Name: digital droplet pcr method for the quantification of aav transduction efficiency in murine retina
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina at JoVE.com

Oezkan Keles, Josephine Jüttner ve Prof. Botond Roska'ya, Moleküler ve Klinik Oftalmoloji Enstitüsü Basel, Karmaşık Virüsler Platformu'na AAV üretimine verdikleri yardım ve destek için teşekkür ederiz. Ayrıca AAV8/BP2 suşu için Pennsylvania Üniversitesi Perelman Tıp Fakültesi'nden Prof. Jean Bennett'e teşekkür ederiz. Gebze Teknik Üniversitesi hayvan tesisinde hayvan çalışması yapılmaktadır. Bunun için Leyla Dikmetaş ve Prof. Dr. Uygar Halis Tazebay'a hayvancılığa yönelik teknik yardım ve destekleri için teşekkür ediyoruz. Dr. Fatma Özdemir'e de el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma TübİtAK, 118C226 ve 121N275 hibe numaraları ve Sabancı Üniversitesi Entegrasyon hibesi ile desteklenmektedir.

Tüm deneysel protokoller Sabancı Üniversitesi etik kurulu tarafından kabul edilmiş ve hayvanların araştırmada kullanımı için 'Vizyon ve Oftalmoloji Araştırma Derneği' açıklamasına uygun deneyler yapılmıştır.
1. Küçük ölçekli AAV üretimi12
<ol><li>Kültür HEK293T hücreleri kullanarak 15 cm plakalar tam 10 mL DMEM/%10 FBS%70-80 izdiah kadar.</li>
	<li>Transfeksiyon karışımını 5 mL DMEM'de 20 μg yardımcı plazmid (pHGT...

<ol>
	<li>Herrmann, A. K., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+dissection+of+AAV-host+interactions:+The+fast+and+the+curious.">High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).</li><li>Pillay, S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+determinants+of+adeno-associated+viral+vector+entry.">Host determinants of adeno-associated viral vector entry.</a> Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).</li><li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+AAV+tropism+in+the+nervous+system+with+natural+and+engineered+capsids.">Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids.</a> Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).</li><li>Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+capsid+structure+and+cell+interactions.">AAV capsid structure and cell interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).</li><li>Han, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+tropism+and+transduction+of+adeno-associated+virus+varies+by+serotype+and+route+of+delivery+(intravitreal,+subretinal,+or+suprachoroidal)+in+rats.">Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats.</a> Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).</li><li>Muraine, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+efficiency+of+adeno-associated+virus+serotypes+after+local+injection+in+mouse+and+human+skeletal+muscle.">Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle.</a> Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).</li><li>Cronin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+and+optogenetic+stimulation+of+retinal+bipolar+cells+by+a+synthetic+adeno-associated+virus+capsid+and+promoter.">Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).</li><li>Higashimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+woodchuck+hepatitis+virus+post-transcriptional+regulatory+element+reduces+readthrough+transcription+from+retroviral+vectors.">The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification.">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li><li>Albayrak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+quantification+of+proteins+and+mrna+in+single+mammalian+cells.">Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells.</a> Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR.">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Juttner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neuronal+and+glial+cell+types+with+synthetic+promoter+AAVs+in+mice,+non-human+primates+and+humans.">Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).</li><li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing.">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li><li>Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Hif1a+rescues+cone+degeneration+and+prevents+subretinal+neovascularization+in+a+model+of+chronic+hypoxia.">Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li><li>Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+tools+for+biological+image+analysis.">Open source tools for biological image analysis.</a> Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).</li><li>Parks, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ribosomal+RNA+alleles+are+conserved+and+exhibit+tissue-specific+expression.">Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression.</a> Science Advances. 4 (2), (2018).</li><li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences.">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li><li>Maclachlan, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+safety+evaluation+of+AAV2-sFLT01-+a+gene+therapy+for+age-related+macular+degeneration.">Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration.</a> Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).</li><li>Stieger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intact+rAAV+particles+up+to+6+years+after+successful+gene+transfer+in+the+retina+of+dogs+and+primates.">Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates.</a> Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+gene+editing+prevents+deafness+in+a+model+of+dominant+progressive+hearing+loss.">Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss.</a> Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).</li><li>Cox, D. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+editing+with+CRISPR-Cas13.">RNA editing with CRISPR-Cas13.</a> Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).</li></ol>

Bu protokolde farklı kapsid proteinleri olan iki AAV vektörü oluşturduk ve daha sonra bunları buna göre titrettirdik. Bu protokolün en önemli adımlarından biri, transdüksiyon12,13'densonra algılanabilir muhabir ifadesi verecek yeterli miktarda AAV üretmektir. 
AAV'lerin titeringi de intravitreal enjeksiyonlar için AAV dozajlarını ayarlamak için önemli bir faktördür. Bu önemli kriterlere ulaşıldıktan sonra, AAV...

