制备的单细胞悬浮液的质量对于任何单细胞组学方法获得高质量和可靠的结果都至关重要。该协议将向您展示如何快速，温和，稳健地从非常具有挑战性的组织中分离细胞。该协议的主要优点是简化的组织处理，能够在短时间内以完美的质量从大量样品中分离和分离细胞。
虽然这种方法是为小鼠和人类牙齿开发的，但它也可能应用于其他富含细胞外基质的组织，包括软骨，骨骼或致密结缔组织。从人类牙齿，特别是小鼠牙齿中分离牙髓的过程是手动具有挑战性的。我们建议大家在真正的实验开始之前进行测试。
首先，将安乐死的老鼠放在脑后，看着它头部的腹侧，使尾巴指向远处。使用小而锋利的剪刀，快速从下颌骨上取下皮肤，露出下颌弓，下颌骨每半部分之间的软组织和相邻的面部肌肉。为了从下颌骨的每一侧进行深切，首先沿着下颌骨的颊侧切入咬肌，直到颞下颌关节，然后沿着下颌骨每半部分的内部部分通过口腔的底部切割。
从口腔内外切除沿下颌骨直至颞下颌关节的所有肌肉和韧带。使用弯曲的尖端镊子抓住下颌骨并将其取下。然后用剪刀切开下颌骨，将解剖的下颌骨分成两半。
使用工业低棉绒擦拭，擦拭下颌骨每半部分剩余的软组织。在下颌骨的两个部分都清洁后，将它们放入预先准备好的带有冰冷HBSS的培养皿中。对于下颌门牙的解剖，切除所有三个臼齿的肺泡嵴，并在与第一和第二臼齿之间的位置相对应的位置横向裂开下颌弓。
小心地将门牙从牙槽的其余部分拉出。如果需要，用镊子和手术刀去除附着在门牙上的剩余骨头碎片。将解剖的门牙放入新鲜冰冷的HBSS中。
解剖感兴趣的组织后，将解剖的软组织放入一滴新鲜的冰冷的HBSS中，放在10厘米的培养皿中间，放在冰上。使用圆形10号手术刀刀片，将组织切成尽可能小的碎片。在液滴中间重新聚集组织块后，使用相同的手术刀刀片反复切割组织聚集体并重复此过程，直到材料充分切碎。
使用一毫升移液器吸头将切碎的组织块转移到先前制备的消化混合物中。然后将管子以60度的角度放置，并将速度设置为150至200 RPM，以确保管内恒定的悬浮运动并孵育15至20分钟。在孵育期间每三到四分钟后，使用一毫升移液器尖端大力滴定悬浮液以分解所有团块。
在孵育结束时，在最后一次滴定细胞悬浮液后，缓慢加入冰冷的洗涤溶液至最终体积为12毫升。在4摄氏度下以300倍G离心细胞悬浮液5分钟，然后用10毫升血清学移液管小心地除去上清液。将沉淀重悬于洗涤溶液中，以达到每微升700至1， 200个细胞的最终浓度。
将细胞悬浮液通过50微米的细胞过滤器，以除去剩余的团块或钙化组织碎片，并将管保持在冰上直至进一步处理。然后进行荧光激活的细胞分选，将细胞加载到准备好的管中。将试管装入细胞分选机，并设置严格的门控策略，以去除文本手稿中描述的细胞碎片，双层细胞和死细胞。
首先，使用CD45抗体染色和随后的FACS分析来阐明最终单细胞悬浮液中免疫细胞的数量。作为补充方法，分析了单细胞RNA测序数据中CD45阳性免疫细胞的总数。使用FACS，鉴定出14.44%CD45阳性细胞。
对单细胞RNA测序数据的分析显示，10.9%的表达CD45的细胞和单细胞RNA测序数据中细胞的减少可能是由于测序分析过程中的额外阈值引起的。关键是要快，并尽可能将这种组织或细胞保持在冰上。分离的细胞数量可能非常低，特别是在小鼠摩尔分离期间。
避免细胞损失。减少单细胞分离的时间对于所有单细胞实验的成功非常重要。这种特殊方法确实可以减少这一时间，并为小鼠和人类系统的高质量牙科细胞类型铺平道路。
