Name: digital droplet pcr method for the quantification of aav transduction efficiency in murine retina
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina at JoVE.com

Vi vill tacka Oezkan Keles, Josephine Jüttner och prof. Botond Roska, Institute of Molecular and Clinical Ophthalmology Basel, Complex Viruses Platform för deras hjälp och stöd för AAV-produktion. Vi vill också tacka prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania för AAV8 / BP2-stammen. Djurarbete utförs på Gebze Technical University djuranläggning. För detta tackar vi Leyla Dikmetas och prof. Uygar Halis Tazebay för tekniskt stöd och stöd till djurhållning. Vi vill också tacka Dr. Fatma Ozdemir för hennes kommentarer om manuskriptet. Detta arbete stöds av TUBITAK, bidragsnummer 118C226 och 121N275 och Sabanci University Integration grant.

Alla experimentella protokoll accepterades av Sabanci-universitetets etiska kommitté och experiment utfördes i enlighet med uttalandet "The Association for Research in Vision and Ophthalmology" för användning av djur i forskning
1. Småskalig AAV-produktion12
<ol><li>Odla HEK293T-celler med 15 cm plattor i komplett 10 ml DMEM/10% FBS tills 70-80% sammanflöde.</li>
	<li>Förbered transfektblandningen med 20 μg hjälpplasmid (pHGT1-Adeno1), 7 μg ...

<ol>
	<li>Herrmann, A. K., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+dissection+of+AAV-host+interactions:+The+fast+and+the+curious.">High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).</li><li>Pillay, S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+determinants+of+adeno-associated+viral+vector+entry.">Host determinants of adeno-associated viral vector entry.</a> Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).</li><li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+AAV+tropism+in+the+nervous+system+with+natural+and+engineered+capsids.">Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids.</a> Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).</li><li>Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+structure+and+cell+interactions.">AAV capsid structure and cell interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).</li><li>Han, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+tropism+and+transduction+of+adeno-associated+virus+varies+by+serotype+and+route+of+delivery+(intravitreal,+subretinal,+or+suprachoroidal)+in+rats.">Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats.</a> Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).</li><li>Muraine, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+efficiency+of+adeno-associated+virus+serotypes+after+local+injection+in+mouse+and+human+skeletal+muscle.">Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle.</a> Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).</li><li>Cronin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+and+optogenetic+stimulation+of+retinal+bipolar+cells+by+a+synthetic+adeno-associated+virus+capsid+and+promoter.">Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).</li><li>Higashimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+woodchuck+hepatitis+virus+post-transcriptional+regulatory+element+reduces+readthrough+transcription+from+retroviral+vectors.">The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Albayrak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+quantification+of+proteins+and+mrna+in+single+mammalian+cells.">Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells.</a> Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR.">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Juttner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+and+glial+cell+types+with+synthetic+promoter+AAVs+in+mice,+non-human+primates+and+humans.">Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).</li><li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing.">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li><li>Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Hif1a+rescues+cone+degeneration+and+prevents+subretinal+neovascularization+in+a+model+of+chronic+hypoxia.">Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li><li>Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+tools+for+biological+image+analysis.">Open source tools for biological image analysis.</a> Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).</li><li>Parks, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ribosomal+RNA+alleles+are+conserved+and+exhibit+tissue-specific+expression.">Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression.</a> Science Advances. 4 (2), (2018).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>Maclachlan, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+safety+evaluation+of+AAV2-sFLT01-+a+gene+therapy+for+age-related+macular+degeneration.">Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration.</a> Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).</li><li>Stieger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intact+rAAV+particles+up+to+6+years+after+successful+gene+transfer+in+the+retina+of+dogs+and+primates.">Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates.</a> Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+gene+editing+prevents+deafness+in+a+model+of+dominant+progressive+hearing+loss.">Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss.</a> Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).</li><li>Cox, D. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+editing+with+CRISPR-Cas13.">RNA editing with CRISPR-Cas13.</a> Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).</li></ol>

I detta protokoll genererade vi två AAV-vektorer som har olika kapsidproteiner och sedan titered dem i enlighet därmed. Ett av de viktigaste stegen i detta protokoll är att producera tillräckliga mängder AAV som ger detekterbart reporteruttryck efter12,13. 
Titering av AAV är också en viktig faktor för att justera doser av AAV för intravitreala injektioner. När dessa viktiga kriterier har uppnåtts är det möjligt att kvan...