Adeno ilişkili virüsler (AAV'ler) artık çeşitli retina gen tedavisi çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. AAV'ler, daha az immünojeniklik ve daha az genom entegrasyonu ile güvenli ve verimli bir gen iletim yolu sağlar. Hedef hücreye AAV girişi, hücre yüzeyindeki reseptörlerin ve yardımcı reseptörlerin bağlanmasını gerektiren endositoz yoluylagerçekleşir 1,2. Bu nedenle, farklı hücre tipleri için AAV'lerin transdüksiyon verimliliği esas olarak kapsid ve konak hücre reseptörleri ile etkileşimlerine bağlıdır. AAV'lerin serotipleri vardır ve her serotip farklı hücresel/doku trompilerine ve transdüksiyon verimliliklerine sahip olabilir. Ayrıca virüs kapsid kimyasal modifikasyonu, hibrid kapsid üretimi, peptit ekleme, kapsid karıştırma, yönlendirilmiş evrim ve rasyonel mutajensis3tarafından oluşturulan yapay AAV serotipleri ve varyantları vardır. Amino asit dizisindeki veya kapsid yapısındaki küçük değişiklikler bile konak hücre faktörleri ile etkileşimler üzerinde bir etkiye sahip olabilir ve farklı tromizmlere neden olabilir4. Kapsid varyantlarına ek olarak, enjeksiyon rotası ve AAV üretiminin toplu olarak parçalanması gibi diğer faktörler, AAV'lerin nöronal retinadaki transdüksiyon verimliliğini etkileyebilir. Bu nedenle, farklı varyantlar için transdüksiyon oranlarının karşılaştırılması için güvenilir yöntemler gereklidir.
AAV transdüksiyon verimliliğini belirleme yöntemlerinin çoğu muhabir gen ekspresyonine dayanır. Bunlar floresan görüntüleme, immünohistokimya, batı lekesi veya muhabir gen ürününün histokimyasal analizi5,6,7içerir. Bununla birlikte, AAV'lerin boyut kısıtlaması nedeniyle, transdüksiyon verimliliğini izlemek için muhabir genlerini dahil etmek her zaman mümkün değildir. Hibrid CMV enhancer / tavuk beta-actin veya Woodchuck hepatit transkripsiyonel düzenleyici eleman (WPRE) gibi güçlü promotörleri bir mRNA stabilizatör dizisi olarak kullanmak boyut problemini daha da karmaşık hale gelir8. Bu nedenle, enjekte edilen AAV'lerin transdüksiyon oranını daha doğrudan bir metodoloji ile tanımlamak da faydalı olacaktır.
Dijital damlacık PCR (dd-PCR), hedef DNA'yı dakika miktarda numuneden ölçmek için güçlü bir tekniktir. dd-PCR teknolojisi, hedef DNA ve PCR reaksiyon karışımının yağ damlacıkları ile kapsüllenmesine bağlıdır. Her dd-PCR reaksiyonı binlerce damlacık içerir. Her damlacık bağımsız bir PCR reaksiyon9olarak işlenir ve analiz edilir. Damlacıkların analizi, sadece Poisson algoritmasını kullanarak herhangi bir örnekteki hedef DNA moleküllerinin mutlak kopya sayısının hesaplanmasına olanak tanır. AAV'lerin transdüksiyon verimliliği nöronal retinadaki AAV genomlarının kopya sayısı ile ilişkili olduğundan, AAV genomlarını ölçmek için dd-PCR yöntemini kullandık.
Burada, retinal genomik DNA6,10'danAAV vektörlerinin transdüksiyon verimliliğini hesaplamak için bir dd-PCR metodolojisini açıklıyoruz. İlk olarak, tdTomato muhabirini ifade eden AAV'ler küçük ölçekli protokol kullanılarak oluşturulmuş ve dd-PCR yöntemi11ile titrilmiştir. İkincisi, AAV'ler intravitreal olarak nöronal retinaya enjekte edildi. Transdüksiyon verimliliğini göstermek için ilk olarak floresan mikroskopi ve ImageJ yazılımı kullanarak tdTomato ekspresyonını ölçtük. Bunu, DD-PCR kullanılarak enjekte edilen retinalarda AAV genomlarının nicelleştirilmesi için genomik DNA'nın izolasyonu izledi. tdTomato ekspresyon seviyelerinin dd-PCR ile ölçülen transdüklenmiş AAV genomları ile karşılaştırılması, dd-PCR yönteminin AAV vektörlerinin transdüksiyon verimliliğini doğru bir şekilde ölçtüğü göstermiştir. Protokollerimiz, AAV transdüksiyon verimliliklerini ölçmek için dd-PCR tabanlı bir metodolojinin ayrıntılı bir açıklamasını göstermiştir. Bu protokolde ayrıca intravitreal enjeksiyonlardan sonra sadece genomik DNA izolasyonu ve dd-PCR sonuçlarından sonra seyreltme faktörü kullanılarak transdüklenen mutlak AAV genom sayısını gösteriyoruz. Genel olarak, bu protokol retinadaki AAV vektörlerinin transdüksiyon verimliliğini ölçmek için muhabir ifadesine alternatif olacak güçlü bir yöntem sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-Well Semi-Skirted ddPCR plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6JRj mice strain</td>
			<td>Janvier</td>
			<td>C57BL/6JRj</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 gaskets</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863009</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864008</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604Q</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>L 1825</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generation oil eva green</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864006</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>p30-3306</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil seals for PX1 PCR Plate sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>320933</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>ADEKA <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />LA&#199; SANAY<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" /> VE T<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />CARET A.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq01v2.jpg" />.</td>
			<td>N01AB06</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector MM33</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>82-42-101-0000</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Phoenix Research Labs</td>
			<td>Micron IV</td>
			<td>Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>S01FB01</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofil Syringe 10 &#956;l</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle RN G36, 25 mm, PST 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF36BL-2</td>
			<td>Intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI-MAX</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>24765-1</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>PAN BIOTECH</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pHGT1-Adeno1</td>
			<td>PlasmidFactory</td>
			<td>PF1236</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24040032</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864034</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864001</td>
			<td>ddPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPLITTER FORCEP WATCHER 
			MAKER - LENGTH = 13.5 CM</td>
			<td>endostall medical</td>
			<td>EJN-160-0155</td>
			<td>Retina isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril Syringe Filter</td>
			<td>AISIMO</td>
			<td>ASF33PS22S</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Genomic DNA Kit</td>
			<td>EcoSpin</td>
			<td>E1070</td>
			<td>gDNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone)</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>S01CA01</td>
			<td>anti-inflammatory / antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropamid (% 0.5 tropicamide)</td>
			<td>Bilim <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq02v2.jpg" />la&#231; Sanayi ve Ticaret A.<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63038/63038eq01v2.jpg" />.</td>
			<td>S01FA06</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbonuclease</td>
			<td>Accelagen</td>
			<td>N0103L</td>
			<td>AAV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscotears (carbomer 2 mg/g)</td>
			<td>Bausch+Lomb</td>
			<td>S01XA20</td>
			<td>lubricant eye drop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital droplet pcr method for the quantification of aav transduction efficiency in murine retina

