultados de dd-PCR. En general, este protocolo proporciona un método poderoso, que sería una alternativa a la expresión reportera para cuantificar las eficiencias de transducción de los vectores AAV en la retina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-Well Semi-Skirted ddPCR plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6JRj mice strain</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>C57BL/6JRj</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 gaskets</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863009</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864008</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604Q</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>L 1825</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generation oil eva green</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864006</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>p30-3306</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil seals for PX1 PCR Plate sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>320933</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>ADEKA <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />LA&#199; SANAY<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" /> VE T<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />CARET A.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq01v2.jpg" />.</td>
			<td>N01AB06</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector MM33</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>82-42-101-0000</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Phoenix Research Labs</td>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>S01FB01</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil Syringe 10 &#956;l</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle RN G36, 25 mm, PST 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BL-2</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI-MAX</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pHGT1-Adeno1</td>
			<td>PlasmidFactory</td>
			<td>PF1236</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24040032</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864034</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864001</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPLITTER FORCEP WATCHER 
			MAKER - LENGTH = 13.5 CM</td>
			<td>endostall medical</td>
			<td>EJN-160-0155</td>
			<td>Retina isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril Syringe Filter</td>
			<td>AISIMO</td>
			<td>ASF33PS22S</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Genomic DNA Kit</td>
			<td>EcoSpin</td>
			<td>E1070</td>
			<td>gDNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>S01CA01</td>
			<td>anti-inflammatory / antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropamid (% 0.5 tropicamide)</td>
			<td>Bilim <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />la&#231; Sanayi ve Ticaret A.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq01v2.jpg" />.</td>
			<td>S01FA06</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbonuclease</td>
			<td>Accelagen</td>
			<td>N0103L</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscotears (carbomer 2 mg/g)</td>
			<td>Bausch+Lomb</td>
			<td>S01XA20</td>
			<td>lubricant eye drop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital droplet pcr method for the quantification of aav transduction efficiency in murine retina

Muchos laboratorios de biología celular de la retina ahora usan rutinariamente virus adenoasociados (AAV) para la edición de genes y aplicaciones regulatorias. La eficiencia de la transducción AAV suele ser crítica, lo que afecta los resultados experimentales generales. Uno de los principales determinantes para la eficiencia de transducción es el serotipo o variante del vector AAV. Actualmente, varios serotipos y variantes artificiales de AAV están disponibles con diferentes afinidades con los receptores de la superficie de la célula huésped. Para la terapia génica retiniana, esto resulta en diversos grados de eficiencia de transducción para diferentes tipos de células retinianas. Además, la ruta de inyección y la calidad de la producción de AAV también pueden afectar la eficiencia de la transducción de AAV retiniana. Por lo tanto, es esencial comparar la eficiencia de diferentes variantes, lotes y metodologías. El método de PCR digital de gotas (dd-PCR) cuantifica los ácidos nucleicos con alta precisión y permite realizar la cuantificación absoluta de un objetivo determinado sin ningún estándar o referencia. Utilizando dd-PCR, también es factible evaluar las eficiencias de transducción de los AV mediante la cuantificación absoluta de los números de copias del genoma AAV dentro de una retina inyectada. Aquí, proporcionamos un método sencillo para cuantificar la tasa de transducción de AAV en células de la retina utilizando dd-PCR. Con modificaciones menores, esta metodología también puede ser la base para la cuantificación del número de copias del ADN mitocondrial, así como para evaluar la eficiencia de la edición de bases, crítica para varias enfermedades de la retina y aplicaciones de terapia génica.

La producción de AAV a pequeña escala es un método rápido y eficiente que proporciona vectores para inyecciones intravítreas(Figura 1). La producción de AAV a pequeña escala generalmente da títulos dentro del rango de 1 x 1012 GC / ml, que es suficiente para detectar la expresión del reportero en la retina (Figura 2). La titulación de AAV mediante dd-PCR da resultados consistentes. Los cebadores específicos ITR2 y WPRE se utilizan rutinaria...

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Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina

Este protocolo presenta cómo cuantificar la eficiencia de la transducción de AAV en la retina del ratón mediante PCR digital por gotas (dd-PCR) junto con la producción de AAV a pequeña escala, la inyección intravítrea, las imágenes de la retina y el aislamiento del ADN genómico de la retina.

Método de PCR de gotas digitales para la cuantificación de la eficiencia de la transducción AAV en la retina murina

Many retinal cell biology laboratories now routinely use Adeno-associated viruses (AAVs) for gene editing and regulatory applications. The efficiency of ...