Adeno associerade virus (AAV) används nu ofta för en mängd olika retinal genterapi studier. AAV ger ett säkert och effektivt sätt att leverera gener med mindre immunogenicitet och färre genomintegrationer. AAV-inträde i målcellen sker genom endocytos, vilket kräver bindning av receptorer och co-receptorer på cellytan1,2. Därför beror flyttningseffektiviteten hos AAV för olika celltyper främst på kapsiden och dess interaktioner med värdcellreceptorerna. AAV har serotyper och varje serotyp kan ha distinkta cellulära/vävnad tropismer och transduktion effektivitet. Det finns också konstgjorda AAV serotyper och varianter som genereras av kemisk modifiering av viruskapsiden, produktion av hybridkapslar, peptidinsättning, capsidblandning, riktad evolution och rationell mutagenes3. Även mindre förändringar i aminosyrasekvensen eller kapsidstrukturen kan påverka interaktioner med värdcellsfaktorer och resultera i olika trombismer4. Förutom kapsidvarianter kan andra faktorer som injektionsväg och variation från parti till parti av AAV-produktion påverka flyttningseffektiviteten hos AAV i den neuronala näthinnan. Därför är det nödvändigt med tillförlitliga metoder för jämförelse av transduktionshastigheter för olika varianter.
Majoriteten av metoderna för att bestämma AAV-transduktion effektivitet förlitar sig på reporter gen uttryck. Dessa inkluderar fluorescerande avbildning, immunohistokemi, western blot eller histokemisk analys av reportergenprodukten5,6,7. På grund av storleksbegränsningen för AAV är det dock inte alltid möjligt att inkludera reportergener för att övervaka flyttningseffektiviteten. Att använda starka promotorer som hybrid CMV-förstärkare / kyckling beta-aktin eller Woodchuck hepatit post-transcriptional regulatoriska element (WPRE) som en mRNA stabilisatorsekvens komplicerar ytterligare storleksproblemet8. Därför kommer det också att vara fördelaktigt att definiera flyttningsfrekvensen för injicerade AAV med en mer direkt metod.
Digital droplet PCR (dd-PCR) är en kraftfull teknik för att kvantifiera mål-DNA från minimala mängder prover. dd-PCR-tekniken är beroende av inkapsling av mål-DNA- och PCR-reaktionsblandningen med oljedroppar. Varje dd-PCR-reaktion innehåller tusentals droppar. Varje droppe bearbetas och analyseras som en oberoende PCR-reaktion9. Analys av droppar gör det möjligt att beräkna det absoluta kopieringsnumret av mål-DNA-molekyler i något prov genom att helt enkelt använda Poisson-algoritmen. Eftersom flyttningseffektiviteten hos AAV är korrelerad med kopieringsnumret av AAV-genom i den neuronala näthinnan, använde vi dd-PCR-metoden för att kvantifiera AAV-genom.
Här beskriver vi en dd-PCR-metodik för att beräkna flyttningseffektiviteten hos AAV-vektorer från retinal genomiskt DNA6,10. Först genererades AAV som uttrycker tdTomato reporter med hjälp av det småskaliga protokollet och titered av dd-PCR-metoden11. För det andra injicerades AAV intravitreally i den neuronala näthinnan. För att demonstrera transduktionseffektiviteten kvantifierade vi först tdTomato-uttrycket med hjälp av fluorescerande mikroskopi och ImageJ-programvara. Detta följdes av isolering av genomiskt DNA för kvantifiering av AAV genom i injicerade näthinnor med dd-PCR. Jämförelse av tdTomato uttrycksnivåer med de transduced AAV genom kvantifieras av dd-PCR visade att dd-PCR metoden exakt kvantifierade givaren effektivitet av AAV vektorer. Våra protokoll visade en detaljerad beskrivning av en dd-PCR-baserad metodik för att kvantifiera AAV-transduktionseffektivitet. I detta protokoll visar vi också det absoluta antalet AAV-genom som transduced efter intravitreal injektioner genom att helt enkelt använda utspädningsfaktorn efter genomisk DNA-isolering och dd-PCR resultat. Sammantaget ger detta protokoll en kraftfull metod, vilket skulle vara ett alternativ till reporteruttryck för att kvantifiera transduktionseffektiviteten hos AAV-vektorer i näthinnan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-Well Semi-Skirted ddPCR plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6JRj mice strain</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>C57BL/6JRj</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 gaskets</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863009</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864008</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604Q</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>L 1825</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generation oil eva green</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864006</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>p30-3306</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil seals for PX1 PCR Plate sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>320933</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>ADEKA <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />LA&#199; SANAY<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" /> VE T<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />CARET A.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq01v2.jpg" />.</td>
			<td>N01AB06</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector MM33</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>82-42-101-0000</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Phoenix Research Labs</td>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>S01FB01</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil Syringe 10 &#956;l</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle RN G36, 25 mm, PST 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BL-2</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI-MAX</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pHGT1-Adeno1</td>
			<td>PlasmidFactory</td>
			<td>PF1236</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24040032</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864034</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864001</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPLITTER FORCEP WATCHER 
			MAKER - LENGTH = 13.5 CM</td>
			<td>endostall medical</td>
			<td>EJN-160-0155</td>
			<td>Retina isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril Syringe Filter</td>
			<td>AISIMO</td>
			<td>ASF33PS22S</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Genomic DNA Kit</td>
			<td>EcoSpin</td>
			<td>E1070</td>
			<td>gDNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>S01CA01</td>
			<td>anti-inflammatory / antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropamid (% 0.5 tropicamide)</td>
			<td>Bilim <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />la&#231; Sanayi ve Ticaret A.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq01v2.jpg" />.</td>
			<td>S01FA06</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbonuclease</td>
			<td>Accelagen</td>
			<td>N0103L</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscotears (carbomer 2 mg/g)</td>
			<td>Bausch+Lomb</td>
			<td>S01XA20</td>
			<td>lubricant eye drop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital droplet pcr method for the quantification of aav transduction efficiency in murine retina