Birçok retina hücre biyolojisi laboratuvarı artık gen düzenleme ve düzenleyici uygulamalar için rutin olarak Adeno ile ilişkili virüsler (AAV' ler) kullanmaktadır. AAV transdüksiyonunun verimliliği genellikle kritiktir ve bu da genel deneysel sonuçları etkiler. Transdüksiyon verimliliği için ana belirleyicilerden biri AAV vektörün serotipi veya varyantıdır. Şu anda, hücre yüzey reseptörlerini barındırmak için farklı benzeşimlere sahip çeşitli yapay AAV serotipleri ve varyantları mevcuttur. Retina gen tedavisi için bu, farklı retina hücre tipleri için çeşitli derecelerde transdüksiyon verimliliği ile sonuçlanır. Ayrıca enjeksiyon yolu ve AAV üretiminin kalitesi retina AAV transdüksiyon verimliliklerini de etkileyebilir. Bu nedenle, farklı varyantların, partilerin ve metodolojilerin verimliliğini karşılaştırmak önemlidir. Dijital damlacık PCR (dd-PCR) yöntemi, nükleik asitleri yüksek hassasiyetle ölçerek belirli bir hedefin herhangi bir standart veya referans olmadan mutlak nicelleştirilmesini sağlar. DD-PCR kullanılarak, enjekte edilen bir retinadaki AAV genom kopya numaralarının mutlak nicelleştirilmesiyle AAV'lerin transdüksiyon verimliliklerini değerlendirmek de mümkündür. Burada, dd-PCR kullanarak retina hücrelerindeki AAV'lerin transdüksiyon oranını ölçmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Küçük değişikliklerle, bu metodoloji, mitokondriyal DNA'nın kopya sayısı nicelliğinin yanı sıra, birkaç retina hastalığı ve gen tedavisi uygulaması için kritik olan baz düzenlemenin verimliliğini değerlendirmenin de temelini oluşturabilir.