En este vídeo, mostraremos cómo cuantificar la transducción de AAV en la retina del ratón utilizando el método de PCR de gotas digitales, que es extremadamente sensible y hace una cuantificación absoluta del ADN objetivo. Hemos desarrollado este método principalmente para grandes construcciones AVV que no nos permiten usar un gen reportero como las construcciones basadas en CRISPR. Mediante el uso de este método, podemos simplemente cuantificar la tasa de transducción de AAV en la retina.Este método se basa en la sensibilidad y la cuantificación absoluta de la PCR de gotas digitales y produce resultados directos. En este vídeo, mostraremos cómo cuantificar la transducción de AAV en la retina del ratón utilizando el método de PCR de gotas digitales, que es extremadamente sensible y hace una cuantificación absoluta del ADN objetivo. Hemos desarrollado este método principalmente para construcciones de área grande que no nos permite usar un gen reportero como las construcciones basadas en CRISPR.Mediante el uso de este método, podemos simplemente cuantificar la tasa de transducción de AAV en la retina. Este método se basa en la sensibilidad y la cuantificación absoluta de las dos gotas de PCR y produce resultados directos. Debido a la eficiencia de la metodología de PCR de gotas digitales, varios laboratorios ya cambian de PCR cuantitativa en tiempo real a PCR digital de gotas o titulación AAV.Este método también puede proporcionar una base para la cuantificación del ADN mitocondrial en la retina, así como para verificar la eficiencia de la corrección de mutaciones basada en CRISPR para la terapia génica en la retina del ratón. Prepare la mezcla de transfección con el plásmido auxiliar AAV, el plásmido de la cápside AAV, el vector AAV y la solución PI en cinco mililitros de demanda. Agregue la mezcla de transfección preparada de cinco mililitros en los medios de cultivo.Incubar células transfectadas a 37 grados centígrados. Recoger los medios de comunicación a las 48 a 60 horas después de la transfección. Digiera el medio con ADN a una concentración final de 250 unidades por mililitro durante 30 minutos a 37 grados centígrados y centríelo a 4.000 g cuatro grados centígrados durante 30 minutos.Mojar previamente la membrana de celulosa regenerada con PBS. Filtre el medio con un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros en la membrana de celulosa regenerada prehumedida para 100 kilos daltons. Centrifugar la membrana de celulosa regenerada a 4.000 G cuatro grados centígrados durante 30 minutos y desechar el medio.Lavar y centrifugar la membrana de celulosa regenerada con PBS que contiene 0.001% plurónico F68 tres veces a 4000 G cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Recoger los AAV concentrados de la parte superior de la membrana de celulosa regenerada y asignarlos para su uso posterior. Aquí mostramos cómo hacer una producción AAV a menor escala.Después de examinar este protocolo, debería poder hacer AVV que sean suficientes para ver la expresión del reportero en la retina. También puede seguir el protocolo de PCR digital para poder titular los AAV producidos. Aplique una gota de 0,5% de tropicamida y 2,5% de clorhidrato de fenilefrina que contenga gotas para los ojos antes de la anestesia para dilatar las pupilas.Anestesiar ratones con isoflurano y verificar los reflejos. Aplique gotas oftálmicas estériles de solución oftálmica al 0,3% y 0,1% de dexametasona en cada ojo antes del procedimiento de inyección. Use el gancho quirúrgico para estabilizar el párpado superior.Tire ligeramente hacia atrás para exponer la parte dorsal del ojo. Pega el gancho a la banda para mantenerlo en posición. Retire la conjuntiva con las tijeras de iris curvo para exponer la esclerótica del ojo.Use una jeringa de insulina 30G fresca y estéril para perforar la esclerótica. Inserte la aguja de la micro jeringa a través de la misma punción utilizando un micromanipulador. Coloque la punta de la aguja detrás de la lente en el centro de la copa del ojo.Inyecte un micro litro de solución AAV lentamente en el vítreo del ojo. Deje la aguja en su lugar durante un minuto y retire lentamente la aguja. Aplique un tratamiento de gel tópico antiinflamatorio y antibacteriano que contenga 0,3% de tobramicina y 0,1% dexametasona en la copa del ojo.Aplique una gota de 0.5% tropicamide. Y clorhidrato de fenilefrina al 2,5% que contiene colirio antes de la anestesia para dilatar las pupilas. Aplique carbamida dos miligramos por gramo de gel tópico sobre la superficie de los ojos.Ajuste el soporte del ratón según sea necesario para centrar el ojo del ratón. Realice imágenes de fondo de ojo y fluorescencia en ambos ojos para seguir la expresión de TdTomato una semana y dos semanas después de la inyección intravítrea. Eutanasia a los animales usando la inhalación de dióxido de carbono antes del procedimiento.Desplace el globo ocular hacia adelante con la ayuda de una pinza divisora de 13,5 centímetros. Retire la lente junto con el vítreo sobrante. Corte la conexión del globo ocular al nervio óptico con un fórceps curvo de precisión y apriete suavemente la retina con las mismas pinzas curvas.Aísle el ADN genómico con un kit de ADN genómico tisómico basado en película de digestión de proteinasa K comercializado. Digiera