Många retinal cellbiologiska laboratorier använder nu rutinmässigt Adeno-associerade virus (AAV) för genredigering och regulatoriska applikationer. Effektiviteten av AAV-transduktion är vanligtvis kritisk, vilket påverkar de övergripande experimentella resultaten. En av de viktigaste bestämningsfaktorerna för transduktionseffektivitet är serotypen eller varianten av AAV-vektorn. För närvarande finns olika konstgjorda AAV-serotyper och varianter med olika affiniteter för att vara värd för cellytans receptorer. För retinal genterapi resulterar detta i varierande grad av transduktion effektivitet för olika retinal celltyper. Dessutom kan injektionsvägen och kvaliteten på AAV-produktionen också påverka retinal AAV-transduktionseffektiviteten. Därför är det viktigt att jämföra effektiviteten hos olika varianter, partier och metoder. Metoden digital dropp PCR (dd-PCR) kvantifierar nukleinsyrorna med hög precision och gör det möjligt att utföra absolut kvantifiering av ett givet mål utan någon standard eller referens. Med hjälp av dd-PCR är det också möjligt att bedöma flyttningseffektiviteten hos AAV genom absolut kvantifiering av AAV-genomkopieringsnummer i en injicerad näthinna. Här tillhandahåller vi en enkel metod för att kvantifiera flyttningshastigheten för AAV i retinala celler med dd-PCR. Med mindre modifieringar kan denna metod också ligga till grund för kvantifiering av mitokondriellt DNA och bedöma effektiviteten av basredigering, kritisk för flera näthinnesjukdomar och genterapiapplikationer.

Småskalig AAV-produktion är en snabb och effektiv metod som ger vektorer för intravitreala injektioner (figur 1). Småskalig AAV-produktion ger vanligtvis titrar inom intervallet 1 x 1012 GC/ml vilket är tillräckligt för att upptäcka reporteruttryck i näthinnan (figur 2). Titering av AAV med dd-PCR ger konsekventa resultat. ITR2- och WPRE-specifika primers används rutinmässigt och startkoncentrationen för varje målmolekyl beräknades med d...

Watch this Scientific Journal Video about Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina at JoVE.com

Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina

Detta protokoll presenterar hur man kvantifieraR AAV-transduktion effektivitet i mus näthinnan med hjälp av digital dropp PCR (dd-PCR) tillsammans med småskaligA AAV produktion, intravitreal injektion, retinal imaging och retinal genomisk DNA isolering.

Digital Droplet PCR-metod för kvantifiering av AAV-transduktionseffektivitet i Murine Retina

Many retinal cell biology laboratories now routinely use Adeno-associated viruses (AAVs) for gene editing and regulatory applications. The efficiency of ...