Küçük ölçekli AAV üretimi intravitreal enjeksiyonlar için vektör sağlayan hızlı ve verimli bir yöntemdir (Şekil 1). Küçük ölçekli AAV üretimi genellikle retinadaki muhabir ifadesini tespit etmek için yeterli olan 1 x10 12 GC/ml aralığında titre verir (Şekil 2). DD-PCR kullanılarak AAV'nin titerlenerek tutarlı sonuçlar verir. ITR2 ve WPRE'ye özgü astarlar rutin olarak kullanılır ve her hedef molekülün başlangıç konsa...

Watch this Scientific Journal Video about Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina at JoVE.com

Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina

Bu protokol, küçük ölçekli AAV üretimi, intravitreal enjeksiyon, retina görüntüleme ve retina genomik DNA izolasyonu ile birlikte dijital damlacık PCR (dd-PCR) kullanarak fare retinasında AAV transdüksiyon verimliliğinin nasıl ölçüleceğini sunar.

Murine Retina'da AAV Transdüksiyon Verimliliğinin Nicelleştirilmesi için Dijital Damlacık PCR Yöntemi

Many retinal cell biology laboratories now routinely use Adeno-associated viruses (AAVs) for gene editing and regulatory applications. The efficiency of ...

Bu videoda, son derece hassas olan ve hedef DNA'nın mutlak nicelliğini yapan dijital damlacık PCR yöntemini kullanarak fare retinasında AAV transdüksiyonunun nasıl ölçüleceğini göstereceğiz. Bu yöntemi esas olarak CRISPR tabanlı yapılar gibi bir muhabir geni kullanmamıza izin vermeyen büyük AVV yapıları için geliştirdik. Bu yöntemi kullanarak retinadaki AAV'lerin transdüksiyon oranını basitçe ölçebiliriz.Bu yöntem, dijital damlacık PCR'nin hassasiyetine ve mutlak nicelemesine dayanır ve doğrudan ileriye doğru sonuçlar verir. Bu videoda, son derece hassas olan ve hedef DNA'nın mutlak nicelliğini yapan dijital damlacık PCR yöntemini kullanarak fare retinasında AAV transdüksiyonunun nasıl ölçüleceğini göstereceğiz. Bu yöntemi esas olarak CRISPR tabanlı yapılar gibi bir muhabir geni kullanmamıza izin vermeyen büyük alan yapıları için geliştirdik.Bu yöntemi kullanarak retinadaki AAV'lerin transdüksiyon oranını basitçe ölçebiliriz. Bu yöntem, iki damlacık PCR'nin hassasiyetine ve mutlak nicelemesine dayanır ve doğrudan ileriye doğru sonuçlar verir. Dijital damlacık PCR metodolojisinin verimliliği nedeniyle, birkaç laboratuvar zaten nicel gerçek zamanlı PCR'den dijital damlacık PCR veya AAV titrating'e geçer.Bu yöntem ayrıca retinada mitokondriyal DNA nicelemesi için bir temel oluşturabilir ve fare retinasında gen tedavisi için CRISPR tabanlı mutasyon düzeltmesinin verimliliğini kontrol edebilir. Beş mililitrelik talepte AAV yardımcı plazmid, AAV kapsid plazmid, AAV vektör ve PI çözeltisi ile transfeksiyon karışımı hazırlayın. Hazırlanan beş mililitrelik transfeksiyon karışımını kültür ortamına ekleyin.Transkröte olmuş hücreleri 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Transfection sonrası 48 ila 60 saat içinde medyayı toplayın. Ortamı mililitre başına 250 birimlik son konsantrasyonda 37 santigrat derecede 30 dakika sindirin ve 30 dakika boyunca 4.000 g dört santigrat derecede bir santrifüjleyin.Yenilenmiş selüloz zarını PBS ile önceden ıslatın. 100 kilo Daltons için önceden ıslatılmış rejenere selüloz membranına 0,22 mikrometre şırınga filtresi ile ortamı filtreleyin. 