la retina a 55 grados Celsius 200 G durante 30 minutos con la proteinasa K.Lyse retina por completo y siga el protocolo del fabricante. En estos protocolos, hemos mostrado imágenes de florescencia del fondo de ojo de inyección intravítrea, así como aislamiento de retina y ADN genómico.Estos son procedimientos muy críticos para la retina, y al seguir este protocolo, debería poder inyectar los AV producidos y hacer un seguimiento de su perfil de expresión. Y cucharón esa eficiencia de transducción cuantificando los genomas de AAV en el ADN genómico de la retina. Aquí, puedes ver la aplicación básica de la PCR digital de gotas, donde puedes hacer una cuantificación absoluta del genoma AAV que transducen en las células de la retina.Diluir los ADN genómicos de las retinas inyectadas en solución F 68 al 0,05% plurónica para alcanzar una concentración final de un nanogramo por microlitro para cada muestra. Realice la generación de gotas en una mezcla de reacción de PCR de 20 microlitros, que incluye un nanogramo de ADN genómico 125 nanomolares y una súper mezcla de hoja perenne 2X. Cargue la mezcla de muestras en la parte media del cartucho para la generación de gotas.Luego agregue aceite de generación de gotas de 70 microlitros en la fila inferior del cartucho. Coloque la junta encima del cartucho. Asegúrese de que no haya espacio entre la junta y el cartucho.Luego colóquelo en el generador de gotas. Tome suavemente aproximadamente 40 microlitros de gotas que se generan en la campana superior. Agregue la solución de gotas a la placa de reacción de PCR semifaldada de 96 pocillos.Selle la placa de PCR con un sellador de placas de PCR utilizando papel de sellado de aluminio. Coloque la placa de PCR en el termociclador termosellado de 96 pocillos. Utilice el protocolo ddPCR indicado en el artículo.Coloque la placa de PCR en el lector de gotas para analizar los datos. Después de ver este video, debería poder realizar una técnica básica de PCR digital. También puede utilizar células ejercidas con pequeñas cantidades de material, lo que es ideal para la técnica de PCR digital.Sin embargo, debe ajustar cuidadosamente la cantidad de ADN objetivo para no exceder el límite de la PCR de gotas digitales. Aquí está el diagrama de flujo para el procedimiento experimental. Realizamos la producción de AAV a pequeña escala, que es seguida por la titulación de AAV.Luego se realizó la inyección intravítrea. Posteriormente, cuantificamos la intensidad fluorescente mediante imágenes de fluorescencia del fondo de ojo. Luego se aislaron las retinas de ratón y se extrajo ADN genómico de las retinas para ddPCR.El AAV de titulación también es fundamental para poder cuantificar correctamente la transducción de AAV. ddPCR depende de la generación de gotas que ha diluido el genom AAV objetivo. Los resultados representativos de ddPCR muestran gotas positivas y negativas para el genoma avV.Positivo por encima del umbral y negativo está por debajo. Después de multiplicarse con los factores de dilución, se encontró que el título de los AAV era de 10 a 12 en copias del genoma por mililitro. Para cuantificar correctamente la eficiencia de la transducción de AAV, se inyectaron varias retinas.Se tomaron imágenes de animales inyectados y se calculó la intensidad media de fluorescencia. A las dos semanas, se aislaron las retinas. Y la ddPCR se realizó utilizando cebadores WPRE y 18 S.La intensidad de fluorescencia de las retinas inyectadas con AAV se correlacionó con los cálculos del genoma de AAV, mostrando el poder de la metodología. Aquí, hemos mostrado varias técnicas, incluida la inyección intravítrea de preparación de AAV a pequeña escala.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

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En electroporación in vivo de la retina del ratón en desarrollo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Investigación

Neurociencias

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Evaluación de la Vascular regeneración en el SNC Utilizando la retina del ratón

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

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Imagen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dinámica de Terminales cono fotorreceptor axón de la retina del ratón

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Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

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Cinemática ocular midiendo In Vitro la estimulación de los nervios craneales en la tortuga

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A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Un método volumétrico para la cuantificación de vasoespasmo Cerebral en un modelo murino de hemorragia subaracnoidea

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

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Dos métodos de peeling para el aislamiento de compartimentos de células fotorreceptoras en la retina del ratón para el análisis de proteínas

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

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In vivo Lecturas de lesiones vasculares en la retina del ratón para promover la reproducibilidad

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...