I den här videon kommer vi att visa hur man kvantifierar AAV-transduktion i mushinnan med hjälp av digital dropp PCR-metod, som är extremt känslig och gör absolut kvantifiering av mål-DNA. Vi har utvecklat denna metod främst för stora AVV-konstruktioner som inte tillåter oss att använda en reportergen som CRISPR-baserade konstruktioner. Genom att använda denna metod kan vi helt enkelt kvantifiera flyttningshastigheten för AAV i näthinnan.Denna metod bygger på känslighet och absolut kvantifiering av den digitala droppen PCR och ger raka resultat. I den här videon kommer vi att visa hur man kvantifierar AAV-transduktion i mushinnan med hjälp av digital dropp PCR-metod, som är extremt känslig och gör absolut kvantifiering av mål-DNA. Vi har utvecklat denna metod främst för stora arealkonstruktioner som inte tillåter oss att använda en reportergen som CRISPR-baserade konstruktioner.Genom att använda denna metod kan vi helt enkelt kvantifiera flyttningshastigheten för AAV i näthinnan. Denna metod bygger på känslighet och absolut kvantifiering av de två dropp pcr och ger raka resultat. På grund av effektiviteten i den digitala dropp-PCR-metoden byter flera laboratorier redan från kvantitativ PCR i realtid till digital dropp PCR eller AAV-titrering.Denna metod kan också ge en grund för mitokondriell DNA kvantifiering i näthinnan, samt kontrollera effektiviteten av CRISPR-baserade mutation korrigering för genterapi i musen näthinnan. Förbered transfektblandningen med AAV-hjälpplasmid, AAV capsid plasmid, AAV-vektor och PI-lösning i fem milliliter efterfrågan. Tillsätt de fem milliliter beredda transfektblandningen i odlingsmedier.Inkubera transfekterade celler vid 37 grader celsius. Samla media på 48 till 60 timmar efter transfection. Smält mediet med DNA vid en slutlig koncentration av 250 enheter per milliliter i 30 minuter vid 37 grader Celsius och en centrifugera det vid 4 000 g fyra grader Celsius i 30 minuter.Förpa det regenererade cellulosamembranet med PBS. Filtrera mediet med 0,22 mikrometer sprutafilter i det förva borttröttade regenererade cellulosamembranet för 100 kilo Dalton. Centrifugera det regenererade cellulosamembranet vid 4 000 G fyra grader Celsius i 30 minuter och kassera mediet.Tvätta och centrifugera det regenererade cellulosamembranet med PBS som innehåller 0,001% pluronic F68 tre gånger vid 4000 G fyra grader Celsius i 30 minuter. Samla koncentrerade AAV från den övre delen av det regenererade cellulosamembranet och fördela för vidare användning. Här visade vi hur man gör en mindre AAV-produktion.Efter granskning av detta protokoll bör du kunna göra AVV som är tillräckligt för att se reporteruttrycket i näthinnan. Du kan också följa protokollet för digital PCR för att kunna titera producera AAV. Applicera en droppe av 0,5% tropikamid och 2,5%fenylefrinhydroklorid som innehåller ögondroppar före anestesi för att vidga pupillerna.Bedöva möss med isofluran och verifiera reflexerna. Applicera 0,3% tobramycin och 0, 1% dexametason sterilt oftalmisk lösning ögondroppe på varje öga före injektionsproceduren. Använd den kirurgiska kroken för att stabilisera det övre ögonlocket.Dra tillbaka något för att exponera den dorsala delen av ögat. Tejpa fast kroken på bandet för att hålla på plats. Ta bort bindhinnan med den böjda irissaxen för att exponera ögats sclera.Använd en färsk och steril 30G insulinspruta för att punktera sclera. För in mikrosprutens nål genom samma punktering med hjälp av mikromanipulatör. Placera nålens spets bakom objektivet i mitten av ögonkoppen.Injicera långsamt en mikrolitter AAV-lösning i ögats glaskropp. Låt nålen vara på plats i en minut och dra långsamt ut nålen. Applicera antiinflammatorisk och antibakteriell topikal gelbehandling som innehåller 0, 3% tobramycin och 0,1% dexametason på ögonkopp.Applicera en droppe 0,5% tropicamid. Och 2,5%fenylefrinhydroklorid som innehåller ögondroppar före anestesi för att vidga pupillerna. Applicera karbamid två milligram per gram utvärtes gel på ögonytan.Justera musstativet efter behov för att centrera musögat. Utför fundus och fluorescens imaging på båda ögonen för att följa TdTomato uttryck en vecka och två veckor efter intravitreal injektion. Avliva djuren med hjälp av koldioxidinandning före ingreppet.Flytta ögonbollen framåt med hjälp av en 13,5 centimeter splitter tång. Ta bort linsen tillsammans med den överblivna glaskroppen. Skär anslutningen av ögongloben till synnerven med en precisionsböjd tång och pressa försiktigt