4.000 G'de 4.000 G'de yenilenmiş selüloz zarını 30 dakika boyunca santrifüjleyin ve ortamı atın.Yenilenmiş selüloz membranı PBS ile yıkayın ve santrifüjleyin% 0.001 pluronic F68 30 dakika boyunca 4000 G dört santigrat derecede üç kez. Konsantre AAV'leri rejenere selüloz zarının üst kısmından toplayın ve daha fazla kullanım için tahsis edin. Burada daha küçük ölçekli bir AAV üretiminin nasıl yapılır olduğunu gösterdik.Bu protokolü inceledikten sonra retinadaki muhabir ifadesini görmek için yeterli olan AVV'leri yapabilmelisiniz. Ayrıca, dijital PCR'nin üretim AAV'lerini titretebilmesi için protokolü de takip edebilirsiniz. Göz bebeklerini genişletmek için anesteziden önce göz damlası içeren %0,5 tropikamid ve %2,5 fenilefrin hidroklorür damlası uygulayın.Fareleri izofluran ile uyuşturun ve refleksleri doğrulayın. Enjeksiyon işleminden önce her göze %0.3 tobramisin ve %0.1 deksametazon steril oftalmik çözelti göz damlası uygulayın. Üst göz kapağını stabilize etmek için cerrahi kancayı kullanın.Gözün sırt kısmını açığa çıkarmak için hafifçe geri çekin. Kancayı bantla bantla. Gözün sklerasını ortaya çıkarmak için kavisli iris makası ile konjonktivayı çıkarın.Sklerayı delmek için taze ve steril bir 30G insülin şırınnası kullanın. Mikro manipülatör kullanarak mikro şırınganın iğnesini aynı delinme yoluyla yerleştirin. İğnenin ucunu lensin arkasına göz kabının ortasına yerleştirin.Gözün vitreusuna yavaşça bir mikro litre AAV çözeltisi enjekte edin. İğneyi bir dakika yerinde bırakın ve iğneyi yavaşça çekin. Göz kabına %0,3 tobramycin ve %0,1 deksametazon içeren anti-enflamatuar ve anti-bakteriyel topikal jel tedavisi uygulayın.Bir damla 0.5% tropicamide uygulayın. Ve %2.5 fenilefrin hidroklorür göz bebeklerini genişletmek için anesteziden önce göz damlası içerir. Göz yüzeyine gram topikal jel başına iki miligram karbamid uygulayın.Fare gözünü ortalamak için fare standını gerektiği gibi ayarlayın. İntravitreal enjeksiyondan bir hafta ve iki hafta sonra TdTomato ekspresyonuna uymak için her iki gözde fundus ve floresan görüntüleme gerçekleştirin. İşlemden önce karbondioksit soluma kullanarak hayvanları ötenazi.Göz toplarını 13,5 santimetrelik ayırıcı forseps yardımıyla ileri kaydırın. Lensi arta kalan vitreus ile birlikte çıkarın. Göz küresinin optik sinire olan bağlantısını hassas kavisli bir önps ile kesin ve retinayı aynı kavisli tokalarla hafifçe sıkın.Genomik DNA'yı ticarileştirilmiş proteinaz K sindirme filmi tabanlı doku genomik DNA kiti ile izole edin. 55 santigrat derece 200 G'de retinayı proteinaz K.Lyse retina ile 30 dakika boyunca tamamen sindirin ve üreticinin sprotokol'ını takip edin. Bu protokollerde intravitreal enjeksiyon fundus florescence görüntülemenin yanı sıra retina ve genomik DNA izolasyonu gösterdik.Bunlar retina için çok kritik prosedürlerdir ve bu protokole uyarak, üretilen AAV'leri enjekte edebilmeli ve ifade profillerini takip edebilmelisiniz. Ve retina genomik DNA'sında AAV genomlarını ölçerek bu transdüksiyon verimliliğini kepçele. Burada, retina hücrelerinde transdüse olan AAV genomunun mutlak bir nicelliğini gerçekleştirebileceğiniz dijital damlacık PCR'nin temel uygulamasını görebilirsiniz.Enjekte edilen retinalardan genomik DNA'ları %0,05 pluronic F 68 çözeltisinde seyrelterek her örnek için mikroliter başına bir nanogramlık nihai konsantrasyona ulaşın. Bir nanogram genomik DNA 125 nanomolar astar ve 2X yaprak dökmeyen süper karışım dahil olmak üzere 20 mikrolitre PCR reaksiyon karışımında damlacık üretimi gerçekleştirin. Damlacık üretimi için numune karışımını kartuşun orta kısmına yükleyin.Daha sonra kartuşun alt sırasına 70 mikrolitre damlacık üretim yağı ekleyin. Contayı kartuşun üstüne koyun. Conta ile kartuş arasında boşluk olmadığından emin olun.Sonra damlacık jeneratörüne yerleştirin. Üst zilde oluşturulan yaklaşık 40 mikrolitre damlacıkları hafifçe alın. Yarı etekli 96-Well PCR reaksiyon plakasına damlacık çözeltisi ekleyin.Alüminyum sızdırmazlık folyosu kullanarak PCR plakasını bir PCR plaka sızdırmazlıklayıcı ile kapatın. PCR plakasını 96 Kuyulu ısı sızdırmaz termal çevrime yerleştirin. Makalede belirtilen ddPCR protokolünü kullanın.Verileri analiz etmek için PCR plakasını damlacık okuyucuya yerleştirin. Bu videoyu izledikten sonra temel dijital PCR tekniğini gerçekleştirebilmelisiniz. Ayrıca, dijital PCR tekniği için ideal olan küçük miktarda malzemeye sahip eforlu hücreleri de kullanabilirsiniz.Ancak, hedef DNA miktarını dijital damlacık PCR sınırını aşmayacak şekilde dikkatlice ayarlamalısınız. İşte deneysel prosedürün akış şeması. Küçük ölçekli AAV üretimi gerçekleştirdik, bunu AAV titering takip ediyor.Sonra intravitreal enjeksiyon yaptık. Daha sonra, floresan yoğunluğunu fundus floresan görüntüleme ile ölçtük. Daha sonra fare retinalarını izole etti ve ddPCR için retinalardan genomik DNA çıkardı.Titering AAV, AAV transdüksiyonun doğru bir şekilde ölçülebilmesi için de kritik öneme sahiptir. ddPCR, hedef AAV genomunun seyreltilmiş damlacıkların üretimine bağlıdır. Temsili ddPCR sonuçları AVV genom için pozitif ve negatif damlacıklar göstermektedir.Eşiğin üzerinde pozitif ve negatif aşağıdadır. Seyreltme faktörleri ile çoğaldıktan sonra, AAV'lerin titresinin mililitre başına genom kopyalarında 10 ila 12 olduğu bulunmuştur. AAV tranduction verimliliğini doğru bir şekilde ölçmek için birkaç retina enjekte edildi.Enjekte edilen hayvanlar görüntülendi ve floresan ortalama yoğunluğu hesaplandı. İki haftalık zaman noktasında retinalar izole edildi. Ve ddPCR WPRE ve 18 S astarlar kullanılarak gerçekleştirildi.AAV enjekte edilen retinaların floresan yoğunluğu, metodolojinin gücünü gösteren AAV genom hesaplamaları ile ilişkiliydi. Burada, küçük ölçekli AAV hazırlama intravitreal enjeksiyonu da dahil olmak üzere çeşitli teknikler gösterdik.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Fare Retina kullanma CNS&#39;deki Vasküler Rejenerasyon Değerlendirilmesi

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Oküler kinematik Vitro uyarılması kaplumbağa kranial sinirler tarafından ölçülen

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subaraknoid kanama, bir fare modeli serebral Vasospasm miktar hacimsel bir yöntemi

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

Protein Analizi için Fare Retinasındaki Fotoreseptör Hücre Bölmelerinin İzolasyonu İçin İki Peeling Yöntemi

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

İn vivo Tekrarlanabilirliği Artırmak için Fare Retinasında Vasküler Yaralanma Okumaları

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...