näthinnan med samma böjda tång.Isolera genomiskt DNA med ett kommersialiserat proteinas K smälta filmbaserat vävnadsgenomiskt DNA-kit. Smält näthinnan vid 55 grader Celsius 200 G i 30 minuter med proteinas K.Lyse näthinnan helt och följ tillverkarens sprotocol. I dessa protokoll har vi visat intravitreal injektion fundus florescence imaging, liksom näthinnan och genomisk DNA isolering.Dessa är mycket kritiska förfaranden för näthinnan, och genom att följa detta protokoll, du bör kunna injicera den producerade AAV och följa upp deras uttryck profil. Och sleva den transduktionseffektiviteten genom att kvantifiera AAV-genom i retinal genomiskt DNA. Här kan du se den grundläggande tillämpningen av digital dropp PCR, där du kan göra en absolut kvantifiering av AAV-genom som omvandlas i näthinnecellerna.Späd genomiska DNAs från injicerade näthinnor i 0,05% pluronic F 68 lösning för att nå en slutlig koncentration av ett nanogram per mikroliter för varje prov. Utför droppgenerering i en 20 mikroliters PCR-reaktionsblandning, inklusive ett nanogram genomiskt DNA 125 nanomolarer primers och 2X vintergrön supermix. Ladda provblandningen i mitten av patronen för droppgenerering.Tillsätt sedan 70 mikroliter droppgenereringsolja i den nedre raden av patron. Lägg packningen ovanpå patronen. Se till att det inte finns något mellanrum mellan packningen och patronen.Placera den sedan i droppgeneratorn. Ta försiktigt cirka 40 mikroliter droppar som genereras i den övre klockan. Tillsätt dropplösning till halvkjolad 96-Well PCR reaktionsplatta.Försegla PCR-plattan med en PCR-plattförsegling med hjälp av aluminiumtätningsfolie. Placera PCR-plattan i den värmetätade värmecyklisten 96-Well. Använd ddPCR-protokollet som anges i artikeln.Placera PCR-plattan i droppläsaren för att analysera data. Efter att ha tittat på den här videon bör du kunna utföra grundläggande digital PCR-teknik. Du kan också använda ansträngda celler med mindre mängder material, vilket är idealiskt för digital PCR-teknik.Du bör dock noggrant justera mål-DNA-mängden för att inte överskrida gränsen för digital dropp PCR. Här är flödesschemat för den experimentella proceduren. Vi utförde småskalig AAV-produktion, som följs av AAV titering.Sedan utförde vi intravitreal injektion. Efteråt kvantifierade vi fluorescerande intensitet genom fundus fluorescence imaging. Sedan isolerade musen näthinnor och extraheras genomiska DNA från näthinnor för ddPCR.Titering AAV är också avgörande för att kunna kvantifiera AAV-transduktion korrekt. ddPCR beror på generering av droppar som har utspädt mål AAV genom. Representativa ddPCR-resultat visar positiva och negativa droppar för AVV-genomet.Positivt över tröskelvärdet och negativt är under. Efter att ha multiplicerats med utspädningsfaktorerna konstaterades titer av AAV vara 10 till 12 i genomkopior per milliliter. För att korrekt kvantifiera AAV tranduktion effektivitet, flera näthinnor injicerades.Injicerade djur avbildades och fluorescens medelintensitet beräknades. Vid två veckors tidpunkt isolerades näthinnan. Och ddPCR utfördes med WPRE och 18 S primers.Fluorescens intensitet av AAV injicerade näthinnor var korrelerade med AAV genom beräkningar, visar kraften i metoden. Här har vi visat flera tekniker, inklusive småskaligA AAV preparat intravitreal injektion.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo elektroporering av utvecklingsländer Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Bedömning av Vascular Regeneration i CNS Använda musen Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventrikulär Viral Injektion av neonatal mus hjärnans för långlivade och Utbredd neuronal Transduktion

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik i Cone ljusmätare Axon terminaler i Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Okulär kinematik mätt In Vitro stimulering av kranialnerver i sköldpaddan

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

En volymetrisk metod för kvantifiering av Cerebral Vasospasm i en murin modell av subarachnoidalblödning

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupillär tvåfotoner in vivo-avbildning av musens näthinna

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

Två peelingmetoder för isolering av fotoreceptorcellfack i mus näthinnan för proteinanalys

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

In vivo Avläsningar av kärlskador i musens näthinna för att främja reproducerbarhet

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...